JP2009538597A - 光誘導性周期的発現遺伝子及び体内時計システムに影響を与える物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
哺乳動物の視交叉上核において発現される、例えば、Dusp4, Snk, Slc39a6 及びNnatのような、光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルを検出することを含む、生物の体内時計システムに影響を与える物質のスクリーニング方法。
Description
本発明は、光誘導性周期的発現遺伝子及び体内時計システムに影響を与える物質のスクリーニング方法に関するものである。
行動及び代謝経路を含む殆どの生物学的な現象は、概日的（即ち、約２４時間周期）である体内時計（生体時計）システムによって支配されており、外部からの光照射によって初期化（リセット）される。
従って、生体時計は、入力、振動及び出力の３つの経路から成り立っている。振動によって約２４時間周期のシグナルが生じ、そのシグナルは入力経路を介する光刺激によってリセットされ、出力経路を介して生物学的現象を調節する。
マイクロアレイを用いて周期的に発現する遺伝子を同定する試みが行われ、視交叉上核（SCN）のみならず末梢組織においても数百個の遺伝子が同定され、哺乳動物ではＳＣＮに限らず多くの種類の細胞において体内時計システムが存在することが示された（１０）。これらの周期的に発現する遺伝子の正確な機能は不明である。それらは遺伝子は振動及び出力システムに関与していると考えられている。
本発明者等は高カバー率遺伝子発現プロファイル解析法（HiCEP）と呼ばれる新たな遺伝子発現プロファイル法を開発した（３）。HiCEP法は増幅断片長多型（AFLP）に基づく方法であって、一つの細胞当り一個の転写産物コピーを検出できる程に感度が高く、公知の遺伝子に加えて未知の遺伝子を検出することが可能である（１４）。該方法は偽陽性の割合が４％未満という特徴をも有する（１４）。それまでのAFLPベースの方法では多くの偽陽性が生じて、プロファイル解析に使用するには不適切であった。HiCEPでは偽陽性の割合が低くピーク数が減少するので、ピークを特異的な遺伝子に明確に帰属させることが可能となる。我々は４ヌクレオチド認識酵素である、MspI及びMseIを使用することによって、８５．６％の推定カバー率が得られた。更に、この解析にはほんの少量の出発材料が必要とされるのみであり、遺伝子発現における１．２倍という差異を区別することが出来る。この方法によって、転写調節因子をコードする殆どの遺伝子が含まれるような少量及び中程度の発現転写産物を正確に記述することが可能である。ハイブリダゼーションに基づく方法はこの目的に対して理想的ではないので、この点はこの方法のもう一つの利点となる。本発明において、HiCEPを用いた光照射直後におけるマウスの解析（分析）を示す。
哺乳動物におけるPeriod(Per)1及びPer2のような振動における幾つかのキーとなる遺伝子は光誘導性であるので、入力及び振動メカニズムには幾つかのオーバーラップする点があることが考えられる（１）。そこで、本発明者等は振動自体における幾つかの遺伝子の同定を試みた（１２）。
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概日時計のリセット機構における分子的基礎を解明する目的で、本発明者は、新たな遺伝子発現プロファイル解析法を用いて、マスター時計が存在するSCNにおける光誘導性転写産物の単離を試みた。８７個の転写産物を同定し、その内の６０個のクローニングに成功し、それらが光誘導性であることを確認した。この６０個の中の６個は光誘導性であることが既に知られており、１７個は公的機関においてタンパク質コード転写産物として登録されているが、光誘導性であることは知られていない。殆どの転写産物において誘導は主観的夜（subjective night）特異的である。興味深いことに、６個の転写産物はSCNにおいて概日様式で周期的な発現を示した。
本発明は上記の知見に基づきなされたものである。即ち、本発明は以下の方法に係る。
１．光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルを検出することを含む、生物の体内時計システムに影響を与える物質のスクリーニング方法。
２．物質の存在下における、光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルの変化に基づく、上記１記載のスクリーニング方法。
３．哺乳動物の視交叉上核において遺伝子が発現される、上記１記載のスクリーニング方法。
４．遺伝子が、Dusp4, Snk, Slc39a6 及びNnat並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、上記１記載のスクリーニング方法。
５．(a) 脳の視交叉上核由来の培養細胞株をスクリーニングする物質と接触させ；
(b)遺伝子の発現レベルの変化を検出し；及び、
(c)該遺伝子の発現レベルに影響を与える物質を選択する、工程を含む、上記１記載のスクリーニング方法。
６．遺伝子の転写産物の量を測定することによって該遺伝子の発現レベルを検出する、上記１〜５のいずれか一つに記載のスクリーニング方法。
７．遺伝子の転写産物の量がHiCEP法による遺伝子発現プロファイルを得ることによって測定される、上記６に記載のスクリーニング方法。
８．遺伝子の転写産物の量がPCRによって測定される、上記６に記載のスクリーニング方法。
９．遺伝子の転写産物が以下の群から選択される塩基配列：
(a)配列番号１，２，３及び４の夫々で示される塩基配列；
(b) (a)のいずれか一つの塩基配列の相補塩基配列と厳格な条件下でハイブリダイズする塩基配列；
(c) (a)のいずれか一つの塩基配列と８０％以上のホモロジーを有する塩基配列、を含む上記７又は８記載のスクリーニング方法。
１０．遺伝子にコードされる一つ又はそれ以上のタンパク質又はその一部の量を測定することによって該遺伝子の発現レベルを検出する、上記１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
１１．タンパク質が以下の群：
(a) Dusp4, Snk, Slc39a6, 及びNnatの夫々にコードされるタンパク質；
(b) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列において一つ又は数個のアミノ酸が置換若しくは交換、欠失又は付加されているタンパク質；
(c) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列から成るタンパク質、から選択される上記５記載のスクリーニング方法。
１．光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルを検出することを含む、生物の体内時計システムに影響を与える物質のスクリーニング方法。
２．物質の存在下における、光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルの変化に基づく、上記１記載のスクリーニング方法。
３．哺乳動物の視交叉上核において遺伝子が発現される、上記１記載のスクリーニング方法。
４．遺伝子が、Dusp4, Snk, Slc39a6 及びNnat並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、上記１記載のスクリーニング方法。
５．(a) 脳の視交叉上核由来の培養細胞株をスクリーニングする物質と接触させ；
(b)遺伝子の発現レベルの変化を検出し；及び、
(c)該遺伝子の発現レベルに影響を与える物質を選択する、工程を含む、上記１記載のスクリーニング方法。
６．遺伝子の転写産物の量を測定することによって該遺伝子の発現レベルを検出する、上記１〜５のいずれか一つに記載のスクリーニング方法。
７．遺伝子の転写産物の量がHiCEP法による遺伝子発現プロファイルを得ることによって測定される、上記６に記載のスクリーニング方法。
８．遺伝子の転写産物の量がPCRによって測定される、上記６に記載のスクリーニング方法。
