JP2000139481A - ヌクレオシド一リン酸合成用の昆虫細胞由来のデオキシヌクレオシドキナ―ゼ - Google Patents
ヌクレオシド一リン酸合成用の昆虫細胞由来のデオキシヌクレオシドキナ―ゼInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヌクレオシド一リン酸を合成する際に安定な
組換えキナーゼを提供する。 【解決手段】 ヌクレオシド一リン酸の合成中に、安定
化SH試薬を加えることなく、タンパク質を安定化するこ
となく安定であり、そして４種の天然デオキシヌクレオ
シド全てを受け入れる、昆虫細胞、例えばDrosophila M
elanogasterなどから取得可能な組換えキナーゼ。DNA配
列、ベクター、形質転換細胞、前記組換えキナーゼの製
造方法ならびにヌクレオシド一リン酸の調製に対するそ
の使用。
組換えキナーゼを提供する。 【解決手段】 ヌクレオシド一リン酸の合成中に、安定
化SH試薬を加えることなく、タンパク質を安定化するこ
となく安定であり、そして４種の天然デオキシヌクレオ
シド全てを受け入れる、昆虫細胞、例えばDrosophila M
elanogasterなどから取得可能な組換えキナーゼ。DNA配
列、ベクター、形質転換細胞、前記組換えキナーゼの製
造方法ならびにヌクレオシド一リン酸の調製に対するそ
の使用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の主題は、ヌクレオシ
ド一リン酸の合成中に、安定化SH試薬を添加することな
く、タンパク質および界面活性剤を安定化することなく
安定であり、そして４つの天然デオキシヌクレオシド全
てを受け入れる、例えば、Drosophila Melanogasterの
ような昆虫細胞由来の組換えキナーゼである。本発明の
さらなる主題は、本発明のキナーゼをコードするDNA配
列、ならびに本発明のキナーゼの調製方法およびヌクレ
オシド一リン酸の合成中におけるその使用である。
ド一リン酸の合成中に、安定化SH試薬を添加することな
く、タンパク質および界面活性剤を安定化することなく
安定であり、そして４つの天然デオキシヌクレオシド全
てを受け入れる、例えば、Drosophila Melanogasterの
ような昆虫細胞由来の組換えキナーゼである。本発明の
さらなる主題は、本発明のキナーゼをコードするDNA配
列、ならびに本発明のキナーゼの調製方法およびヌクレ
オシド一リン酸の合成中におけるその使用である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】（デ
オキシ）−ヌクレオシドキナーゼは、それぞれ、ヌクレ
オシドまたはデオキシヌクレオシドの対応するヌクレオ
チド一リン酸へのリン酸化を触媒するものであり、よっ
てヌクレオチド代謝の「再利用経路」において重要な役
割を果たす。
オキシ）−ヌクレオシドキナーゼは、それぞれ、ヌクレ
オシドまたはデオキシヌクレオシドの対応するヌクレオ
チド一リン酸へのリン酸化を触媒するものであり、よっ
てヌクレオチド代謝の「再利用経路」において重要な役
割を果たす。
【０００３】触媒反応は下記のとおりである：
【０００４】
【化１】
【０００５】デオキシヌクレオシド一リン酸は、PCR反
応用の試薬として大いに用いられているデオキシヌクレ
オシド三リン酸の出発物質である。
応用の試薬として大いに用いられているデオキシヌクレ
オシド三リン酸の出発物質である。
【０００６】デオキシヌクレオシド一リン酸は、現在、
３つの方法： １．魚精子の加水分解 ２．デオキシヌクレオシドからの化学合成 ３．デオキシヌクレオシドからの酵素合成 により得ることができる。
３つの方法： １．魚精子の加水分解 ２．デオキシヌクレオシドからの化学合成 ３．デオキシヌクレオシドからの酵素合成 により得ることができる。
【０００７】従来公知の方法にはいくつかの欠点があ
る。例えば、魚精子の加水分解では、４つの一リン酸エ
ステル全てがほぼ同量ずつ製造される。このため、市場
の要求を捉え損ねているのは事実である（例えば、部分
的にd-TTPの代わりに用いられるd-UTPはd-CTPから調製
