KR101600144B1 - 일주기 리듬 수면장애 및 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

일주기 리듬 수면장애 및 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포에서 리신 특이적 디메틸라아제 1(Lysine Specific Demethylase 1, LSD1)의 인산화 정도를 측정하고 비교하여 초기의 인산화 정도보다 증가된 것을 확인하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 또한, 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

일주기 리듬 수면장애 및 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제 스크리닝 방법{Screening methods for preventing or treating circadian rhythm sleep disorders and time difference maladjustment}
본 발명은 일주기 리듬 수면장애 및 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
일주기 시계는 일주기의 진동을 조절하고 많은 생리학적 및 행동적 시스템을 통제한다. 포유류에서는 뇌의 시각교차 상핵(suprachiasmatic nucleus, 이하 'SCN')에 위치한 분자 진동자(molecular oscillators)가 마스터 시계가 된다(Welsh et al., 2010). 그러나, 진동자는 일주기 리듬의 적당한 조절을 위하여 SCN 뿐만 아니라 많은 말초 조직에서도 위치한다(Mohawk et al., 2012; Bass, 2012; Marcheva et al., 2010). 주요 일주기 시스템은 시계 유전자들의 상호작용하는 전사-번역 피드백 루프로 이루어져 있다. CLOCK 과 BMAL1 은 기본 헬릭스-루프-헬릭스(bHLH)-PAS 전사 인사들이고, 헤테로다이머로서 E- box 요소에 바인딩함으로써 Period (Per1 와 Per2) 및 Cryptochrome (Cry1 와 Cry2) 유전자의 전사를 활성화시킨다 (Gekakis et al., 1998; Huang et al., 2012; King et al., 1997). CLOCK-BMAL1-중재된 전사는 차례로 PER 와 CRY 단백질에 의하여 억제되고, 이는 음성 피드백 루프를 형성한다(Kume et al., 1999; Sato et al., 2004; Shearman et al., 2000; Zheng et al., 1999). 이러한 주요 루프에 더하여, BMAL1 발현은 리드미컬하게 RORα와 REV-ERBα을 포함하는 오펀 핵 수용체(orphan nuclear receptors)에 의하여 조절된다(Akashi and Takumi, 2005; Cho et al., 2012; Solt et al., 2012; Ueda et al., 2002; Yang et al., 2006b).
크로마틴 구조의 역동적인 변화는 일주기 유전자 발현의 적당한 시기와 양에 중요하다. 리드미컬한 히스톤 변형은 Dbp, Per1 및 Per2 를 포함하는 여러 시계-조절 유전자의 주기적 전사와 관련된 것으로 보여진다(Etchegaray et al., 2003). CLOCK 자체는 일주기 기능에 요구되는 내인적 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제 활성을 가진다(Doi et al., 2006). SIRT1 히스톤 디메틸라아제는 CLOCK 에 바인딩하고 히스톤 뿐만 아니라 PER2 와 BMAL1의 탈아세틸화를 통제한다(Asher et al., 2008; Nakahata et al., 2008; Nakahata et al., 2009). 히스톤 아세틸화뿐만 아니라, 히스톤 메틸화 상태는 일주기 시계 조절에 관련된다. MLL1 히스톤 메틸트랜스퍼라아제는 특이적으로 일주기의 타겟 유전자의 전사적 활성을 위한 H3K4의 트리-메틸화(tri-methylation)를 촉진시킨다(Katada and Sassone-Corsi, 2010). EZH2 히스톤 메틸트랜스퍼라아제는 CLOCK-BMAL1 복합체와 상호작용을 하고, 전사적 감소를 위한 H3K27의 트리-메틸화를 촉매하는 Per 유전자의 프로모터에 리크루팅된다(Etchegaray et al., 2006). Jarid1a 히스톤 디메틸라아제는 히스톤 디아세틸라아제 1(HDAC1) 기능을 억제하고, 디메틸라아제와 독립적으로 CLOCK-BMAL1-중재의 전사를 향상시킨다(DiTacchio et al., 2011).
증가하는 많은 수의 보고들은 주요 시계 단백질을 포함하는 비-히스톤 단백질의 전사 후 변형이 히스톤 변형의 경우에서처럼 일주기 시계 유전자의 전사적 조절에 중요하다는 것을 가리킨다(Cardone et al., 2005). PKC α-결핍의 마우스의 표현형은 광-중재의 시계 재조정의 손상을 보여주므로, PKCα는 일주기 리듬와 가깝게 연결되어 있다(Jakubcakova et al., 2007). PKCα는 SCN 마스터 시계에서 매우 많이 발현되고, CLOCK 과 BMAL1을 포함하는 여러 주요 일주기 시계 단백질의 인산화에 책임이 있다(Van der Zee and Bult, 1995; Shim et al., 2007; Robles et al., 2010). PKCα-중재의 CLOCK의 인산화는 Per1 프로모터에 CLOCK의 리크루팅을 향상시키고, 위상 재조정에서 역할을 한다(Shim et al., 2007). 인산화뿐만 아니라, 시계 단백질의 유비퀴틴화가 중요하다. E3 유비퀴틴 리가아제-의존의 CRY의 유비퀴틴화는 일주기의 결정에 중요한 것으로 보여진다(Yoo et al., 2013).
LSD1(lysine specific demethylase 1)은 처음 보고된 히스톤 리신-특이적인 FAD+-의존의 디메틸라아제이다(Shi et al., 2004). LSD1은 H3K4me1/2의 디메틸화를 중재하는 CoREST (REST corepressor) 복합체의 일부로서 유전자의 억제 과정에 참여한다(Lee et al., 2005; Shi et al., 2005). 또한, LSD1은 H3K9me1/2의 디메틸화를 통하여 핵 수용체와 연관된 유전자의 활성 과정에 관련된다(Metzger et al., 2005; Wang et al., 2007; Wissmann et al., 2007). 최근 연구들은 LSD1은 정교한 조절을 위하여 히스톤뿐만 아니라 p53, Dnmt1과 같은 비-히스톤 단백질을 디메틸화시킨다고 보고하였다(Huang et al., 2007; Wang et al., 2009). 더욱이, LSD1은 일주기 시계에서 중요한 역할을 한다고 알려진 NAD+-의존의 디메틸라아제인 Sirt1과 상호작용을 한다(Mulligan et al., 2011).
전사인자들과 크로마틴 변형자들의 전사 후 변형이 크로마틴 상태를 변경시키거나 단백질-단백질 상호작용을 변경시킴으로써 단백질 기능을 조절할 수 있다는 것이 확실하더라도, 유기체 수준에서는 어떻게 생리학적 신호들이 크로마틴 변형자들의 in vivo 기능을 조절하는지는 여전히 알려져 있지 않다(Baek, 2011; Cheung et al., 2000; Strahl and Allis, 2000; Hogenesch and Ueda, 2011).
이에 본 발명자들은 PKCα-중재의 LSD1 인산화를 통하여 CLOCK:BMAL1-중재의 전사적인 조절을 가능하게 함으로서 PKC 신호 경로와 일주기 시계의 후생학적 조절 사이에 있는 LSD1의 중요한 역할을 조사하였고, LSD1의 인산화정도를 측정하여 일주기 리듬 수면장애 및 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제를 위한 스크리닝 방법을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
한국 특허출원 제 10-2001-7015764 호에서는 포유동물의 일주기 리듬을 변화시키는 시험 화합물을 확인하는 방법 등에 관하여 기재하고 있다. 한국 특허출원 제 10-2011-0076443 호에서는 인간 멜라놉신을 발현하는 형질전환 세포주, 이를 이용한 일주기 리듬 관련 일주기 분자 및 일주기 리듬에 영향을 주는 물질의 스크리닝 방법에 관하여 기재하고 있다.
본 발명의 목적은 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시차 부적응 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 제 1 의 형태는 (a) 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 세포의 리신 특이적 디메틸라아제 1(Lysine Specific Demethylase 1, 이하 'LSD1'이라 함)의 인산화 정도를 측정하는 단계; (c) 상기 세포에 잠재적 물질을 처리하는 단계; (d) 상기 세포에 포스포타아제 억제제를 처리하여 LSD1의 인산화를 유지하게 하는 단계; 및 (e) 상기 세포에서 (b)단계에서 측정된 인산화 정도보다 LSD1의 인산화가 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포는 동물 세포이고, 보다 구체적으로는, 상기 동물 세포는 마우스 배아의 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, 이하 'MEFs')이다. 또한, 본 발명에서 상기 세포는 뇌의 시각교차 상핵(suprachiasmatic nucleus, 이하 'SCN') 또는 간(liver)의 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 LSD1의 인산화의 증가를 측정하는 방법은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 키나아제 활성 어세이(Kinase Activity Assay), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전 또는 공동-면역침전 분석법(Immunoprecipitation or Coimmunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay) 또는 유세포분석법(Flow Cytometry)이다.