９．遺伝子の転写産物が以下の群から選択される塩基配列：
(a)配列番号１，２，３及び４の夫々で示される塩基配列；
(b) (a)のいずれか一つの塩基配列の相補塩基配列と厳格な条件下でハイブリダイズする塩基配列；
(c) (a)のいずれか一つの塩基配列と８０％以上のホモロジーを有する塩基配列、を含む上記７又は８記載のスクリーニング方法。
１０．遺伝子にコードされる一つ又はそれ以上のタンパク質又はその一部の量を測定することによって該遺伝子の発現レベルを検出する、上記１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
１１．タンパク質が以下の群：
(a) Dusp4, Snk, Slc39a6, 及びNnatの夫々にコードされるタンパク質；
(b) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列において一つ又は数個のアミノ酸が置換若しくは交換、欠失又は付加されているタンパク質；
(c) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列から成るタンパク質、から選択される上記５記載のスクリーニング方法。
本発明方法でスクリーニングされる物質は、マウス及びヒトを含む哺乳動物のような生物の体内時計システムにいずれかの方法又は様式で影響を与えることができ、例えば、該システムの調節、制御、脱制御、促進、及び遅延のような、該システムにおける任意の変化を引き起こすか、又は誘導するものである。
従って、本発明のスクリーニング方法は、スクリーニングの対象となる物質の存在及び不在下で比較することにより、光誘導性であって概日様式で周期的に発現する一つ又はそれ以上の遺伝子の発現レベルにおける増加又は減少のような変化、又は発現プロファイルにおける変化に基づくことが、好ましく、且つ、有利である。
光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子は、例えば、マウス及びヒトを含む哺乳動物のような生物の脳の視交叉上核で発現する。
上記遺伝子の代表例は、Dusp4, Snk, Slc39a6, 及びNnat、並びにそれらの任意の組み合わせから成る群から選択されるものである。
Dusp4（Gene ID:319520（NM_176933）はMAPキナーゼホスファターゼ−２とも呼ばれ、MAPKシグナル経路におけるホスファターゼであり、活性型MAPKを不活性化する役割を担う。MAPK（ERK,JNK、p38）シグナル経路は概日リズムの環境リズムへの同調における役割を担い、MAPK活性の振動はSCNにおいて示唆されていた（８）。光照射への応答として活性化した後のMAPKの経路の不活性化も光照射によって誘導される。更に、Dusp4の概日特性はSCNにおけるMAPK活性の周期的特性に因るものである。
Snk (GeneID:20620（NM_152804.1）は血清ショックによって誘導されるキナーゼとして単離された（１３）。この遺伝子はポロキナーゼファミリーに属して細胞周期の調節における役割を担い、哺乳動物において４つのパラログが同定されている。更に、神経細胞においてその機能が示唆されている。D Pak及びその同僚が、シナプスにおけるスパイン（Spine）関連Rap GTP活性化タンパク質（SPAR）の結合パートナーとしてSNKを同定した（９）。SPAR分子のSNKによるリン酸化によってユビキチン経路におけるSPARの分解が誘導され、SPARによって構成されるスパイン構造も同様に分解される。上記引用文献の著者はSNKとSPARとの相互作用によってシナプスにおけるスパイン構造の再構成が生じると示唆している。
Slc39a6 (GeneID:319520（NM_139143.1）はZincトランスポーター（輸送体）のサブファミリーに属する（１５）が、その正確な機能は不明である。その属の幾つかのメンバーの周期的発現は報告されている（１０）。
Nnat (GeneID:18111（NM_180960）は１００個未満のアミノ酸から成る小分子であり、それに対する５種類のアルターナティブな転写産物が同定されている（５）。この遺伝子は神経発生において一過的に発現するインプリンティング遺伝子であるが、その正確な機能は不明である。興味深いことに、膀胱がん関連タンパク質（Blcap）遺伝子のイントロンのアンチセンス鎖に存在している（２）。BlcapはSCNにおいてNnat転写産物と同じ相で周期的に発現している（１０）。SCN特異的な周期的発現をアンチセンスプローブのみならずセンスプローブによっても検出した為に、偶然にも、in situハイブリダイゼーション実験において、Blcap転写産物の周期的発現を認めた。ニューロナチンとBlcapの発現相には約２時間の差が観察され、転写レベルでの遺伝子発現調節が示唆された。
遺伝子発現の検出は、インビボ、例えば、生体内、又は、インビトロ、例えば、培養細胞において実施することが出来る。
従って、本発明方法によってスクリーニング又は試験される物質は、任意の公知方法によって試験動物に投与されるか、又は、当該細胞株の培養に使用する培地に添加又は補充することができる。
例えば、本発明方法は、脳の視交叉上核に由来する培養細胞株をスクリーニングする物質と接触させ；遺伝子の発現レベルの変化を検出し；及び、該遺伝子の発現レベル又は発現プロファイルに影響を与える物質を選択する、工程を含むことができる。
光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルの検出は、転写及び翻訳のような該遺伝子の発現の任意の段階で実施することが出来る。
上記遺伝子の検出は、検出方法又はメカニズムに応じて、定量的、半定量的又は定性的であってもよい。
光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルの検出は、例えば、リアルタイムRT-PCRのようなPCR、in situハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイチップ（DNAチップ）のような当業者に公知の任意の方法によって一つ又はそれ以上の転写産物（ｍRNA又はｃDNA）の量を測定するか、又は、HiCEP法によって遺伝子発現プロファイルを得ることによって実施することが出来る。スクリーニング又は検出は一日の任意の時間、又は、適当な時間経過（間隔）で行うことが出来る。
上記の転写産物は該遺伝子の完全長又はその任意の一部に相当し、任意の長さを有する塩基対であり得る。
当業者であれば、遺伝子の塩基情報に基づき、プライマー設計用の市販ソフトウェアを用いる等の任意の公知手段によって、上記方法に使用するプライマー又はプローブを容易に且つ適宜、設計・調製することが出来る。それらは、鋳型と特異的にハイブリダイズするのに十分な数の塩基、例えば、１５−４０塩基対から成る。このようなプライマー又はプローブは当業者に公知の任意の物質によって標識することが出来る。
HiCEP法の具体的な工程は、例えば、WO02/48352及びWO2005/118791に詳細に記載されている。
特に、HiCEP法の為に病理学的試料、微小組織、及び微小動物等から得る細胞の数は、以下の方法を実施することによって、顕著に減少させることができる。
遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、その５’末端が固相に固定されているか、又は、その５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、その５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型にして、該プロモータ配列に結合するＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（amplifiedＲＮＡ：ａＲＮＡ）を得る工程、