される）。さらに、加水分解から得られるd-TTPは、約
２％のd-UTPが混入しており、実質的に単離することが
できない。
る。例えば、魚精子の加水分解では、４つの一リン酸エ
ステル全てがほぼ同量ずつ製造される。このため、市場
の要求を捉え損ねているのは事実である（例えば、部分
的にd-TTPの代わりに用いられるd-UTPはd-CTPから調製
される）。さらに、加水分解から得られるd-TTPは、約
２％のd-UTPが混入しており、実質的に単離することが
できない。
【０００８】さらに、この抽出物の動物起源は、調節の
観点（GMP）から重大であるものと評価されなければな
らない。また、魚精子由来の一リン酸エステルの市場は
かなり限定される。
観点（GMP）から重大であるものと評価されなければな
らない。また、魚精子由来の一リン酸エステルの市場は
かなり限定される。
【０００９】化学合成では、クロマトグラフィーでの精
製による単離が困難ないくつかの副生物が製造される。
さらに、いくつかの塩基（例えばグアノシン）には合成
時間をかなり増大させるリン酸化の前に保護基を付与し
なければならない。
製による単離が困難ないくつかの副生物が製造される。
さらに、いくつかの塩基（例えばグアノシン）には合成
時間をかなり増大させるリン酸化の前に保護基を付与し
なければならない。
【００１０】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
当技術分野の現状の欠点は、デオキシヌクレオシド一リ
ン酸の合成中に、安定化SH試薬を添加することなく、タ
ンパク質および界面活性剤を安定化することなく安定で
あり、４つの天然デオキシヌクレオチド：チミジン（dT
hd）、デオキシシチジン（dCyd）、デオキシアデノシン
（dAdo）およびデオキシグアノシン（dGuo）全てを受け
入れる、特にDrosophila melanogaster（Dm-dNK）など
の昆虫細胞由来の組換え多機能デオキシヌクレオシドキ
ナーゼの提供により克服された。本発明においては、安
定とは、触媒された反応の収率が37℃にて５時間以内、
好ましくは10時間以内、特に好ましくは12時間以内に減
少しないことを意味する。酵素がチオールを含む安定剤
を添加することなくそのように長時間安定であることは
驚くべきことである。今までその他のキナーゼにおいて
はこの安定性は観察されていない（１〜９）。合成にお
いて本発明のキナーゼを用いる場合、これらの安定剤を
省略することによって合成はより安価なものとなり、と
りわけ生成物の精製が非常に簡略化され得る。
当技術分野の現状の欠点は、デオキシヌクレオシド一リ
ン酸の合成中に、安定化SH試薬を添加することなく、タ
ンパク質および界面活性剤を安定化することなく安定で
あり、４つの天然デオキシヌクレオチド：チミジン（dT
hd）、デオキシシチジン（dCyd）、デオキシアデノシン
（dAdo）およびデオキシグアノシン（dGuo）全てを受け
入れる、特にDrosophila melanogaster（Dm-dNK）など
の昆虫細胞由来の組換え多機能デオキシヌクレオシドキ
ナーゼの提供により克服された。本発明においては、安
定とは、触媒された反応の収率が37℃にて５時間以内、
好ましくは10時間以内、特に好ましくは12時間以内に減
少しないことを意味する。酵素がチオールを含む安定剤
を添加することなくそのように長時間安定であることは
驚くべきことである。今までその他のキナーゼにおいて
はこの安定性は観察されていない（１〜９）。合成にお
いて本発明のキナーゼを用いる場合、これらの安定剤を
省略することによって合成はより安価なものとなり、と
りわけ生成物の精製が非常に簡略化され得る。
【００１１】さらに、従来公知のキナーゼはかなり高い
基質特異性を有する。その結果、個々のヌクレオシドの
合成に対して、対応する特異的キナーゼを有することも
必要ない。ジデオキシヌクレオシドまたは塩基−もしく
は糖ー修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシド類似
体の合成に対しては特異性が低いことが特に都合がよ
い。塩基−修飾ヌクレオシドは、例えば、塩基がレポー