본 발명에서 상기 LSD1의 인산화는 단백질 키나아제 C(Protein Kinase C α, 이하 'PKCα'이라 함)에 의하고, 서열번호 15의 LSD1 단백질의 112번째인 세린에서 인산화된다. 또한, 상기 LSD1 인산화는 BMAL1 또는 CLOCK에 대한 결합 친화성이 증가한다.
본 발명의 제 2 의 형태는 (a) 세포를 배양하는 단계; (b) 상기 세포의 리신 특이적 디메틸라아제 1(Lysine Specific Demethylase 1, 이하 'LSD1'이라 함)의 인산화 정도를 측정하는 단계; (c) 상기 세포에 잠재적 물질을 처리하는 단계; (d) 상기 세포에 포스포타아제 억제제를 처리하여 LSD1의 인산화를 유지하게 하는 단계; 및 (e) 상기 세포에서 (b)단계에서 측정된 인산화 정도보다 LSD1의 인산화가 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 세포는 동물 세포이고, 보다 구체적으로는, 상기 동물 세포는 마우스 배아의 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, 이하 'MEFs')이다. 또한, 본 발명에서 상기 세포는 뇌의 시각교차 상핵(suprachiasmatic nucleus, 이하 'SCN') 또는 간(liver)의 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 LSD1의 인산화의 증가를 측정하는 방법은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 키나아제 활성 어세이(Kinase Activity Assay), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전 또는 공동-면역침전 분석법(Immunoprecipitation or Coimmunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay) 또는 유세포분석법(Flow Cytometry)이다.
본 발명에서 상기 LSD1의 인산화는 단백질 키나아제 C(Protein Kinase C α, 이하 'PKCα'이라 함)에 의하고, 서열번호 15의 LSD1 단백질의 112번째인 세린에서 인산화된다. 또한, 상기 LSD1 인산화는 BMAL1 또는 CLOCK에 대한 결합 친화성이 증가한다.
본 발명에 따르면, LSD1의 인산화 정도를 측정하여 일주기 리듬 수면장애 및 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제를 효과적으로 스크리닝할 수 있는 방법을 제시함으로써, 향후 유용성이 있는 일주기 리듬 수면장애 및 시차 부적응에 대한 예방 또는 치료제의 개발에 이용할 수 있다.
도 1은 LSD1과 상호작용하는 단백질을 나타낸다. Flag M2 아가로오스로 상호-면역 침전을 수행함으로써 Flag-LSD1을 발현하는 HEK293T 세포로부터 분리되었다. 붙어있는 단백질은 SDS-PAGE로 분석되고 LC-MS/MS 분석을 위하여 준비되었다.
도 2는 MEFs에서 PKCα와 내재적인 LSD1의 상호-면역침전을 보여준다.
도 3은 GST-LSD1과 in vitro-번역된 35S-메티오닌-표지된 PKCα를 사용하여 GST 풀-다운 어세이를 한 것이다.
도 4는 키나아제로서 세포 용해물에서 면역침전된 caPKCα(constitutively active form of PKCα) 또는 dnPCKα(kinase-deficient form of PKCα)을 사용하고, 기질로서 E. coli 에서 분리된 GST-LSD1 WT 또는 GST-MARKS (양성 대조군으로서)을 사용하는 in vitro 키나아제 어세이를 한 것이다. 반응 샘플은 10% SDS-PAGE로 분석되고, 인산화된 LSD1은 오토라이오그래피로 확인되었다.
도 5는 LSD1에 있는 6개의 추정되는 PKC 인산화 부위를 나타낸다.
도 6은 도 4에서처럼 in vitro 키나아제 어세이를 한 것이다. 6개의 추정되는 인산화 부위는 각각 알라닌으로 돌연변이가 되었고, 단지 S112A mutant가 in vitro 에서 PKCα-중재의 인산화가 없었음을 보여준다.
도 7은 닷 블랏 분석으로 phospho-LSD1 S112에 대하여 증가된 항체의 특이성을 보여준다.
도 8은 항-phospho-LSD1 항체로 면역블랏 분석을 했을 때, Go6976의 처리는 S112 부위에서 PMA-의존의 LSD1의 인산화를 없앴다는 것을 보여준다.
도 9는 마우스 간 추출물로 수행된 면역블랏 분석을 나타낸다. 마우스의 간은 DD 주기에서 4-시간 간격으로 모았다.
도 10은 총 LSD1 단백질과 인산화된 LSD1 단백질 수준을 면역블랏으로 분석한 것을 나타낸다. MEFs는 2시간 동안 덱사메타손(1 μM) 쇼크에 의하여 동일시되었고, 핵 추출물은 6시간 간격으로 모았다. 라민 A/C는 핵 단백질에 대한 대조군으로 사용되었다.
도 11은 주어진 시간에 덱사메타손을 처리한 후에 LSD1 WT 또는 LSD1 SA mutant로 재구성된 Lsd1 -/- MEFs에서의 Per2 mRNA 수준을 나타낸다.
도 12는 MEFs에서 BMAL1, CLOCK 또는 PER2와 내재적인 LSD1의 상호-면역침전 어세이를 한 것이다.
도 13과 도 14는 BMAL1(도 13) 또는 CLOCK(도 14)과 LSD1 WT 및 SA mutant의 상호-면역침전 어세이를 한 것이다.
도 15는 Lsd1 SA / SA 넉-인 마우스를 만들기 위한 전략을 나타낸다.
도 16은 세린에서 알라닌으로 대체되는 부위 특이적 돌연변이 유도를 나타낸다. 알라닌으로 대체되면 NaeI 부위가 방해된다. Lsd1 SA / SA 대립유전자가 아닌, WT 대립유전자는 Nae1 제한효소로 분해되었고, PCR 산물은 서열분석되었다.
도 17은 WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스의 SCN 조직에서 수행된 Lsd1 유전자의 in situ 혼성화(ISH) 분석을 나타낸다.
도 18은 WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스의 강인함(robustness)과 주기(period length)를 나타낸다. 강인함과 주기를 분석하기 위하여, DD 조건에서 매일 휠-러닝 활동에 대하여 cosinor 분석이 수행되었다. 모든 데이터는 평균±표준편차로 기재되었다(n=6-8, *=p< 0.05).
도 19는 WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스의 전형적인 더블플롯의 액토그램(actogram)을 나타낸다. 각각의 가로선은 48시간을 나타낸다. 두번째 24시간 주기는 처음의 오른쪽 아래에 있다. 세로막대는 휠-러닝 활동의 기간을 나타낸다. 동물들은 초기에 14일 동안 12시간 빛: 12시간 어둠의 빛-어둠 주기에서 키워졌고, 그 후 일정한 어둠으로 옮겨졌다.
도 20은 마우스 SCN 추출물에서 수행된 면역블랏 분석을 나타낸다. 마우스 SCN은 DD 주기에서 모아졌고, 각 CT 시기에 3마리의 마우스의 SCN이 면역블롯 분석을 위하여 모아졌다. DD는 지속적인 어둠(constant darkness); CT는 일주기의 시간(circadian time).
도 21은 4시간 간격으로 WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스에서 획득한 SCN 조직을 이용하여 Per1 , Per2 , Rev - erba 및 Bmal1 에 대한 정량적인 RT-PCR 분석을 나타낸다. 값을 표준화한 평균이 다양한 시점에서 표시되었다. 모든 데이터는 평균±표준편차로 나타냈다(각 시점에서 n=3-4, *=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001).
도 22는 SCN 익스플랜트 배양에서 LSD1 인산화는 지속된 Per2Luc 리듬에 요구된다는 것을 보여준다. SCN 익스플랜트 배양으로부터 방출되는 발광(luminescence)은 계속하여 10분 간격으로 모니터되었다. 두꺼운 파란색 선은 WT에서 Per2::루시퍼라아제 진동의 평균 프로필을 나타내고, 두꺼운 빨간색 선은 Lsd1 SA / SA 에서의 평균 프로필을 나타낸다. 가는 선들은 WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스에서 각각의 Per2::루시퍼라아제 진동의 프로필을 나타낸다. 그래프는 루시퍼라아제의 진폭과 주기를 그리고 있다. 데이터는 평균±표준편차로 나타냈다(WT 에 대하여 n=5, Lsd1 SA / SA 에 대하여 n=4, *= p<0.05).
도 23은 루시퍼라아제 리포터 어세이를 한 것이다. 두 개의 E- boxes 는 SV40 미니멀 프로모터-루시퍼라아제 리포터와 합쳐졌고, HEK293T 세포는 BMAL1, CLOCK, LSD1 WT 또는 SA mutant와 WT 또는 mutant E- box-루시퍼라아제 리포터로 형질전환되었다.
도 24는 도 23에서와 같이 Per2 프로모터-루시퍼라아제 리포터로 루시퍼라아제 리포터 어세이를 한 것이다.
도 25는 LSD1에 대한 항체로 WT or Lsd1 SA / SA MEFs 의 면역염색을 한 것이다.