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、その５’末端又は３’末端が固相に固定されているか、又はその５’末端又は３’末端にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡ断片二本鎖ｃDNAを合成する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、その５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、その３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、その３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｌ）工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行ない該二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｍ）３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、その５’末端が固相に固定されているか、又は、その５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、その５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型にして、該プロモータ配列に結合するＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（amplifiedＲＮＡ：ａＲＮＡ）を得る工程、
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、その５’末端又は３’末端が固相に固定されているか、又はその５’末端又は３’末端にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡ断片二本鎖ｃDNAを合成する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、その５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、その３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、その３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｌ）工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行ない該二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｍ）３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
本発明方法においては、（ｆ）工程にて、ＲＮＡポリメレースの作用により、二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（aRNA）を得ることにより、出発原料に含まれていたｍＲＮＡ量を増大させ、且つ、（ｌ）工程にて、ＰＣＲを利用してＸプライマーとＹプライマーが付加された二本鎖ｃＤＮＡ数を増大させることを特徴とする。
上記本発明の第一の態様における（ｆ）工程で、遺伝子発現プロファイル解析に必要な充分な数の増幅ＲＮＡが得られるような場合には、（ｌ）工程を省略することも出来る。従って、第二の方法として、以下の方法に係る。
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、その５’末端が固相に固定されているか、又は、その５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、その５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型にして、該プロモータ配列に結合するＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（amplifiedＲＮＡ：ａＲＮＡ）を得る工程、
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、その５’末端又は３’末端が固相に固定されているか、又はその５’末端又は３’末端にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡ断片二本鎖ｃDNAを合成する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、その５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、その３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、その３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｍ）３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、その５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｆ）工程（ｅ）で生成された二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型にして、該プロモータ配列に結合するＲＮＡポリメレースで当該二本鎖ｃＤＮＡ配列に相補的な増幅ＲＮＡ（amplifiedＲＮＡ：ａＲＮＡ）を得る工程、
（ｇ）工程（ｆ）で合成されたａＲＮＡを鋳型として、Ｘプライマーに相補的な配列を有する一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｈ）工程（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、その５’末端又は３’末端が固相に固定されているか、又はその５’末端又は３’末端にタグ物質が付加された二本鎖ｃＤＮＡ断片二本鎖ｃDNAを合成する工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、その５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、その３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を含む二本鎖ｃDNA断片を精製する工程、
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、その３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｍ）３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
更に、上記（ｌ）工程において、ＰＣＲにより遺伝子発現プロファイル解析に必要な充分な数の二本鎖ｃＤＮＡが増幅することが可能である場合には、（ｆ）〜（ｈ）工程を省略することが出来る。従って、第三の方法として、以下の方法に係る。
（ａ）ポリ（Ａ）ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程であって、その５’末端が固相に固定されているか、又は、その５’末端にタグ物質が付加された一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、その５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、その３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、その３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｌ）工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行ない該二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｍ）３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