ター基（染料、ジゴキシゲニン、ビオチン）で標識され
た7-デアザ-ヌクレオシド、C-ヌクレオシドおよびヌク
レオチドである。糖−修飾ヌクレオシドは、例えば、ア
ザチミジン、アラビノシル−チミジンである。公知の類
似の酵素と比較したDrosophilaキナーゼの速度定数を図
１に示す。本発明のキナーゼの特異的活性kcは、従来公
知のキナーゼのものよりも数倍大きい。酵素の活性は、
参考文献：Munch-Petersonら(1991)J. Biol. Chem. 26
6, 9032-9038に記載されたようにして測定した。このこ
とにより、dNMPを合成するのに必要な酵素の量はかなり
低くなる（3.5〜14000倍、図１のKc値参照）。本発明の
キナーゼの特異性定数（kc/KM）は、いくつかの能力に
より従来公知のものを超えるものであり、拡散定数の範
囲にある。このことにより、キナーゼをd-NMP合成に加
える場合、完全な収率が得られる。それらは従来公知の
キナーゼの２〜6500倍高い（図１参照）。
基質特異性を有する。その結果、個々のヌクレオシドの
合成に対して、対応する特異的キナーゼを有することも
必要ない。ジデオキシヌクレオシドまたは塩基−もしく
は糖ー修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシド類似
体の合成に対しては特異性が低いことが特に都合がよ
い。塩基−修飾ヌクレオシドは、例えば、塩基がレポー
ター基（染料、ジゴキシゲニン、ビオチン）で標識され
た7-デアザ-ヌクレオシド、C-ヌクレオシドおよびヌク
レオチドである。糖−修飾ヌクレオシドは、例えば、ア
ザチミジン、アラビノシル−チミジンである。公知の類
似の酵素と比較したDrosophilaキナーゼの速度定数を図
１に示す。本発明のキナーゼの特異的活性kcは、従来公
知のキナーゼのものよりも数倍大きい。酵素の活性は、
参考文献：Munch-Petersonら(1991)J. Biol. Chem. 26
6, 9032-9038に記載されたようにして測定した。このこ
とにより、dNMPを合成するのに必要な酵素の量はかなり
低くなる（3.5〜14000倍、図１のKc値参照）。本発明の
キナーゼの特異性定数（kc/KM）は、いくつかの能力に
より従来公知のものを超えるものであり、拡散定数の範
囲にある。このことにより、キナーゼをd-NMP合成に加
える場合、完全な収率が得られる。それらは従来公知の
キナーゼの２〜6500倍高い（図１参照）。
【００１２】驚いたことに、本発明の酵素は反応操作に
都合がよい60℃でも安定である。好ましくは、本発明の
酵素は、T=37℃で、５mM MgCl2 を含むトリス緩衝液中
においてt1/2 ≧50時間、水中においてt1/2 ≧25時間の
半減期を有するものであり、全ての天然デオキシヌクレ
オシドを受け入れる（実施例６）。
都合がよい60℃でも安定である。好ましくは、本発明の
酵素は、T=37℃で、５mM MgCl2 を含むトリス緩衝液中
においてt1/2 ≧50時間、水中においてt1/2 ≧25時間の
半減期を有するものであり、全ての天然デオキシヌクレ
オシドを受け入れる（実施例６）。
【００１３】本発明のさらなる主題は、その他の非脊椎
動物生物、特にDrosophilaキナーゼの特性に匹敵する特
性を示す六脚類クラスのその他の動物種由来のキナーゼ
である。特に、上記の安定性および上記の基質特異性を
本質的に有するキナーゼである。好ましいキナーゼは、
有翅類のサブクラスから単離されたキナーゼであり、特
に好ましいのは双翅類クラス由来のものであり、Drosop
hilidaeファミリー由来のものが特に好ましい。
動物生物、特にDrosophilaキナーゼの特性に匹敵する特
性を示す六脚類クラスのその他の動物種由来のキナーゼ
である。特に、上記の安定性および上記の基質特異性を
本質的に有するキナーゼである。好ましいキナーゼは、
有翅類のサブクラスから単離されたキナーゼであり、特
に好ましいのは双翅類クラス由来のものであり、Drosop
hilidaeファミリー由来のものが特に好ましい。
【００１４】本発明のさらなる主題は、本発明のキナー
ゼをコードするDNA配列ならびにその機能的断片であ