도 26과 도 27은 정제된 GST-LSD1 WT 도는 SA 단백질을 이용하거나(도 26), 항-Flag 항체로 면역침전된 Flag-LSD1 WT 또는 SA 단백질을 이용하여(도 27) in vitro HDM 어세이를 수행한 것이다. 히스톤 H3K4me2 와 H3K4me3의 수준은 면역블롯 분석으로 확인되었다.
도 28과 도 29는 Per2 mRNA 수준이 LSD1 WT, LSD1 SA 또는 LSD1 SE로 재구성된 Lsd1 -/- MEFs(도 28)나, WT 와 Lsd1 SA / SA MEFs(도 29)에서 정량적인 RT-PCR로 측정된 것을 나타낸다(n=3, **=p<0.01, ***=p<0.001).
도 30과 도 31은 WT 와 Lsd1 SA / SA MEFs(도 30, n=3, **=p<0.01))나, Bmal1-넉아웃 MEFs 와 Lsd1-넉아웃 MEFs(도 31, each, n=3, *=p<0.05)에 있는 Per2 프로모터에서 ChIP 어세이가 수행된 것을 나타낸다. Per2 프로모터에 LSD1의 상대적인 양은 정량적인 PCR로 분석되었다.
도 32와 도 33은 면역블롯 분석은 마우스의 SCN 추출물로 수행되었다. WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스는 CT 14 (도 32) 또는 CT 22 (도 33)에서 30분의 빛 자극에 노출되었고, 30분 후에 희생되었다. 각 시점에서 3마리의 마우스로부터의 SCN이 면역블롯 분석을 위하여 모아졌다.
도 34와 35는 Per1 의 in situ 혼성화 분석은 SCN 조직으로 수행되었다. WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스는 CT 14 (도 34) 또는 CT 22 (도 35)에서 30분의 빛 자극에 노출되었고, 30분 후에 희생되었다. 막대는 X-레이 필름 컨택트 오토라이오그래프의 농도 분석에 의하여 mRNA 유도의 정량을 나타낸다. CT 15에서 빛에 노출되지 않은 WT 대조군에서 신호의 강도를 1로 셋팅하였다. 모든 데이터는 조건과 유전자형에 따라 3~4마리의 동물을 사용하여 평균±표준편차로 나타냈다(*=p<0.05, **=p<0.01).
도 36은 LSD1 WT 와 Lsd1 SA / SA MEFs를 사용한 Per1의 정량적인 RT-PCR 분석을 나타낸다(n=3, ***=p<0.001). MEFs는 24시간 동안 혈청에 굶주리게 하였고, 30분 동안 1 μM PMA로 처리되었다.
도 37은 WT 와 Lsd1 SA / SA SCN 조직을 사용하여 Per1 프로모터에서 ChIP 어세이가 수행한 것이다. WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스는 CT 14에서 30분-빛 자극에 노출되었고, 30분 뒤에 희생되었다. 각 시점에서 3마리 마우스의 SCN이 ChIP 어세이를 위하여 모아졌다. Per1 프로모터에서 LSD1의 상대적인 양은 정량적 PCR로 분석되었다(n=3, **=p<0.01).
도 38와 도 39는 이른 저녁(CT 14)이나 늦은 밤(CT 22)에 30분-빛 자극에 노출된 WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스를 나타낸다. 모든 데이터는 평균±표준편차로 나타냈다(*=p< 0.05, n=6-8). 오른쪽 패널은 WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스의 전형적인 더블플롯의 액토그램(actogram)을 나타낸다. 각각의 가로선은 48시간을 나타낸다. 두번째 24시간 주기는 처음의 오른쪽 아래에 있다. 세로막대는 휠-러닝 활동의 기간을 나타낸다. 동물들은 초기에 최소 2주일 동안 12시간 빛: 12시간 어둠의 주기에서 키워졌고, 그 후 일정한 어둠으로 옮겨졌다
도 40은 분자 시계의 진동과 일주기 시계의 위상 재구성에 중요한 역할을 하는 PKCα-유도의 LSD1 인산화에 대하여 도식화한 것이다. LSD1은 일주기적으로 PKCα에 의하여 인산화되고, 인산화된 LSD1은 E- box-중재의 전사적 활성을 촉진하기 위하여 CLOCK:BMAL1 헤테로다이머와 복합체를 형성한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험물질 및 방법
1. 실험동물
실험에서는 8주 내지 10주의 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었다. 마우스는 온도(22-23 ℃)와 빛(12 시간 빛; 12시간 어둠, 아침 8시에 조명을 밝힘)이 조절된 조건에서 키워졌다. 먹이와 물은 임의로 주어졌다. 어둠-어둠 조건을 위하여, 마우스는 조명을 끈 시간으로부터 정해진 기간 동안 일정한 어둠에 유지되었다. 모든 동물 실험은 서울대학교 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of Seoul National University)에 승인을 받았다.
2. 항체
상업적으로 이용가능한 항체들이 사용되었다: 항-PKCα (sc-8393)와 항-BMAL1 (sc-48790)은 Santa Cruz Biotechnology에서 구입되었고; 항-LSD1 (#2139), 항-PKCα(#2056), 항-H3K4me2 (#9725), 항-H3K4me3 (#9751), 및 항-H3 (#9715)은 Cell Signaling; 항-PER1 (ab3443), 항-CLOCK (ab3517), 및 항-LSD1 (ab17721)은 Abcam; 항-LSD1(NB-100-1762)은 NOVUS; 항-PER2 (PER21-A)은 alpha-diagnostics에서 구입되었다.
3. Lsd1 SA / SA 넉-인 마우스의 생산
세린 112를 알라닌으로 대체하는 것을 포함하는 타겟팅 벡터는 ES 세포(embryonic stem cells)로 전기천공법(eletroporation)에 의해 유입되었고, Lsd1 부위에 상동 재조합을 가진 양성 클론은 Puror 카세트를 제거하기 위하여 프로타민-cre 리컴비나아제(protamine-cre recombinase)를 발현하는 플라스미드와 함께 전기천공을 위하여 선택되었다. 이형접합체인 Lsd1 SA /+ ES 클론이 선택되었고, 마우스의 낭포(blastcysts)로 주입되어 키메라 마우스를 만들었고, 이는 돌연변이 대립유전자로 전달되었다. C57BL/6의 F7 세대는 대립유전자-특이적인 프라이머를 사용하여 꼬리 DNAs의 PCR 분석에 의하여 유전자형이 분석되었고, 돌연변이 마우스는 PCR 산물의 NaeI 소화와 시퀀싱에 의하여 확인되었다. 유전자형 분석을 위한 프라이머는 다음과 같다: 포워드(서열번호 1) 5'-CATGGAGACCGGAATAGCCGAG-3' 및 리버스(서열번호 2) 5'-TACACAACCCAGAAGCCGTC-3'.
4. 루시퍼라아제 어세이
HEK293T 세포는 인산칼슘(calcium phosphate) 방법으로 일시적으로 형질전환되었다. 루시퍼라아제 어세이를 위하여, 세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum)와 1% 항생제가 추가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 접종되었다. 세포는 여러 발현 구성물과 함께 루시퍼라아제 리포터와 베타-갈락토시다아제 발현 구성물로 형질전환되었다. 48시간의 형질전환 후에, 세포는 용해완충액(lysis buffer, Promega)으로 용해되고, 루시퍼라아제 활성이 측정되었다. 결과는 최소 3개의 독립적인 실험들로부터 얻었다.
5. Chip 어세이
Chip 어세이는 평균크기가 대략 300 내지 1000 bp를 가진 베어진 분절(fragment)을 가지고 기존에 기재된 대로 수행하였다(Kim et al., 2005). 리얼-타임 qPCR 분석을 위하여, 50㎕ DNA 추출물의 2㎕가 사용되었다. 사용된 프라이머들은 다음과 같다(Busino et al., 2007). Per2 포워드(서열번호 3): 5'-AGCAGCATCTTCATTGAGGAACCCGGG-3'; Per2 리버스(서열번호 4): 5'-CTCCGC TGTCACATAGTGGAAAACGTGAC-3'; Per1 포워드(서열번호 5): 5'-AGCCAGCCTGCACGTGTTCC-3'; 및 Per1 리버스(서열번호 6): 5'-CAGAGACAACCCCGCCCTGC-3'.
6. In vitro 키나아제 어세이
키나아제로서 HEK293T 세포의 용해물로부터 면역침전된 PKCα를 사용하고, 기질로서 정제된 GST-LSD1 단백질을 사용한 In vitro 키나아제 어세이는 기존에 기재된 대로 수행하였다(Lee et al., 2010). 간단히 설명하자면, PKCα와 GST-LSD1은 키나아제 어세이 버퍼(40 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10 mM 염화마그네슘, 1 mM DTT(Dithiothreitol, 다이시오트레이톨), 및 5μCi의 [γ-32P] ATP)에서 30분 동안 30℃에서 배양되었다. 반응은 5X 램리(Laemli) 샘플 버퍼를 더하고, 10분 동안 끓임으로써 멈췄다. 샘플들은 SDS-PAGE로 수행되고, 인산화된 LSD1은 오토라이오그래피로 확인되었다.