（ｂ）工程（ａ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを合成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡを第１の制限酵素Ｘで切断する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片から固相に固定されているか、又はタグ物質が付加されている３’末端断片を精製する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で精製された断片の第１の制限酵素Ｘによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列、Ｘプライマー配列及びプロモータ配列を含むＸ−プロモータアダプターを結合させて、５’末端側にＸ−プロモータアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｉ）工程（ｈ）で合成された二本鎖ｃＤＮＡを、その５’末端側に位置する該Ｘプライマー配列部分を切断しない第２の制限酵素Ｙで切断する工程、
（ｊ）工程（ｉ）で得られた断片の中から、その３’末端に第２の制限酵素Ｙによる切断部位を
（ｋ）工程（ｊ）で回収された二本鎖ｃDNA断片の第２の制限酵素Ｙによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びＹプライマー配列を含むＹアダプターを結合させて、その３’末端側にＹアダプターが結合している二本鎖ｃＤＮＡ断片を得る工程、
（ｌ）工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型として、ＸプライマーとＹプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖ｃＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行ない該二本鎖ｃＤＮＡ断片を増幅する工程、
（ｍ）３’末端に２塩基配列であるＮ１Ｎ２（Ｎ１及びＮ２は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＸ１プライマーと、３’末端に２塩基配列であるＮ３Ｎ４（Ｎ３及びＮ４は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である）を含むＹ１プライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程（ｋ）で得られた二本鎖配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う工程、及び、
（ｎ）得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、
を含む前記方法。
上記の本発明方法で、遺伝子プロファイル作成に際して、プライマーのミスアニーリングに起因する偽ピークの発生を減少させるためには、工程（ｌ）及び／又は（ｍ）において、Xプライマー又はX１プライマー、及びYプライマー又はY１プライマーのそれぞれXアダプター及びYアダプターへのアニーリングを、プライマーのTmMAX+6℃〜TmMAX+14℃の温度で行うことが好ましい。又、特に断りのないかぎり、二本鎖cDNAのセンス鎖(鋳型となるポリ(A)RNAに相同な配列を有する鎖)の5'末端側を二本鎖cDNAの5'末端側とし、当該センス鎖の3'末端側を二本鎖cDNAの3'末端側とする。
「制限酵素」とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖DNAを加水分解し切断する酵素である。本発明においては、適切な断片を得るために2種類の制限酵素X及びYを組み合わせて使用する。本発明に使用可能な制限酵素は、発現された遺伝子であるmRNAから合成された二本鎖cDNAを、識別可能な長さを有する断片に切断することが可能な酵素が好ましい。また、得られた当該二本鎖のより多くを、好ましくはほとんど全ての二本鎖を切断するような酵素が好ましい。例えば、国際公開０２／４８３５２号パンフレットに記載されているような当業者に公知の６塩基認識酵素又は４塩基認識酵素を使用することが出来る。但し、既に記載したように、高いカバー率を達成する為には、例えば、ＭｓｐＩ及びＭｓｅＩのような４塩基認識酵素を組み合わせて使用することが好ましい。
「アダプター」は、該アダプターは第１又は第２の制限酵素による切断部位に相補的な配列を有しているために、該切断部位と結合することができる。そして、Ｘプライマー又はＹプライマー配列を有するために、その後の工程（ｌ）において、各プライマーを使用してＰＣＲ反応によりそれらに挟まれた配列を増幅することができる。使用する制限酵素及びプライマーの構造に種類等に応じて適宜設計することが出来る。安定したＰＣＲ反応を行わせるためには、通常、プライマーの長さは３０塩基程度である。
「Ｘプライマー」、「Ｘ１プライマー」、「Ｙプライマー」及び「Ｙ１プライマー」は、対象ＲＮＡ配列と出来るだけ一致させないために、１６塩基以上の長さを有することが好ましい。更に、例えば、「バイオラッド実験イラストレイテッド（３）新版 本当にふえるＰＣＲ」中山広樹 著、秀潤社、２００２年、第２版、第４刷に記載されているような、ＰＣＲプライマーとして一般的に要求される条件を満たしている必要がある。また、各プライマーは当業者に公知の一般的なプライマー合成方法（Letsinger eet al., Nucleic Acids Research, 20, 1879-1882, 1992; 特開平１１−０８０１８号公報）に従い調製することができる。
更に、ＰＣＲ反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。例えば、適当な蛍光物質として、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）等を挙げることが出来る。
本発明方法の（ｆ）工程及び／又は（ｌ）工程における増幅の程度は、出発材料又は試験材料（それに元来含まれるｍＲＮＡ量）、使用するポリメレース及びプロモータ配列の種類、並びに、各工程の反応条件等に応じて当業者が適宜決めることが出来るが、正確な遺伝子発現プロファイル解析をするには、これらの増幅過程において、試験材料に元来含まれている各ｍＲＮＡ量間の比率が維持されることが必要である。その為には、工程（ｆ）において、二本鎖ｃＤＮＡ断片数の約１０〜５００倍の増幅ＲＮＡを得ることが好ましい。又、工程（ｌ）においては、ＰＣＲサイクル数を７〜１０回とすることによって、二本鎖ｃＤＮＡ断片数を128〜1,024倍に増幅することが好ましい。
本発明方法で使用するＲＮＡポリメレース及びプロモータ配列に特に制限はなく、当業者に公知の任意のものを使用することが可能である。例えば、大腸菌に感染するファージ由来のＴ３プロモータ配列又はＴ７プロモータ配列、及びＳＰ６プロモータ配列、並びに、これら各配列に結合するＲＮＡポリメレースを挙げることが出来る。
上記方法の（ｈ）工程で、（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、その５’末端が固定されているか又はタグ物質が付加された二本鎖ｃDNA断片を得る場合には、相補的に合成されるｃＤＮＡのプライマーとして、固相に固定されているか又はタグ物質が付加されたＸプライマー配列又はその一部を有するオリゴマーをプライマーとして使用すればよい。又、（ｈ）工程で、（ｇ）で合成された一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、３’末端が固定されているか又はタグ物質が付加された二本鎖ｃDNA断片を得る場合には、その前の（ｇ）工程において、工程（ａ）と同様に、オリゴｄＴビーズのような固相に固定されているか又はタグ物質が付加されたオリゴＴプライマーを使用すればよい。
更に、工程（ｈ）で得られる二本鎖ｃDNA断片の５’末端又は３’末端のいずれが固定されているか又はタグ物質が付加されているかに応じて、（ｊ）工程において、固相に固定されているか又はタグ物質が付加された二本鎖ｃDNA断片が回収・精製の対象となるか、又は、除去の対象となるかが決まる。