る。本発明のDNA配列は、以下に示す配列： GGGAAGTGGCAGGAGTAGCTCCCG（配列番号２） CTCCCGTTGTAGCCGTCGCCCTTCTGG（配列番号３） GACGACTGGCTCGGGCAGCTCTTCACCGCGTTG（配列番号４） TTCGATTTTTATTACCTCGCGAGGTAA（配列番号５） AGGTAAAAATCGCGAGCGATAACGAAGCAC（配列番号６） CACCGCATGCTTGCGTAGGCCGTCGCCCGAGCAAGACTCCTC（配列番
号７） GACTACATGTTTCTAGGGTTCTTCACC（配列番号８） を有するプライマーが本発明のキナーゼのDNA配列上に
ハイブリダイズするという特徴を有する。
ゼをコードするDNA配列ならびにその機能的断片であ
る。本発明のDNA配列は、以下に示す配列： GGGAAGTGGCAGGAGTAGCTCCCG（配列番号２） CTCCCGTTGTAGCCGTCGCCCTTCTGG（配列番号３） GACGACTGGCTCGGGCAGCTCTTCACCGCGTTG（配列番号４） TTCGATTTTTATTACCTCGCGAGGTAA（配列番号５） AGGTAAAAATCGCGAGCGATAACGAAGCAC（配列番号６） CACCGCATGCTTGCGTAGGCCGTCGCCCGAGCAAGACTCCTC（配列番
号７） GACTACATGTTTCTAGGGTTCTTCACC（配列番号８） を有するプライマーが本発明のキナーゼのDNA配列上に
ハイブリダイズするという特徴を有する。
【００１５】本発明のさらなる主題は、DNA配列上に、
配列番号２、３、５、７および８または配列番号２、
４、５、７および８または配列番号２、５、６、７およ
び８を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする
そのようなキナーゼおよびDNA配列でもある。
配列番号２、３、５、７および８または配列番号２、
４、５、７および８または配列番号２、５、６、７およ
び８を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする
そのようなキナーゼおよびDNA配列でもある。
【００１６】下記のハイブリダイゼーション条件が都合
がよい： −ハイブリダイゼーション：0.75M NaCl、0.15トリス、
10mM EDTA、0.1％リン酸ナトリウム、0.1％SLS、0.03％
BSA、0.03％ Ficoll 400、0.03％PVPおよび100μd/ml
煮沸子ウシ胸腺DNA、50℃にて約12時間。 −洗浄：0.1×SET、0.1％SDS、0.1％リン酸ナトリウム
および0.1Mリン酸緩衝液で45℃にて３×30分。
がよい： −ハイブリダイゼーション：0.75M NaCl、0.15トリス、
10mM EDTA、0.1％リン酸ナトリウム、0.1％SLS、0.03％
BSA、0.03％ Ficoll 400、0.03％PVPおよび100μd/ml
煮沸子ウシ胸腺DNA、50℃にて約12時間。 −洗浄：0.1×SET、0.1％SDS、0.1％リン酸ナトリウム
および0.1Mリン酸緩衝液で45℃にて３×30分。
【００１７】本発明のキナーゼ配列を図５の配列番号１
に示す。本発明のDNA配列は、下記の手順によってDroso
phila Melanogasterから取得可能である：
に示す。本発明のDNA配列は、下記の手順によってDroso
phila Melanogasterから取得可能である：
【００１８】特にデオキシヌクレオシドキナーゼをコー
ドする推定遺伝子を含有する1.1kbpのcDNAインサートを
含むpBluescript SK +/-ファージミドは、Berkeley Dro
sophilaゲノム配列決定プロジェクト（クローンLD1598
3）から得た。ファージミドの多重クローニング部位（M
CS）にEcoRIおよびXhoIによりクローニングされた1.1kb
pのcDNAの5'末端の最初の600塩基対は、カリフォルニア
大学（バークリー）のHarveyらによって既に配列決定さ
れている。これらの配列情報に基づいて、新規プライマ