7. In vitro 히스톤 디메틸라아제 어세이
플래그-LSD1과 함께 24시간의 세포의 형질전환 후에, 형질전환된 세포는 24시간 동안 혈청의 추가없이(serum starvation) 동일시되도록 하였고, 그 후 90분 동안 10 mM의 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)로 처리되었다. 플래그-LSD1은 항-플래그 항체로 면역침전되었고, 씻어지고, HDM 버퍼(50mM 트리스-HCl, pH 8.5, 50mM 염화칼륨, 5mM 염화마그네슘, 및 1mM DTT)에서 HeLa 세포로부터 정제된 히스톤과 함께 4시간 동안 37℃에서 배양되었다. 반응물은 SDS-PAGE로 수행되었고, 히스톤 변형을 위하여 여러 항체들과 함께 면역블롯으로 분석되었다.
8. 정량적인 RT - PCR
풍부한 mRNA는 SYBR Green과 함께 ABI Prism 7500 시스템으로 감지되었다. 사용된 프라이머는 다음과 같다. Per1 포워드(서열번호 7): 5'-TTGATGTGACGGCGTGTGT-3'; Per1 리버스(서열번호 8): 5'-CCCAATCCATCCAGTTCTGAGA-3'; Per2 포워드(서열번호 9): 5'-GGGGTGGATTCGTCATTGAACTTG-3'; Per2 리버스(서열번호 10): 5'-AGGACATGGCACACTGGAAAGAG-3'; Rev - erb α 포워드(서열번호 11): 5'-CAGTCTCGGCAAGGCAACA-3'; Rev - erb α 리버스(서열번호 12): 5'-CTTCCCAGATCTCCTGCACAGT-3'; Bmal1 포워드(서열번호 13): 5'-AGTGCCACTGACTACCAAGA-3'; Bmal1 리버스(서열번호 14): 5'-TCCTGGACATTGCATTGCAT-3'.
9. In situ 혼성화
뇌는 드라이아이스로 차가워진 아이소펜탄에 얼리고, 저온유지장치(cryostat)에서 12 mm 두께로 잘랐다. 섹션들은 젤라틴이 코팅된 슬라이드에 녹으면서 붙여졌고, 4% 파라포름알데하디드에서 고정되었으며, 탈수되었다. 안티센스 cRNA 프로브는 리보프로브 시스템(Riboproe system, Promega)을 사용하는 in vitro 전사에 의하여 마우스 Per1(AF022992)의 nt 2141-2903과 마우스 Lsd1(NM_133872,2)의 nt 936-1236에 상응하는 cDNA를 포함하는 플라스미드로부터 준비되었다. 그 후, 섹션들은 1.2x106 cpm의 레이블된 RNA로 52℃에서 하룻밤동안 혼성화되었고, RNase A (20 mg/ml)가 처리된 4x SSC로 세 번 씻어졌다. 공기 중 건조를 한 후, 슬라이드는 Hyperfilm βmax (Amersham Biosciences)를 사용하여 10일 동안 오토라디오그래피를 진행하였다. 정량을 위하여, 14C-standard 가 함께 노출되었고, SCN에 있는 신호의 상대적인 강도가 정량되었다.
10. SCN 슬라이스 배양
Per2 Luc ; Lsd1 SA /+ 마우스를 얻기 위하여 Per2 Luc 마우스는 Lsd1 SA /+ 마우스와 교배하였다. 수컷 Per2 Luc ; Lsd1 SA /+ 마우스는 Per2 Luc ; Lsd1 SA / SA 또는 Per2 Luc ; Lsd1 +/+ 마우스를 생산하기 위하여 암컷 Lsd1 SA /+ 과 교배되었다. 신생아 유전자형은 꼬리 지노믹 DNA로부터 PCR에 의하여 출생 후 3 내지 5일에 결정되었다. 넉-인 마우스(출생 후 5 내지 7일)는 에테르로 마취되었고, 뇌는 즉시 5% 이산화탄소와 95% 산소로 거품이 있는 차가운 GBSS (Gey's balanced salt solution, 10 mM HEPES와 30 mM 포도당이 추가됨)로 옮겨졌다. 관상 뇌와 시상 뇌 슬라이스(400-mm 두께)는 바이브라톰(vibratome, Campden Instruments, Leicester, UK)으로 만들어졌다. 뇌 슬라이스는 SCN 밖의 부분의 포함을 최소화하기 위하여 입체현미경 하에서 조심스럽게 절개되었다. SCN 익스플랜트(explant)는 36℃에서 배양액(50% 최소필수배지, 25% HBSS(행크 밸런스 염용액), 25% 말(horse) 혈청, 36mM 포도당, 및 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신)을 떨어뜨린 멤브레인(membrane, Millicell-CM, Millipore, Billerica, MA)에서 유지되었다. 배지는 3일 마다 Millicell 배양 멤브레인을 위로 올리고, 신선한 배지를 포함하는 새로운 배양 접시로 옮겼다. 0.3 mM의 D-루시페린(Promega, Madison, WI)를 포함하는 신선한 배양액으로 갈아준 후, 슬라이스 배양을 포함하는 배양 접시는 봉인되고, 36℃, 5% 이산화탄소로 대기와 균형이 된 인큐베이터 안에서 유지되는 Kronos 광도계(ATTO, Japan)로 옮겨졌다. 각 접시로부터 생체발광은 계속하여 10분 간격으로 1분 동안 광전자 증배관(photomultiplier tube)으로 기록되었다. 배경값을 없앤 생체발광 프로필의 일주기의 최대와 최저는 Cluster-8 프로그램(Veldhuis and Johnson, 1986)으로 확인하였다. 최대와 최저의 클러스터 크기는 8로서 정의되었고, 유의미한 증가 또는 감소를 확인하기 위한 t-통계값은 2.0 이었다. 처음 4번의 일주기는 통계적 분석이 이루어졌다. 개체의 SCN 슬라이스의 주기와 주기변이는 각각 계속되는 최대치 사이에서 기간의 평균과 표준편자로서 정의되었다. 개체의 SCN 슬라이스의 진폭은 주위의 최대와 최저값 사이에서의 평균 차의 절반으로 정의되었다.
11. LSD1 인산화 확인 방법
LSD1의 인산화 여부를 확인하기 위하여 세포를 용해하였다. 이때 사용되는 용해 완충용액(lysis buffer: 200mM 염화나트륨, 50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5% NP-40)에 프로테이나아제(proteinase), 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitor: 1mM의 sodium fluoride, 1mM의 sodium orthovanadate, 100nM의 aprotinin, 10μM의 leupeptin)를 넣어준다. 이 완충용액를 이용하여 세포를 용해한 후에 LC MS/MS 혹은 ELISA 등을 이용하여 LSD1의 인산화 여부를 확인한다.
실시예 1. PKC α에 의한 LSD1 ( lysine specific demethylase 1)의 세린 112에서의 인산화.
각각 전사의 억제 또는 활성을 위하여 히스톤 H3의 리신 4나 리신 9에서 디메틸화시키는 LSD1의 중요성을 근거로(Shi et al., 2004; Metzger et al., 2005), 본 발명자들은 조절신호인자들이 역학적으로 LSD1 기능과 특이적인 바인딩 파트너의 선택을 조절하는지 조사하였다. 본 발명자들은 정교한 LSD1 기능에 책임이 있는 LSD1-바인딩 단백질을 찾기 위하여 플래그 에피토프-태그 전략을 사용하였고, 액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석기/질량 분석기(LC-MS/MS, liquid chromatography-tandem mass spectrometry/mass spectrometry)을 사용하였다. 본 발명자들은 기존에 LSD1의 바인딩 파트너로 보고된 CoREST(REST corepressor), BRAF35(BRCA2-associated factor 35), Hsp70.1 및 HDAC1/2를 검사하였다(Lee et al., 2005; Shi et al., 2005) (도 1). 예상외로, 본 발명자들은 LSD1과 상호작용하는 단백질(LSD1-interacting protein)로서 PKCα를 확인하였다(도 1). 내재적 발현 수준에서 LSD1과 PKCα 사이에서의 관련성은 상호 면역침전 어세이에 의하여 확인되었다(도 2). GST(Glutathion-S-transferase) 풀-다운 어세이는 in vitro에서 PKCα와 LSD1의 직접적인 관련성을 입증하였다(도 3).