ここで、固相は、当業者に公知の任意の物質から適宜選択することができ、例えば、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ及びシリカゲルビース等を挙げることが出来る。
「タグ物質」及び「タグ物質に高親和性を有する物質」とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する一方の物質を意味する。互いに高親和性をもって特異的に結合するこが可能な結合対であれば使用することが可能である。本発明に使用可能なタグ物質とタグ物質に高親和性を有する物質との組合せの例には、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FITCとFITC抗体、DIGとanti-DIG及びプロテインAとマウスIgG及びラテックス粒子等が含まれるが、これらに限られるものではない。タグ物質のDNA配列への付加は、当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。又、これらのタグ物質と該タグ物質に高親和性を有する物質との反応を介して各配列を固相に固定することも可能である。
本発明方法の各工程において、タグ物質が付加されている二本鎖ｃＤＮＡ断片を回収する場合には、該タグ物質に高い親和性を有する物質との特異的な反応を利用することが出来る。又、固相に固定されている二本鎖ｃＤＮＡ断片は、それ以外の断片を洗浄等によって反応系から除去することにより、容易に回収することが出来る。これらの各反応は当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。
更に、ＨｉＣＥＰ法の実施に際してのその他の条件及び使用する装置等は、国際公開０２／４８３５２号の記載を参照することが出来る。尚、得られた遺伝子発現プロファイルは、当業者に公知の解析ソフトウェア、例えば、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標：アプライドバイオシステムズジャパン社）を使用して解析することが出来る。
遺伝子Dusp4, Snk, Slc39a6, 及びNnatの転写産物の塩基配列（ヌクレオチド配列）の代表例は、夫々、配列番号１，２，３又は４で示されるものである。
即ち、遺伝子の転写産物が以下の群から選択される塩基配列：
(a) 配列番号１，２，３及び４の夫々で示される塩基配列；
(b) (a)のいずれか一つの塩基配列の相補塩基配列と厳格な条件下でハイブリダイズする塩基配列；
(c) (a)のいずれか一つの塩基配列と８０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含む。
(a) 配列番号１，２，３及び４の夫々で示される塩基配列；
(b) (a)のいずれか一つの塩基配列の相補塩基配列と厳格な条件下でハイブリダイズする塩基配列；
(c) (a)のいずれか一つの塩基配列と８０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含む。
「厳格な条件下」とは、例えば、塩濃度、有機溶媒及び温度等の公知の因子の適当な組み合わせで定義することが出来る。例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度15〜900mM、好ましくは15〜600mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。厳格な条件の好適な一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））等に記載の当業界で公知の任意の方法で行なうことができる。
従って、配列番号１，２，３及び４の夫々で示される塩基配列の相補塩基配列と厳格な条件下でハイブリダイズする塩基配列は、配列番号１，２，３及び４の夫々で示される塩基配列と、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上であるような相同性を有する。
あるいは、遺伝子の発現レベルは、例えば、ウエスタンブロッティング及びEIAのような免疫染色、エドマン法を用いた気相シークエンサー等ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ及びＥＳＩ Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法等に代表される質量分析等の当業者に公知の任意の手段を用いて、該遺伝子コードされる一つ又はそれ以上のタンパク質又はその一部（ポリペプチド）の量を測定することによって検出することが出来る。
当業者であれば、容易に且つ適宜、上記タンパク質又はポリペプチドを用いる任意の従来方法によって、上記方法に使用する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体の場合には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等の適当な動物に投与し、その抗血清から調製することが可能である。或いは、モノクローナル抗体作成法（"Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）等に記載の公知の細胞融合を用いる方法でモノクローナル抗体として調製することも可能である。
上記のタンパク質は以下の群：
(a) Dusp4, Snk, Slc39a6, 及びNnatの夫々にコードされるタンパク質；
(b) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列において一つ又は数個のアミノ酸が置換若しくは交換、欠失又は付加されているタンパク質；
(c) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上であるようなホモロジーを有するアミノ酸配列から成るタンパク質から選択される。
(a) Dusp4, Snk, Slc39a6, 及びNnatの夫々にコードされるタンパク質；
(b) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列において一つ又は数個のアミノ酸が置換若しくは交換、欠失又は付加されているタンパク質；
(c) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上であるようなホモロジーを有するアミノ酸配列から成るタンパク質から選択される。
塩基配列又はアミノ酸配列間のホモロジー（相同性）又は同一性は、例えば、Karlin及び Altschulのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87:2264-2268, 1990 及びProc. Natl. Acad. Sci., USA 90:5873-5877, 1993）を用いるBLAST又はFASTAのようなプログラム等の当業者に公知の任意の方法で決定することが出来る。
本発明のスクリーニング方法に用いるキットは、本発明スクリーニング方法の測定方法及び原理に応じて任意の構成をとることが出来、又は、任意の構成要素を含むことが出来る。該キットは、例えば、FAM (6-carboxyfluoroscein), HEX (4,7,2’, 4’, 5’, 7’-hexachloro-6-carboxyfluorescein), NED (Applied Systems Japan) and Rox (6-carboxy-X-rhodamine)等の適当な標識物質で標識することが出来るプライマー、プローブ、及び抗体、並びに、その他の試薬、酵素、緩衝溶液、及び反応容器等を含むことが出来る。
本発明方法でスクリーニングされる物質には、不眠症、睡眠障害、ナルコレプシー（発作性睡眠）及びジェット機症候群（時差ぼけ）のような体内時計における異常又は障害によって引き起こされるか、又は、それらに関連する病気又は疾患を知用又は予防するための治療目的に使用される薬剤が含まれる。