ーを設計した（インサートの完全配列決定を可能にする
Dm-TK1およびDm-TK2/5'-TCCCAATCTCACGTGCAGATC-3'(配
列番号９)および5'-TTCATCGAAGAGTCCATTCAC-3'(配列番
号１０)）。Dm-TK1は、推定翻訳開始領域の上流に結合
する21bpのセンスプライマーである。Dm-TK2は、既に配
列決定されているcDNA部分の3'領域の21bpのセンスプラ
イマーとして設計した。
ドする推定遺伝子を含有する1.1kbpのcDNAインサートを
含むpBluescript SK +/-ファージミドは、Berkeley Dro
sophilaゲノム配列決定プロジェクト（クローンLD1598
3）から得た。ファージミドの多重クローニング部位（M
CS）にEcoRIおよびXhoIによりクローニングされた1.1kb
pのcDNAの5'末端の最初の600塩基対は、カリフォルニア
大学（バークリー）のHarveyらによって既に配列決定さ
れている。これらの配列情報に基づいて、新規プライマ
ーを設計した（インサートの完全配列決定を可能にする
Dm-TK1およびDm-TK2/5'-TCCCAATCTCACGTGCAGATC-3'(配
列番号９)および5'-TTCATCGAAGAGTCCATTCAC-3'(配列番
号１０)）。Dm-TK1は、推定翻訳開始領域の上流に結合
する21bpのセンスプライマーである。Dm-TK2は、既に配
列決定されているcDNA部分の3'領域の21bpのセンスプラ
イマーとして設計した。
【００１９】この配列を用いて、750bpを含み、250個の
アミノ酸を有するタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレームを同定することができた。DNA配列、
配列番号１を図５に示す。このタンパク質の分子量の計
算値は29kDaであり、したがって天然Dm-dNKについて分
子量は約30kDaであるとするMunch-Petersonら（1998
年）によってに示されたデータと一致する。
アミノ酸を有するタンパク質をコードするオープンリー
ディングフレームを同定することができた。DNA配列、
配列番号１を図５に示す。このタンパク質の分子量の計
算値は29kDaであり、したがって天然Dm-dNKについて分
子量は約30kDaであるとするMunch-Petersonら（1998
年）によってに示されたデータと一致する。
【００２０】配列情報から出発して、Dm-dNKをコードす
る構造遺伝子はpBluescript SK +/-ファージミドの1.1k
b cDNAインサートから「ポリメラーゼ連鎖反応」技法
（PCR）によって単離することができる（Mullis, K.B.
およびFaloona, F.A., Methodsin Enzymol. 155(1987)3
35-350）。このために、適切な発現プラスミドへのその
後の挿入の対応するエンドヌクレアーゼ制限部位を有す
る特異的プライマー対（5'-GCGCGAATTCATGGCGGAGGCAGCA
TCCTGTGC-3'(配列番号１１)および5'-GCGCAAGCTTATTATC
TGGCGACCCTCTGGC-3'(配列番号１２)）を合成した。例え
ば、5'−プライマー（Dm-dNK3）はコード配列の上流にE
coRIエンドヌクレアーゼ制限部位を有するが、3'-プラ
イマー（Dm-dNK4）はコード配列の下流にHindIIIエンド
ヌクレアーゼ制限部位を含む。さらに、3'-プライマー
はコード配列の下流に翻訳を安全に終結させるための２
個の終結コドンを含む。さらに、E.coliにおける翻訳開
始のために最適化された適当なプライマーは以下の配
列： 配列番号１３(Dm-dNK3) 5'-CGCGAATTCATGGCGGAAGCGGCGAGCTGCGCGCGTAAGGGGACC-
3' 配列番号１４(Dm-dNK4) 5'-CGCAAGCTTATTAACGGGCGACCCTCTGGC-3' を有する。
る構造遺伝子はpBluescript SK +/-ファージミドの1.1k
b cDNAインサートから「ポリメラーゼ連鎖反応」技法
（PCR）によって単離することができる（Mullis, K.B.