LSD1-바인딩 단백질로서 PKCα의 예상외의 발견으로부터 PKCα가 LSD1의 직접적인 인산화에 책임이 있는지를 조사하였다. 따라서, 본 발명자들은 키나아제로서 세포 용해물(lysate)로부터 caPKCα(constitutively active form of PKCα) 또는 dnPKCα(kinase-defective form of PKCα)을 사용하는 in vitro 키나아제 어세이를 수행하였다. caPKCα 또는 dnPKCα 로부터 면역침전된 물질은 세균에서 발현되고 정제된 GST-LSD1 단백질과 배양되었다. 본 발명자들은 dnPKCα가 아닌, caPKCα가 정제된 LSD1 단백질을 인산화시킨다는 것을 밝혔다(도 4). LSD1에서 PKCα에 의하여 타겟되는 잠재적인 인산화 부위를 결정하기 위하여, 마우스 LSD1의 전체 길이의 아미노산 서열은 NetPhosK 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/)에 입력되었고, 6개의 PKC 인산화 부위가 예측되었다(도 5). 이러한 세린/트레오닌 잔기는 개별적으로 알라닌으로 변이된 것으로 발견하였다. In vitro 키나아제 어세이로부터 단지 세린 112가 알라닌(S112A)으로 대체되는 것이 PKCα에 의한 인산화가 없어진다는 것을 밝혔다(도 6). phospho-LSD1 S112에 대한 특이적인 항체는 phospho-LSD1 S112 펩타이드를 사용하여 제작되었다. 항체는 배타적으로 인산화된 펩타이드를 인식하였고, 닷 블랏 분석이 수행되었다(도 7). 항-phospho-LSD1 항체를 사용하여, 본 발명자들은 PKC 신호의 활성이나 억제가 S112 부위에서 LSD 인산화에 영향을 끼치는지 조사하였다. 항-phospho-LSD1 항체에 의한 면역블랏 분석은 PKC 활성제인 PMA(phorbol-12-myristate-13 acetate)의 처리가 내재적 LSD1의 인산화를 증가시키고, PKC 억제제인 Go6976의 처리가 PMA-유도의 LSD1 인산화를 없애는 것을 확인시켰다(도 8). 따라서, 이러한 데이터는 LSD1이 S112 부위에서 직접적으로 PKCα에 의하여 인산화됨을 증명하였다.
실시예 2. PKC α-의존적인 LSD1 인산화는 일주기로 진동한다.
축적된 보고들은 PKCα가 일주기 시스템을 조절하는데 관여한다고 나타낸다. PKCα를 포함하는 여러 PKC 아형들은 최상의 일주기의 심장 박동 조절 장치가 있는 SCN에서 강한 발현을 보인다(Van der Zee and Bult, 1995). 약학적 PKC 억제제와 활성제는 SCN 슬라이스 배양에서 신경 리듬의 위상 전진(phase advance)을 보이고(Schak and Harrington, 1999), PKC 신호의 유전적 폐기는 일주기 시계의 손상된 재조정을 이끈다(Jakubcakova et al., 2007). PKC 신호는 일주기 시계의 피드백 루프의 필수적인 부분을 형성한다고 제시한 보고들을 근거로 하여, 본 발명자들은 PKCα에 의한 LSD1의 인산화가 일주기 시계장치에 어떠한 역할을 하는지 조사하였다. LSD1 인산화는 일주기 리듬에 관여하는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 마우스의 간에서 LSD1 인산화의 일시적인 발현을 검사하였다. 면역블롯 분석은 LSD1 인산화가 마우스의 간에서 일주기의 시간(Circadian Time, CT) 8-12에서 최대로 축적되었다는 것을 보여 주었다(도 9). 그러나, 일주기를 근처로 4시간 간격으로 측정된 LSD1의 총 단백질 수준은 마우스의 간에서 변화되지 않았다. 본 발명자들은 LSD1 인산화가 마우스 간 조직의 경우처럼 마우스 배아의 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, 이하 'MEFs')에서 일주기 리듬을 보이는지 조사하기를 원했다. 따라서, 본 발명자들은 다양한 세포주에서 일주기의 유전자 전사를 당기는데 일반적으로 사용되는 합성 글루코코르티코이드 유사체인 덱사메타손(이하 'Dex')을 세포에 처리하였다. LSD1 인산화는 Dex가 간단히 처리된 MEFs에서 일주기의 진동을 이끌었다(도 10). LSD1 인산화가 일주기의 유전자 발현에 영향있는지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 Dex 처리 후에 Lsd1 -/- MEFs으로 재구성된 야생형 LSD1(LSD1 WT)과 돌연변이형 LSD1 S112A(LSD1 SA mutant)에서 Per2 mRNA 수준의 진동 패턴을 검사하였다. 흥미롭게도, Per2 mRNA 수준의 진동은 Lsd1 -/- MEFs 에서 줄어들었다. Lsd1 -/- MEFs으로 재구성된 LSDA SA mutant 가 아닌, LSD1 WT는 Dex 처리 후에 일주기로 Per2 mRNA 수준의 진동이 회복되었다(도 11). 이러한 결과는 PKCα에 의한 LSD1 인산화가 일주기의 유전자 발현의 조절에 책임이 있다는 것을 제안한다.
본 발명자들은 LSD1이 물리적으로 MEFs에 있는 내재적 발현 수준에 주요한 시계 부품과 관련되는지를 조사하였다. 상호 면역침전 어세이는 LSD1이 E box에 중재된 전사를 조절한다고 알려진 CLOCK, BMAL1 및 PER2와 같은 기본적인 시계 단백질(clock protein)에 붙는다는 것을 보여주었다. LSD1 인산화가 주요 시계 단백질에 결합 특이성을 변화시키는지 조사하기 위하여, 본 발명자들은 LSD1 WT 또는 LSD1 SA muant를 가지고 면역침전 어세이를 수행하였고, BMAL1 과 CLOCK 단백질에 대한 결합 특이성을 비교하였다. LSD1 WT는 BMAL1 과 CLOCK에 상당한 결합을 나타낸 반면, LSD1 SA mutant 는 BMAL1 과 CLOCK에 현저하게 감소된 결합을 보여주었다(도 13과 14). 이러한 결과는 LSD1 인산화는 BMAL1 과 CLOCK에 대한 LSD1의 결합 친화성을 증가시켰다는 것을 나타낸다.
실시예 3. Lsd1 SA / SA 넉-인 마우스의 일주기 리듬에서의 결함.
in vivo 에서 LSD1 인산화의 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 Lsd1 SA/SA 넉-인 마우스를 제작하였다. 마우스의 전체 게놈에서 LSD1의 세린 112를 알라닌으로 대체하기 위하여, 본 발명자들은 넉-인 변이체를 타겟하는 벡터를 디자인했고, 이 벡터는 처음 엑손(exon)에서 2개의 변이된 DNA 서열(AGC -> GCC)과 인트론(intron)에서 loxP-측면의 퓨로마이신 저항(Puror)의 카세트를 포함한다. 세린에서 알라닌으로의 대체는 부위 특이적 돌연변이 유도에 의하였고, 이는 NaeI 부위를 방해하였다(도 15). Lsd1 SA / SA 넉-인은 대립 유전자 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 산물의 NaeI의 분해와 시퀀싱에 의하여 확인되었다(도 16). Lsd1 SA / SA 마우스는 태어나서부터 성체가 될 때까지 정상이고, 대개 멘델의 분리의 법칙으로 기대되는 비율을 나타내는 생존력과 생식력에서 구별되지 않기 때문에, 치사는 타겟되는 Lsd1 SA / SA 대립유전자에 관계가 없었다(데이터 기재안함). Lsd1 SA / SA 마우스는 최소 7 세대 동안 C57BL/6 마우스와 역교배 되었다.
본 발명자들은 우선 in situ 혼성화에 의하여 SCN에서 Lsd1 발현여부를 검사하였다. WT와 Lsd1 SA / SA 마우스에서는 SCN에서 상당한 수준의 sd1 mRNA가 나타났다(도 17). LSD1 인산화가 마우스의 일주기 행동에 영향을 끼치는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 빛-어둠(light-dark, 이하 'LD') 또는 지속적인 어둠(constant darkness, 이하 'DD')조건에서 WT와 Lsd1 SA / SA 마우스의 휠-러닝 활동(wheel-running activity)을 비교하였다. LD 주기에서 일간 주기 운동과 하루에 움직인 거리는 두 유전자형에서 같았다(데이터 기재 안함). 그러나, DD 조건에서는, Lsd1 SA / SA 마우스는 유의미하게 WT 마우스보다 훨씬 적은 리듬을 보였다 (강인함(robustness): WT에서는 44.96±5.24%이고, Lsd1 SA / SA 마우스에서는 22.99±5.71%). 다만, 자유가동 기간에는 WT 마우스와 같았다(τ= WT에서는 23.89±0.04 hr 이고, Lsd1 SA / SA 마우스에서는 23.51±0.07 hr) (도 18). 비록 Lsd1 SA / SA 마우스가 그들의 표현형의 심각성에 따라 두 개의 분명한 부분모집단으로 나뉠 수 있었더라도(도 19), Lsd1 SA / SA 마우스의 강인함의 전체 평균은 WT 마우스에 비해 낮았다.
실시예 4. Lsd1 SA / SA 넉-인 마우스에서 SCN 에 있는 주요 시계 유전자의 리 듬미컬한 발현의 감소.