以下に、実施例を参照して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はそれらに限定されるものではない。
１．１ 動物の調製：
SLC （日本）から購入した５週齢雄マウスC57BL/6株を回し車なしのケージ（33 x 21 cm）内で、温度調整（23 + 2℃）した室内のLD条件（明(light)12時間、暗(dark)12時間）下で少なくとも１０日間飼育し、その後、DD条件（恒常暗）で３日及び１４時間飼育し、その後、連続して２０分間、及び４５分間光に照射し、エーテル麻酔により始末した。概日リズム調節遺伝子を含む、公知の光誘導性転写産物の殆どがこのような時間の光照射によって誘導される理由（１１）から、上記の調製時間を選択した。更に、光照射に対する最初の段階を理解するために、光照射の最も早い段階で誘導される転写産物を単離したかったからである。
SLC （日本）から購入した５週齢雄マウスC57BL/6株を回し車なしのケージ（33 x 21 cm）内で、温度調整（23 + 2℃）した室内のLD条件（明(light)12時間、暗(dark)12時間）下で少なくとも１０日間飼育し、その後、DD条件（恒常暗）で３日及び１４時間飼育し、その後、連続して２０分間、及び４５分間光に照射し、エーテル麻酔により始末した。概日リズム調節遺伝子を含む、公知の光誘導性転写産物の殆どがこのような時間の光照射によって誘導される理由（１１）から、上記の調製時間を選択した。更に、光照射に対する最初の段階を理解するために、光照射の最も早い段階で誘導される転写産物を単離したかったからである。
本実施例の実験環境下におけるC57BL/6マウスのコロニーの自由継続周期（free-running period）の群平均は約２３．７時間であったので、照射開始（light onset）時間は概日時間（ＣＴ）１５に相当する（従って、当マウスコロニーのＣＴ１５はＤＤ条件の４日目におけるＺＴ１４に非常に相当している）。対照マウスは光照射なしでＣＴ１５に始末した。Per1遺伝子による予備実験によって、該動物のSCNにおけるｍＲＮＡ量に関してＣＴ１５とその４５分後で統計的に有意な差はないことを確認されている。誘導が主観的夜又は主観的昼のいずれかで起こるかを調べる為に、ＣＴ７，１５、及び２３においてマウスに光照射し、その４５分後に処理した。光強度は約200 luxであった。概日発現を調べる為に、ＤＤ条件下飼育のマウスを４日目のＣＴ３，７，１１，１５，１９及び２３に処理した。約１ｍｍ厚の脳切片からパンチャーを用いて、内径400 マイクロメーターのＳＣＮ及び大脳皮質組織を打ち抜いた。SCN組織は前方区域から、皮層組織は背部表面の0.5 mm下方で隣接尾状区域における中線から1 mm側方から採取した。１０個体（各HiCEP反応用）及び５個体（リアルタイムPCR）分を集め、直ちに液体窒素で凍結し-80℃で保存した。
１．２ HiCEP法：
以前の文献（３）に記載された方法でHiCEP解析を実施した。各動物に対して、DNase Iで処理した全RNA（３μg）を使用した。１００pmoleの5’-ビオチン化オリゴ d(T) プライマー(5'-BTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3') 及びSUPERSCRIPT（商標）II First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)を用いて第一鎖cDNAを合成し、製造業者の推薦するプロトコールに従い第二鎖を合成した。得られた二本鎖cDNA（dscDNA）を50ユニットのMsp I (タカラバイオ、大津、日本)で消化し、400ユニットのT4 DNAリガーゼ(NEB, Beverly, MA). によって5.0μgのMspIアダプターと結合した。3’末端にビオチンを有する結合産物をストレプトアビジン（Dynabeads M-280 Streptavidin, DYNAL, Oslo, Norway）で被覆された磁気ビーズで回収し、1 mlの洗浄緩衝液（5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1.0 M NaCl）で２回洗浄した。得られたｃＤＮＡ断片を20ユニットのMse I (NEB)で消化し、上清を回収した。10μlの反応溶液中で、2ユニットのMse I 存在下、400ユニットのT4 DNAリガーゼによって10.2 ｐmoleのMse Iアダプターと結合した。こうして得られた溶液を２５６個の選択ＰＣＲの鋳型として用いた。この２５６個の選択ＰＣＲにおいて、各制限酵素の認識部位に隣接する、各標的断片の夫々の末端における２つのヌクレオチドを、該断片集団を２５６個の亜集団（夫々４種類のヌクレオチドの可能性がある、２対のヌクレオチド）に分類すべく設計されたＰＣＲプライマー末端にアニールさせた。産物を変性させ、ABI PRISM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)による電気泳動にかけた。HiCEPで得られたデータはGeneScan 3.1.2 program (ABI)で解析した。
以前の文献（３）に記載された方法でHiCEP解析を実施した。各動物に対して、DNase Iで処理した全RNA（３μg）を使用した。１００pmoleの5’-ビオチン化オリゴ d(T) プライマー(5'-BTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3') 及びSUPERSCRIPT（商標）II First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)を用いて第一鎖cDNAを合成し、製造業者の推薦するプロトコールに従い第二鎖を合成した。得られた二本鎖cDNA（dscDNA）を50ユニットのMsp I (タカラバイオ、大津、日本)で消化し、400ユニットのT4 DNAリガーゼ(NEB, Beverly, MA). によって5.0μgのMspIアダプターと結合した。3’末端にビオチンを有する結合産物をストレプトアビジン（Dynabeads M-280 Streptavidin, DYNAL, Oslo, Norway）で被覆された磁気ビーズで回収し、1 mlの洗浄緩衝液（5 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1.0 M NaCl）で２回洗浄した。得られたｃＤＮＡ断片を20ユニットのMse I (NEB)で消化し、上清を回収した。10μlの反応溶液中で、2ユニットのMse I 存在下、400ユニットのT4 DNAリガーゼによって10.2 ｐmoleのMse Iアダプターと結合した。こうして得られた溶液を２５６個の選択ＰＣＲの鋳型として用いた。この２５６個の選択ＰＣＲにおいて、各制限酵素の認識部位に隣接する、各標的断片の夫々の末端における２つのヌクレオチドを、該断片集団を２５６個の亜集団（夫々４種類のヌクレオチドの可能性がある、２対のヌクレオチド）に分類すべく設計されたＰＣＲプライマー末端にアニールさせた。産物を変性させ、ABI PRISM (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)による電気泳動にかけた。HiCEPで得られたデータはGeneScan 3.1.2 program (ABI)で解析した。
HiCEPで使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである。
Dusp4:
5’-FAM-ACTCGGTTCATGACACGGAT-3’(SEQ ID NO:5)
5’- AGGCGTCCTACTGCGTAAAA-3’ (SEQ ID NO:6)
Snk:
5’-FAM-ACTCGGTTCATGACACGGAC-3’ (SEQ ID NO:7)
5’- AGGCGTCCTACTGCGTAACC-3’ (SEQ ID NO:8)
Slc39a6:
5’-HEX-ACTCGGTTCATGACACGGCT-3‘ (SEQ ID NO:9)
5’- AGGCGTCCTACTGCGTAAGC-3’ (SEQ ID NO:10)