LSD1 인산화의 분명한 진동 패턴은 WT 마우스의 SCN 조직에서 관찰되었다. WT 마우스에서 인산화된 LSD1의 수준은 CLOCK:BMAL1에 중재된 전사가 활발한 때인 늦은 주간과 이른 야간에 높았다; 그것들은 CT 8 내지 12에서 높았고, CT 8에서 최고였으며, 그 후로 감소되었다(도 20). 그러나 Lsd1 SA / SA 마우스의 SCN에서는 LSD1의 인산화의 진동이 낮았다(도 20).
본 발명자들은 WT 와 Lsd1 SA / SA 마우스의 SCN 에서 다른 일주기에 있는 Per1, Per2, Rev - erb α 및 Bmal1과 같은 기본적인 시계 유전자의 일시적인 mRNA 발현 패턴을 비교하였다. Lsd1 SA / SA 마우스에 있는 Per1, Per2 및 Rev - erb α의 주기적인 축적은 WT 마우스의 SCN에 있는 것과 비교할 때, CT 4 내지 12에서 유의미하게 감소되었다(도 21). 프로모터에 기능적인 E- box를 가지고 있는 Per1, Per2 및 Rev - erb α에 비하여, RORE에 의한 전사의 조절을 받는 Bmal1 의 mRMA 수준은 변함이 없었다(Mukherji et al., 2013). 이러한 데이터는 E- box 에 의해 중재되는 주기 유전자의 전사가 Lsd1 SA / SA 마우스에서 특이적으로 감소되었다는 것을 가리킨다.
약해진 생제 리듬은 배양된 Lsd1 SA / SA SCN 익스플랜트(explants)에서 더욱더 증명되었다. SCN-자율적인 리듬의 실시간 모니터링을 위하여, 본 발명자들은 Per2 Luc 넉-인 마우스와 Lsd1 SA / SA 마우스를 교배하여 Per2 코딩서열(Per2 Luc )에 결합되는 루시퍼라아제(Luc) 리포터를 발현하는 Lsd1 SA / SA 마우스를 제작하였다(Yoo et al., 2004). 그 후, 본 발명자들은 SCN 익스플랜트에 Per2 Luc 리듬을 측정하였다. WT 대조군으로부터 결과와 비교할 때, Lsd1 SA / SA 마우스로부터의 SCN 익스플랜트 배양은 두 유전자형에서 유사한 주기길이에 불구하고 낮은 진폭을 가진 리듬을 보였다(도 22).
실시예 5. LSD1 인산화는 유전자 프로모터를 타겟하는 CLOCK : BMAL1 헤테 로다이머의 리크루팅에 요구된다.
주기적 행동에서 심각한 변화와 주기 유전자의 축소된 발현을 보여주는 Bmal1 또는 Clock-부족의 마우스(Bunger et al., 2000; Debruyne et al., 2006)에서 주기 유전자 발현과 손상된 주기적 행동의 자율화와 같은 Lsd1 SA / SA 마우스의 공통적인 표현형의 발견으로부터 LSD1이 공활성인자(co-activator)로서 E-box에 의한 전자를 조절함으로서 일주기장치의 새로운 성분으로서 기능하는지 조사하였다. E- box 부위에 CLOCK:BMAL1 헤테로다이머의 리크루팅과 차후의 전사적 활성이 분자적 시계에 대한 주기의 반복에 요구되기 때문에 (Ripperger and Schibler, 2006), 본 발명자들은 CLOCK:BMAL1에 의한 전사에 LSD1 인산화의 관여를 확신하기 위한 실험을 수행하였다. LSD1 WT의 도입은 두 개의 기능적인 E-box 부위를 포함하는 리포터와 함께 CLOCK:BMAL1이 유도된 루시퍼라아제 활성을 증가시켰고(Son et al., 2008), 반면 LSD1 SA mutant는 LSD1 WT에 비하여 감소된 루시퍼라아제 활성을 보였다(도 23). CLOCK:BMAL1에 중재되는 전사에서 LSD1의 효과가 주요 뉴클레오타이드의 결실(CACGTG -> CACTG)에 의하여 E- box 부위가 기능하지 않는 곳에서는 없어졌다(도 23). E- box에 의한 전사적 활성기능과 함께, LSD1 SA mutant가 아닌, LSD1 WT 에서는 기능하는 E- box 부위를 포함하는 Per2 프로모터 루시퍼라아제 활성이 증가되었다(도 24).
CLOCK:BMAL1에 의한 전사의 공활성인자로서 행동하는 LSD1 SA mutant의 실패가 세포적 위치에서의 변화로 기인한다는 가능성을 없애기 위하여, 본 발명자들은 LSD1 WT 와 SA mutant의 세포적 위치를 확인하였다. WT MEFs에서 LSD1의 핵 위치는 Lsd1 SA / SA MEFs에서 변화되지 않았고, 이는 LSD1 인산화가 LSD1의 세포적 위치를 변화시키지 않는다는 것을 가리킨다(도 25). 다음으로, 본 발명자는 비록 S112 인산화 부위가 효소활성에 중요한 LSD1 의 아민 옥시다아제 부근에 위치하지 않더라도(Forneris et al., 2007; Yang et al., 2006a), LSD1의 PKCα-의존의 인산화가 내부의 히스톤 디메틸라아제(histone demethylase, 이하 'HDM')의 활성에 영향을 주는지 여부의 가능성을 조사하였다. 본 발명자들은 정제된 효소들(도 26) 또는 면역침전된 물질(도 27)로 in vitro HDM 활성 어세이를 수행하였고, LSD1 WT 와 LSD1 SA mutant는 H3K4me2에 있는 비교할만한 HDM 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 LSD1의 PKCα-의존의 인산화는 내재의 HDM 활성을 변경하지 않는다는 것을 말한다.
동시에, CLOCK:BMAL1 타겟 유전자인 Per2의 mRNA 수준은 LSD1 WT, SA mutant 또는 LSD1의 계속적인 인산화를 흉내내는 SE mutant로 재구성된 Lsd1 -/- MEFs에서 관찰되었다. LSD1 WT 또는 SE mutant와 비교할 때, SA mutant 는 유의미하게 Per2 mRNA 수준이 줄어들었다(도 28). 정량적인 RT-PCR의 분석으로부터 Lsd1 SA/SA MEFs 에서의 Per2 mRNA 수준이 WT MEFs 에서의 수준보다 낮았음을 확인하였다(도 29). Lsd1 SA / SA MEFs 에서의 Per2 mRNA 수준의 감소와 일치하게도, ChIP 어세이는 Per2 프로모터에 LSD1의 리크루팅이 Lsd1 SA / SA MEFs에서 낮았음을 보여주었다(도 30). Per2 프로모터에 LSD1의 리크루팅이 CLOCK:BMAL1 전사인사에 의존적인지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 Bmal1 -/- MEFs 과 Lsd1 -/- MEFs을 사용하여 ChIP 어세이를 하였다. Bmal1 -/- MEFs에서, LSD1은 Per2 프로모터에 리크루팅되지 않았고(도 31), 이는 LSD1 리크루팅은 CLOCK:BMAL1 헤테로다이머에 의하여 중재된다는 것을 가리킨다. 따라서, 본 발명자들의 발견은 LSD1 인산화가 주요 시계 유전자의 CLOCK:BMAL1-의존적 전사에서 중심적 역할을 하고, 그것은 자유가동 조건에서 정상적인 행동의 리듬을 만든다는 것을 증명한 것이다.
실시예 6. Lsd1 SA / SA 넉-인 마우스에서 일주기 시계에서의 손상된 위상 재조정.
빛-어둠 주기의 속도를 유지하기 위하여, SCN 마스터 시계는 빛 자극에 의하여 재조정될 수 있다(Bae et al., 2001). 초저녁 동안 인지된 광 파장은 일주기의 페이스메이커의 위상를 늦추는 반면, 늦은 저녁에 주어진 파장은 그것을 향상시킨다. PKC 경로는 SCN 중앙의 시계의 빛의 부유를 중재하기 때문에(Jakubcakova et al., 2007; Shim et al., 2007), 본 발명자들은 LSD1 인산화가 광신호에 의한 위상 재조정에 요구되는지를 조사하였다. 본 발명자들은 광 파장이 CT 14와 CT 22에서 SCN 조직에서의 LSD1 인산화 수준을 변경시키는지 확인하였다. 면역블랏 분석으로부터 S112 부위에서 LSD1 인산화가 PKCα 유도와 함께 CT 14(도 32)와 CT 22(도 33) 모두에서 광 파장에 의하여 급속히 증가되었다는 것을 확인하였다. Per1 유도가 빛-유도된 위상 재조정에 요구된다는 것을 고려할 때(Bae et al., 2001; Albrecht et al., 1997; Albrecht et al., 2001), Lsd1 SA / SA 마우스에서 LSD1 인산화의 부족은 광 파장에 의하여 유의미하게 SCN에서의 Per1 mRNA과 단백질의 유도를 감소시켰다는 것이 주목할 만하다(도 32 내지 35; **=p<0.01, *=p<0.05).