Nnat:
5’-NED-ACTCGGTTCATGACACGGGA-3’ (SEQ ID NO:11)
5’- AGGCGTCCTACTGCGTAAGG-3’ (SEQ ID NO:12)
Dusp4:
5’-FAM-ACTCGGTTCATGACACGGAT-3’(SEQ ID NO:5)
5’- AGGCGTCCTACTGCGTAAAA-3’ (SEQ ID NO:6)
Snk:
5’-FAM-ACTCGGTTCATGACACGGAC-3’ (SEQ ID NO:7)
5’- AGGCGTCCTACTGCGTAACC-3’ (SEQ ID NO:8)
Slc39a6:
5’-HEX-ACTCGGTTCATGACACGGCT-3‘ (SEQ ID NO:9)
5’- AGGCGTCCTACTGCGTAAGC-3’ (SEQ ID NO:10)
Nnat:
5’-NED-ACTCGGTTCATGACACGGGA-3’ (SEQ ID NO:11)
5’- AGGCGTCCTACTGCGTAAGG-3’ (SEQ ID NO:12)
１．３ ピークのクローニング：
対象となるピークを標準スラブゲル(20 cm × 40 cm × 4 mm)で分画した。回収した画分をTA クローニングキット (pGEM-T Easy, Promega, Madison, WI)で再度増幅しクローン化した。クローニングされた断片が対象とした断片であることを確認する為に、ABI PRISM3100電気泳動によって、クローニングベクター内のPCR産物の長さをHiCEPにおける対象ピークの長さと比較した。ダイターミネーター法によって配列を決定した。
対象となるピークを標準スラブゲル(20 cm × 40 cm × 4 mm)で分画した。回収した画分をTA クローニングキット (pGEM-T Easy, Promega, Madison, WI)で再度増幅しクローン化した。クローニングされた断片が対象とした断片であることを確認する為に、ABI PRISM3100電気泳動によって、クローニングベクター内のPCR産物の長さをHiCEPにおける対象ピークの長さと比較した。ダイターミネーター法によって配列を決定した。
１．４ リアルタイムＰＣＲ：
SCN及び大脳皮質組織から調製した全RNA（1μｇ）RNase非含有DNase I（Invitrogen）で処理し、SUPERSCRIPT（商標）II First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)を用いて第一鎖cDNAを合成し、反応は製造業者の推薦するプロトコールに従いオリゴd(T)プライマーを使用して実施した。この第一鎖cDNAを0.1 x TE で１０倍に希釈し、定量的PCRの鋳型として使用した。リアルタイムPCR(SYBER GREEN PCR MASTER MIX, Applied Biosystems)はABI PRISM 7700 (Applied Biosystems)を用いて実施し分析した。各遺伝子のリアルタイムPCRに使用したプライマーは表２に記載されている。データはグリセルアデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（Gapdh）遺伝子の発現レベルに対して標準化した。PCR条件は９５℃で１０分間、９５．０℃で１５秒間を５０サイクル、６０．０℃で３０秒、及び７８．０℃で４０秒であった。
SCN及び大脳皮質組織から調製した全RNA（1μｇ）RNase非含有DNase I（Invitrogen）で処理し、SUPERSCRIPT（商標）II First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)を用いて第一鎖cDNAを合成し、反応は製造業者の推薦するプロトコールに従いオリゴd(T)プライマーを使用して実施した。この第一鎖cDNAを0.1 x TE で１０倍に希釈し、定量的PCRの鋳型として使用した。リアルタイムPCR(SYBER GREEN PCR MASTER MIX, Applied Biosystems)はABI PRISM 7700 (Applied Biosystems)を用いて実施し分析した。各遺伝子のリアルタイムPCRに使用したプライマーは表２に記載されている。データはグリセルアデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（Gapdh）遺伝子の発現レベルに対して標準化した。PCR条件は９５℃で１０分間、９５．０℃で１５秒間を５０サイクル、６０．０℃で３０秒、及び７８．０℃で４０秒であった。
１．５ in situハイブリダイゼーション：
脳を４％パラホルムアルデヒド-PBS溶液で２４時間固定し、２０％ショ糖-PBS溶液中に更に２４時間浸漬した。その後、Cryostat (Leitz CM-1510, Germany)を用いて脳を３０ミクロン区分にスライスした。cDNA断片をプラスミドベクター内にサブクローニングした。PGEM Easy (Promega)を制限酵素で直線化し、cRNAプローブ用の鋳型として使用した。CRNAの標準プロトコールに従い、[α-33P]UTP (New England Nuclear, Boston, MA, USA)を用いて放射標識プローブを調製した。公知文献（１２）に記載されたように、ハイブリダイゼーションを行った。分析の為に、各遺伝子に対して以下に示す複数のプローブを使用した。
C/EBP betaに対しては３種の断片： NM_009883 (-2-501, 513-1,022 and 822-1,357)；
Nr4a2に対しては２種の断片 ：NM_013613 (715-1,219 and 1,295-1,794)；
Btg2に対しては２種の断片：NM_007570 (505-1,041 and 1,077-1,601)；
Snkに対しては２種類の断片 NM_152804.1 (553-1,149 and 1,604-2,256)。
読み取り粋の開始コドンの最初のヌクレオチド“Ａ”を「１」と定義した。
脳を４％パラホルムアルデヒド-PBS溶液で２４時間固定し、２０％ショ糖-PBS溶液中に更に２４時間浸漬した。その後、Cryostat (Leitz CM-1510, Germany)を用いて脳を３０ミクロン区分にスライスした。cDNA断片をプラスミドベクター内にサブクローニングした。PGEM Easy (Promega)を制限酵素で直線化し、cRNAプローブ用の鋳型として使用した。CRNAの標準プロトコールに従い、[α-33P]UTP (New England Nuclear, Boston, MA, USA)を用いて放射標識プローブを調製した。公知文献（１２）に記載されたように、ハイブリダイゼーションを行った。分析の為に、各遺伝子に対して以下に示す複数のプローブを使用した。
C/EBP betaに対しては３種の断片： NM_009883 (-2-501, 513-1,022 and 822-1,357)；
Nr4a2に対しては２種の断片 ：NM_013613 (715-1,219 and 1,295-1,794)；
Btg2に対しては２種の断片：NM_007570 (505-1,041 and 1,077-1,601)；
Snkに対しては２種類の断片 NM_152804.1 (553-1,149 and 1,604-2,256)。
読み取り粋の開始コドンの最初のヌクレオチド“Ａ”を「１」と定義した。
２ 結果：
２．１ マウスSCNからの光誘導性遺伝子の同定：
光照射に対するSCNにおけるトランスクリプトームの変化を調査した。公知の光誘導性遺伝子の誘導は光照射の１時間後に始まるので、CT15にマウスに光照射し、夫々、２０分及び４５分後に始末した（１２）。SCNから精製しDNase I処理した全RNA（3μg）を遺伝子発現プロファイル解析に使用し、約19,800個のピークが検出された。
２．１ マウスSCNからの光誘導性遺伝子の同定：
光照射に対するSCNにおけるトランスクリプトームの変化を調査した。公知の光誘導性遺伝子の誘導は光照射の１時間後に始まるので、CT15にマウスに光照射し、夫々、２０分及び４５分後に始末した（１２）。SCNから精製しDNase I処理した全RNA（3μg）を遺伝子発現プロファイル解析に使用し、約19,800個のピークが検出された。