PKC 신호 경로의 활성화는 배양된 섬유아세포에서 분자적 시계에서의 위상 재조정 신호의 하나로써 기능한다고 보여지므로(Shim et al., 2007; Akashi and Nishida, 2000), 본 발명자들은 PMA에 MEFs를 처리하였다. SCN 데이터와 일치하게도, Per1 의 유도는 WT MEFs에 비하여 LSD1 SA / SA MEFs 에서 감소되었다(도 36). 더욱이, 본 발명자들은 LSD1 이 전사적 활성을 위하여 Per1 프로모터에 리크루팅되는지 조사하기 위하여 ChIP 어세이를 수행하였다. CT 14에서 SCN 조직에 광 파장을 주는 것은 Per1 프로모터에 LSD1의 리크루팅을 유도하였다(도 37). 따라서, 이러한 데이터는 LSD1 인산화가 광신호에 의한 위상 재조정에 중요하다는 것을 가리킨다.
실시예 7. Lsd1 SA / SA 넉-인 마우스에서 빛 자극에 의한 손상된 행동 적응.
Lsd1 SA / SA 마우스에서 광자극(photic stimuli)에 의한 Per1 발현의 감소된 유도에 따라, Lsd1 SA / SA 마우스는 휠-러닝 활동에서 보여진 것처럼 빛 자극에 대한 손상된 행동 적응을 보였다(도 38 내지 39). Lsd1 SA / SA 마우스는 짧은 야간 광 파장에 비정상적인 행동 반응을 보였고, 이는 내재적 시계의 위상을 재조정할 수 있다. 정량적인 차이는 위상의 지연(delay)과 전진(advance)의 양으로 관찰되었다. CT 14에서 광 파장에 노출시키는 것은 WT 동물에서 위상의 지연을 야기시키는 반면(-113.91±5.49 min), Lsd1 SA / SA 마우스는 손상된 지연을 보였다(-66.16±17.63 min, *=p<0.05) (도 38). 광 파장 뒤에 리드미컬한 것의 위상의 차이는 WT와 Lsd1 SA / SA 마우스에서 위상 이상이 통계학적으로 유의미하였음을 보여준다(*=p<0.05). 동일한 동물에 CT 22에서의 광 파장의 노출은 WT 마우스에서 상당한 위상의 전진을 이끌었으나(34.94±8.68 min), Lsd1 SA / SA 마우스에서는 그렇지 않았다(-28.52±24.07 min, *=p<0.05) (도 39). 이러한 발견은 LSD1 인산화가 중요한 일주기 시계의 위상 재조정을 중재한다는 것을 총괄적으로 증명한 것이다.
<110> SNU R&DB Foundation <120> Drug screening methods for treating insomnia and jetlag <130> PN130039 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genotyping <400> 1 catggagacc ggaatagccg ag 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Genotyping <400> 2 tacacaaccc agaagccgtc 20 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per2 forward <400> 3 agcagcatct tcattgagga acccggg 27 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per2 reverse <400> 4 ctccgctgtc acatagtgga aaacgtgac 29 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per1 forward <400> 5 agccagcctg cacgtgttcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per1 reverse <400> 6 cagagacaac cccgccctgc 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per1 forward <400> 7 ttgatgtgac ggcgtgtgt 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Per1 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Pro Ala Gly Leu Thr Gly Pro 35 40 45 Thr Asp Met Ala Thr Gly Ala Ala Gly Glu Arg Thr Pro Arg Lys Lys 50 55 60 Glu Pro Pro Arg Ala Ser Pro Pro Gly Gly Leu Ala Glu Pro Pro Gly 65 70 75 80 Ser Ala Gly Pro Gln Ala Gly Pro Thr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Thr 85 90 95 Pro Met Glu Thr Gly Ile Ala Glu Thr Pro Glu Gly Arg Arg Thr Ser 100 105 110 Arg Arg Lys Arg Ala Lys Val Glu Tyr Arg Glu Met Asp Glu Ser Leu 115 120 125 Ala Asn Leu Ser Glu Asp Glu Tyr Tyr Ser Glu Glu Glu Arg Asn Ala 130 135 140 Lys Ala Glu Lys Glu Lys Lys Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gln Ala Pro 145 150 155 160 Pro Glu Glu Glu Asn Glu Ser Glu Pro Glu Glu Pro Ser Gly Val Glu 165 170 175 Gly Ala Ala Phe Gln Ser Arg Leu Pro His Asp Arg Met Thr Ser Gln 180 185 190 Glu Ala Ala Cys Phe Pro Asp Ile Ile Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln 195 200 205 Lys Val Phe Leu Phe Ile Arg Asn Arg Thr Leu Gln Leu Trp Leu Asp 210 215 220 Asn Pro Lys Ile Gln Leu Thr Phe Glu Ala Thr Leu Gln Gln Leu Glu 225 230 235 240 Ala Pro Tyr Asn Ser Asp Thr Val Leu Val His Arg Val His Ser Tyr 245 250 255 Leu Glu Arg His Gly Leu Ile Asn Phe Gly Ile Tyr Lys Arg Ile Lys 260 265 270 Pro Leu Pro Ile Lys Lys Thr Gly Lys Val Ile Ile Ile Gly Ser Gly 275 280 285 Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Arg Gln Leu Gln Ser Phe Gly Met Asp 290 295 300 Val Thr Leu Leu Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg Val Ala Thr 305 310 315 320 Phe Arg Lys Gly Asn Tyr Val Ala Asp Leu Gly Ala Met Val Val Thr 325 330 335 Gly Leu Gly Gly Asn Pro Met Ala Val Val Ser Lys Gln Val Asn Met 340 345 350 Glu Leu Ala Lys Ile Lys Gln Lys Cys Pro Leu Tyr Glu Ala Asn Gly 355 360 365 Gln Ala Val Pro Lys Glu Lys Asp Glu Met Val Glu Gln Glu Phe Asn 370 375 380 Arg Leu Leu Glu Ala Thr Ser Tyr Leu Ser His Gln Leu Asp Phe Asn 385 390 395 400 Val Leu Asn Asn Lys Pro Val Ser Leu Gly Gln Ala Leu Glu Val Val 405 410 415 Ile Gln Leu Gln Glu Lys His Val Lys Asp Glu Gln Ile Glu His Trp 420 425 430 Lys Lys Ile Val Lys Thr Gln Glu Glu Leu Lys Glu Leu Leu Asn Lys 435 440 445 Met Val Asn Leu Lys Glu Lys Ile Lys Glu Leu His Gln Gln Tyr Lys 450 455 460 Glu Ala Ser Glu Val Lys Pro Pro Arg Asp Ile Thr Ala Glu Phe Leu 465 470 475 480 Val Lys Ser Lys His Arg Asp Leu Thr Ala Leu Cys Lys Glu Tyr Asp 485 490 495 Glu Leu Ala Glu Thr Gln Gly Lys Leu Glu Glu Lys Leu Gln Glu Leu 500 505 510 Glu Ala Asn Pro Pro Ser Asp Val Tyr Leu Ser Ser Arg Asp Arg Gln 515 520 525 Ile Leu Asp Trp His Phe Ala Asn Leu Glu Phe Ala Asn Ala Thr Pro 530 535 540 Leu Ser Thr Leu Ser Leu Lys His Trp Asp Gln Asp Asp Asp Phe Glu 545 550 555 560 Phe Thr Gly Ser His Leu Thr Val Arg Asn Gly Tyr Ser Cys Val Pro 565 570 575 Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Asp Ile Lys Leu Asn Thr Ala Val Arg 580 585 590 Gln Val Arg Tyr Thr Ala Ser Gly Cys Glu Val Ile Ala Val Asn Thr 595 600 605 Arg Ser Thr Ser Gln Thr Phe Ile Tyr Lys Cys Asp Ala Val Leu Cys 610 615 620 Thr Leu Pro Leu Gly Val Leu Lys Gln Gln Pro Pro Ala Val Gln Phe 625 630 635 640 Val Pro Pro Leu Pro Glu Trp Lys Thr Ser Ala Val Gln Arg Met Gly 645 650 655 Phe Gly Asn Leu Asn Lys Val Val Leu Cys Phe Asp Arg Val Phe Trp 660 665 670 Asp Pro Ser Val Asn Leu Phe Gly His Val Gly Ser Thr Thr Ala Ser 675 680 685 Arg Gly Glu Leu Phe Leu Phe Trp Asn Leu Tyr Lys Ala Pro Ile Leu 690 695 700 Leu Ala Leu Val Ala Gly Glu Ala Ala Gly Ile Met Glu Asn Ile Ser 705 710 715 720 Asp Asp Val Ile Val Gly Arg Cys Leu Ala Ile Leu Lys Gly Ile Phe 725 730 735 Gly Ser Ser Ala Val Pro Gln Pro Lys Glu Thr Val Val Ser Arg Trp 740 745 750 Arg Ala Asp Pro Trp Ala Arg Gly Ser Tyr Ser Tyr Val Ala Ala Gly 755 760 765 Ser Ser Gly Asn Asp Tyr Asp Leu Met Ala Gln Pro Ile Thr Pro Gly 770 775 780 Pro Ser Ile Pro Gly Ala Pro Gln Pro Ile Pro Arg Leu Phe Phe Ala 785 790 795 800 Gly Glu His Thr Ile Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Val His Gly Ala Leu 805 810 815 Leu Ser Gly Leu Arg Glu Ala Gly Arg Ile Ala Asp Gln Phe Leu Gly 820 825 830 Ala Met Tyr Thr Leu Pro Arg Gln Ala Thr Pro Gly Val Pro Ala Gln 835 840 845 Gln Ser Pro Ser Met 850 <210> 16 <211> 2562 <212> DNA <213> Mouse (C57BL/6J) <400> 16 atgttgtctg ggaagaaggc ggcggcggcg gcagcggcag cggcggcggc ggcggctgct 60 gggaccgagg ccgggtccgg ggcggcgggc ggtgccgaga acggctctga ggtggccgcg 120 ccgcccgcgg gcctgacggg ccccaccgac atggctacgg gggcggcggg cgagcgcact 180 ccccgaaaga aggagcctcc gcgggcctcg ccgcccgggg gcctagccga gccgccgggg 240 tctgctgggc cccaggcggg gcccacagcc gggcccggct ccgcgacgcc catggagacc 300 ggaatagccg agaccccgga gggccgacgg accagccggc gcaagcgggc caaggtagaa 360 tacagagaaa tggatgaaag cttggccaac ctctcagaag atgaatatta ttcggaagaa 420 gaaagaaatg ctaaagcaga gaaggaaaag aagcttcccc caccacctcc tcaagcccca 480 cctgaggaag aaaatgaaag tgagccggaa gagccgtctg gtgtggaggg tgcagctttt 540 caaagccgac ttccccatga ccgaatgacc tctcaggaag cagcctgttt cccagacatc 600 atcagtgggc ctcagcagac acagaaggtt tttctgttca tcaggaatcg cacattgcag 660 ttatggctgg acaacccaaa gatccagctg acgtttgaag ccactctcca gcagctggaa 720 gcgccttaca acagcgatac tgtgcttgtc caccgagttc acagttactt agagcgccat 780 ggtcttatca acttcggcat ctacaagagg ataaaaccct taccaattaa aaagacagga 840 aaggtgatta ttataggttc aggtgtttct ggcttggcag cagctcgaca gctacagagt 900 tttgggatgg atgtcacact tctggaagcc agggatcgag taggtggacg agttgctaca 960 tttcgaaaag gaaactatgt agctgatctt ggcgccatgg ttgtaacagg tcttggaggg 1020 aatcccatgg ctgtcgtcag caaacaagta aatatggaac tggccaagat caagcaaaaa 1080 tgcccacttt atgaagccaa tggacaagct gttccaaaag aaaaagatga aatggtagaa 1140 caagaattta accggttgct agaagccact tcttacctta gtcaccagtt agacttcaac 1200 gtcctcaata ataaacctgt atcccttggc caggcattgg aggttgtcat tcagctgcaa 1260 gaaaagcatg tcaaagatga gcagattgaa cattggaaga agatagtgaa aactcaggag 1320 gagttgaaag agcttcttaa taagatggta aatttgaagg agaaaattaa agagctccat 1380 cagcaataca aagaagcttc agaagtgaag ccgcccagag atatcacagc cgagttcctg 1440 gtgaagagca agcacaggga cctgactgcc ctctgcaagg aatatgatga attagctgaa 1500 acacaaggaa agctagaaga aaaacttcaa gaattggaag ccaatccccc aagtgatgta 1560 tacctctcat caagagacag acaaatactt gactggcatt ttgcaaatct tgaatttgcc 1620 aacgccacac ctctctctac cctctctctt aaacattggg atcaggatga tgactttgag 1680 tttactggaa gccacctgac agtaaggaat ggctactcat gtgtgcctgt ggctttagct 1740 gaaggcttgg acattaaact gaacacagca gtgcggcagg ttcgctacac agcctcagga 1800 tgtgaagtga ttgctgtgaa cacacgttcc acaagtcaaa cctttattta taagtgtgat 1860 gcagttctct gtacacttcc tttgggagtg ttgaagcagc agccaccagc tgttcagttt 1920 gtgccacctc ttcctgagtg gaaaacatct gcagtccaaa ggatgggatt tggcaacctt 1980 aacaaggtgg tgttatgctt tgaccgtgtg ttctgggacc caagtgtcaa tttgtttggg 2040 cacgttggca gtacaactgc tagcaggggt gagctcttcc tcttctggaa cctatataaa 2100 gctccaatac tattggccct ggtagcagga gaagctgctg gcattatgga gaacattagt 2160 gatgatgtga ttgtcggccg gtgcctggcc attctcaaag ggatttttgg cagcagtgca 2220 gtcccacagc ccaaggaaac tgtggtatct cgttggcgtg ctgatccgtg ggcccggggc 2280 tcctattctt atgtggctgc aggatcctct ggaaatgact atgatttaat ggctcagccg 2340 atcactcctg gcccctcaat tccaggtgcc ccacagccaa tcccaagact cttctttgct 2400 ggagaacaca caatccggaa ctacccagct acagtccatg gtgctctgtt gagtgggctt 2460 cgagaagcag gaaggattgc cgaccagttt ttgggagcca tgtacacttt gcctcgtcag 2520 gccacaccag gtgtccctgc acagcagtcc ccaagtatgt ga 2562

Claims (16)

  1. (a) 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 세포의 리신 특이적 디메틸라아제 1(Lysine Specific Demethylase 1, 이하 'LSD1'이라 함)의 인산화 정도를 측정하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 상기 세포에 스크리닝을 하기 위한 후보 물질을 처리하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 후보 물질이 처리된 세포에 포스포타아제 억제제를 처리하여 LSD1의 인산화를 유지하게 하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 포스포타아제 억제제가 처리된 세포에서 (b)단계에서 측정된 인산화 정도보다 LSD1의 인산화가 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 세포는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 동물 세포는 마우스 배아의 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, 이하 'MEFs')인 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 세포는 뇌의 시각교차 상핵(suprachiasmatic nucleus, 이하 'SCN') 또는 간(liver)의 세포인 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 LSD1의 인산화의 증가를 측정하는 방법은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 키나아제 활성 어세이(Kinase Activity Assay), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전 또는 공동-면역침전 분석법(Immunoprecipitation or Coimmunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay) 및 유세포분석법(Flow Cytometry)으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 LSD1의 인산화는 단백질 키나아제 C(Protein Kinase C α, 이하 'PKCα'이라 함)에 의한 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 LSD1의 인산화는 서열번호 15의 LSD1 단백질의 112번째인 세린에서 인산화되는 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 LSD1 인산화는 BMAL1 또는 CLOCK에 대한 결합 친화성이 증가하는 것을 특징으로 하는 일주기 리듬 수면장애 치료 또는 예방용 물질의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  9. (a) 세포를 배양하는 단계;
    (b) 상기 세포의 리신 특이적 디메틸라아제 1(Lysine Specific Demethylase 1, 이하 'LSD1'이라 함)의 인산화 정도를 측정하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 상기 세포에 스크리닝을 하기 위한 후보 물질을 처리하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 후보 물질이 처리된 세포에 포스포타아제 억제제를 처리하여 LSD1의 인산화를 유지하게 하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 포스포타아제 억제제가 처리된 세포에서 (b)단계에서 측정된 인산화 정도보다 LSD1의 인산화가 증가된 것을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 세포는 동물 세포인 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 동물 세포는 마우스 배아의 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, 이하 'MEFs')인 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 세포는 뇌의 시각교차 상핵(suprachiasmatic nucleus, 이하 'SCN') 또는 간(liver)의 세포인 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 LSD1의 인산화의 증가를 측정하는 방법은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 키나아제 활성 어세이(Kinase Activity Assay), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역침전 또는 공동-면역침전 분석법(Immunoprecipitation or Coimmunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay) 및 유세포분석법(Flow Cytometry)으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 LSD1의 인산화는 단백질 키나아제 C(Protein Kinase C α, 이하 'PKCα'이라 함)에 의한 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  15. 제 9 항에 있어서, 상기 LSD1의 인산화는 서열번호 15의 LSD1 단백질의 112번째인 세린에서 인산화되는 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
  16. 제 9 항에 있어서, 상기 LSD1 인산화는 BMAL1 또는 CLOCK에 대한 결합 친화성이 증가하는 것을 특징으로 하는 시차 부적응 예방 또는 치료제의 in vitro에서의 스크리닝 방법.
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