結果を図１に示す。８７シグナルのピークが誘導されたことが観察された（図２及び図３）。HiCEPでは1.2-1.5倍の発現変化を識別可能であるので（３）、光照射に応じた遺伝子発現における変化が1.5倍より大きいピークを選択した。続いて、光誘導性ピークをクローニングし、それらの配列を決定し、公的データベースによるBLASTサーチを実施した。HiCEPで得られた結果を確証するために、クローン化された各転写産物に対するプライマーを合成し、HiCEP用に調製した試料とは別に調製したRNA画分を用いてリアルタイムPCRを実施した。転写産物の中の６０個が光誘導性であることが確認された（図２及び図３）。
上記６０個の転写産物の内の３３個は公知である。一方、残り２７個は新規であり、これらは現在更に研究中である。公知の転写産物３３個の中で、Nuclear Receptor Subfamily 4-group A-member 1 (Nr4a1), Per1, FBJ osteosarcoma oncogene B (FosB), Jun oncogene (Jun), FBJ osteosarcoma oncogene (c-Fos) 及びFos-like antigen 2 (Fosl2) の６個のみがマウスSCNで光誘導性としてこれまで知られていたものであった（図１）。本発明において、読み取り枠が推定・示唆されている１７個の公知転写産物に焦点を当てた。更に、公知の転写産物３３個の中の１０個の転写産物はイントロン領域であることを見出し、これらには読み取り枠が推定・示唆されなかった。本発明において、新たに同定された４個の代表的な光誘導性タンパク質をコードする転写産物、及び、対照として２個の公知の光誘導性転写産物に関する情報は表１にまとめた。これら６個の公知の光誘導性遺伝子の全ては転写因子をコードしており、上記１７個の転写産物の中に５個の転写因子コーディング遺伝子（推定遺伝子も含む）が見出された。更に、MAPキナーゼシグナル経路におけるホスファターゼ及びユビキチン系における２種類のキナーゼ及びリガーゼが同定された。これら遺伝子産物にはPASドメインは見られなかった。ドメイン関連情報は表１のInterPro欄に記載されている。
SCNにおける２３個の光誘導性遺伝子の内の１１個が大脳皮質でも誘導されたことは特筆すべきことである。本発明における実験によって光誘導性及び周期的発現の双方を示す遺伝子はSCN特異的光誘導性を示した（表１及び図５）。
次に、上記の１７個の転写産物に関して、誘導が主観的夜又は主観的昼のいずれかで生起するかを検討した。それらの中の１４個が主観的夜のみで光誘導されることを見出した（図４,A-D）。HiCEP及びリアルタイムPCRの結果を確認し、脳における発現の局在化を調査する目的で、或る程度ランダムに選んだ転写産物を用いてin situハイブリダイゼーションを実施した。その結果、SCNにおける局在化及び主観的夜特異的誘導を見出した（図４,E-H）。更に、SCNの外で顕著なNr4a2シグナルを検出した。
２．２ 光誘導性及び周期的発現遺伝子：
検出された光誘導性遺伝子の中にPer 1は含まれていた（表１）。これは概日リズムの中心的メカニズムにおけるキーとなる分子であり、周期的に発現することが知られている。上記１７個の光誘導性遺伝子及び６個の対照遺伝子が恒常暗条件下で周期的に発現するか否かを検討した。Per1, Fosl2, Dusp4, 血清誘導性キナーゼ (Snk), 溶質キャリアファミリー 39-メンバー 6 (solute carrier family 39-member 6 ：Slc39a6又は Liv1) 及びニューロナチン（Neuronatin：Nnat）の６個の転写産物がSCNにおいて周期的に発現していることを見出した（図５）。これらの周期遺伝子は主観的夜の間に発現ピークに達した。これは、試験した転写産物の試料における偏りが原因であるかもしれない。主観的夜の間のCT15における光照射に応答して発現が増加した転写産物を選んだからである。
検出された光誘導性遺伝子の中にPer 1は含まれていた（表１）。これは概日リズムの中心的メカニズムにおけるキーとなる分子であり、周期的に発現することが知られている。上記１７個の光誘導性遺伝子及び６個の対照遺伝子が恒常暗条件下で周期的に発現するか否かを検討した。Per1, Fosl2, Dusp4, 血清誘導性キナーゼ (Snk), 溶質キャリアファミリー 39-メンバー 6 (solute carrier family 39-member 6 ：Slc39a6又は Liv1) 及びニューロナチン（Neuronatin：Nnat）の６個の転写産物がSCNにおいて周期的に発現していることを見出した（図５）。これらの周期遺伝子は主観的夜の間に発現ピークに達した。これは、試験した転写産物の試料における偏りが原因であるかもしれない。主観的夜の間のCT15における光照射に応答して発現が増加した転写産物を選んだからである。
本明細書中に引用した文献の開示全体は本明細書に含まれる。
本発明方法によって、不眠症、睡眠障害、ナルコレプシー（発作性睡眠）及びジェット機症候群（時差ぼけ）のような体内時計における異常又は障害によって引き起こされるか、又は、それらに関連する病気又は疾患を知用又は予防するための治療目的での使用に有用な物質が提供される。
Claims (11)
- 光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルを検出することを含む、生物の体内時計システムに影響を与える物質のスクリーニング方法。
- 物質の存在下における、光誘導性であって概日様式で周期的に発現する遺伝子の発現レベルの変化に基づく、請求項１記載のスクリーニング方法。
- 哺乳動物の視交叉上核において遺伝子が発現される、請求項１記載のスクリーニング方法。
- 遺伝子が、Dusp4, Snk, Slc39a6 及びNnat並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１記載のスクリーニング方法。
- (a) 脳の視交叉上核由来の培養細胞株をスクリーニングする物質と接触させ；
(b)遺伝子の発現レベルの変化を検出し；及び、
(c)該遺伝子の発現レベルに影響を与える物質を選択する、工程を含む、請求項１記載のスクリーニング方法。 - 遺伝子の転写産物の量を測定することによって該遺伝子の発現レベルを検出する、請求項１〜５のいずれか一つに記載のスクリーニング方法。
- 遺伝子の転写産物の量がHiCEP法による遺伝子発現プロファイルを得ることによって測定される、請求項６に記載のスクリーニング方法。
- 遺伝子の転写産物の量がPCRによって測定される、請求項６に記載のスクリーニング方法。
- 遺伝子の転写産物が以下の群から選択される塩基配列：
(a)配列番号１，２，３及び４の夫々で示される塩基配列；
(b) (a)のいずれか一つの塩基配列の相補塩基配列と厳格な条件下でハイブリダイズする塩基配列；
(c) (a)のいずれか一つの塩基配列と８０％以上のホモロジーを有する塩基配列、を含む請求項７又は８記載のスクリーニング方法。 - 遺伝子にコードされる一つ又はそれ以上のタンパク質又はその一部の量を測定することによって該遺伝子の発現レベルを検出する、請求項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
- タンパク質が以下の群：
(a) Dusp4, Snk, Slc39a6, 及びNnatの夫々にコードされるタンパク質；
(b) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列において一つ又は数個のアミノ酸が置換若しくは交換、欠失又は付加されているタンパク質；
(c) (a)のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列と８０％以上のホモロジーを有するアミノ酸配列から成るタンパク質、から選択される請求項５記載のスクリーニング方法。
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