およびFaloona, F.A., Methodsin Enzymol. 155(1987)3
35-350）。このために、適切な発現プラスミドへのその
後の挿入の対応するエンドヌクレアーゼ制限部位を有す
る特異的プライマー対（5'-GCGCGAATTCATGGCGGAGGCAGCA
TCCTGTGC-3'(配列番号１１)および5'-GCGCAAGCTTATTATC
TGGCGACCCTCTGGC-3'(配列番号１２)）を合成した。例え
ば、5'−プライマー（Dm-dNK3）はコード配列の上流にE
coRIエンドヌクレアーゼ制限部位を有するが、3'-プラ
イマー（Dm-dNK4）はコード配列の下流にHindIIIエンド
ヌクレアーゼ制限部位を含む。さらに、3'-プライマー
はコード配列の下流に翻訳を安全に終結させるための２
個の終結コドンを含む。さらに、E.coliにおける翻訳開
始のために最適化された適当なプライマーは以下の配
列： 配列番号１３(Dm-dNK3) 5'-CGCGAATTCATGGCGGAAGCGGCGAGCTGCGCGCGTAAGGGGACC-
3' 配列番号１４(Dm-dNK4) 5'-CGCAAGCTTATTAACGGGCGACCCTCTGGC-3' を有する。
【００２１】pUC18におけるDm-dNKについての構造遺伝
子のクローニング PCR調製物をアガロースゲルに加えて、そのアガロース
ゲルから750bpの構造遺伝子を単離した。PCR断片をEcoR
IおよびHindIII制限エンドヌクレアーゼを用いて37℃で
１時間切断した。同時に、pUC18プラスミドをEcoRIおよ
びHindIII制限エンドヌクレアーゼを用いて37℃で１時
間切断し、次いで調製物をアガロースゲル電気泳動によ
って分離し、2635bpのベクター断片を単離した。その
後、PCR断片およびベクター断片をT4-DNA-リガーゼによ
りライゲートした。次いで、１μl（20ng）のベクター
断片および３μl（100ng）のPCR断片、１μlの10×リガ
ーゼ緩衝液（Maniatisら, 1989 Molecular cloning, a
Laboratory manual, Sambrok, Fritsch, Maniatis, Boo
k 3, Section B27; Munch-Peterson(1991) J. Biol.Che
m. 266, 9032)、１μlのT4-DNA-リガーゼ、二回蒸留し
た(bidist.)４μlの無菌H2O をピペットで加え、注意深
く混合して16℃で一晩インキュベートした。クローニン
グされた遺伝子を制限分析および配列決定によってチェ
ックした。
子のクローニング PCR調製物をアガロースゲルに加えて、そのアガロース
ゲルから750bpの構造遺伝子を単離した。PCR断片をEcoR
IおよびHindIII制限エンドヌクレアーゼを用いて37℃で
１時間切断した。同時に、pUC18プラスミドをEcoRIおよ
びHindIII制限エンドヌクレアーゼを用いて37℃で１時
間切断し、次いで調製物をアガロースゲル電気泳動によ
って分離し、2635bpのベクター断片を単離した。その
後、PCR断片およびベクター断片をT4-DNA-リガーゼによ
りライゲートした。次いで、１μl（20ng）のベクター
断片および３μl（100ng）のPCR断片、１μlの10×リガ
ーゼ緩衝液（Maniatisら, 1989 Molecular cloning, a
Laboratory manual, Sambrok, Fritsch, Maniatis, Boo
k 3, Section B27; Munch-Peterson(1991) J. Biol.Che
m. 266, 9032)、１μlのT4-DNA-リガーゼ、二回蒸留し
た(bidist.)４μlの無菌H2O をピペットで加え、注意深
く混合して16℃で一晩インキュベートした。クローニン
グされた遺伝子を制限分析および配列決定によってチェ
ックした。
【００２２】適切な発現ベクターにおけるDm-dNKについ
ての構造遺伝子のクローニング Dm-dNKの発現のために、構造遺伝子を適当なプロモータ
ー、好ましくは誘導プロモーター、特に好ましくはlac
-、lacUV5-、tac-またはT5プロモーターの調節下で右方
向に挿入するという方法で構造遺伝子を適切な発現ベク
ターにクローニングした。好ましい発現ベクターは、la
c-もしくはlacUV5プロモーターを有するpUCプラスミド
またはpKKプラスミドである。
ての構造遺伝子のクローニング Dm-dNKの発現のために、構造遺伝子を適当なプロモータ
ー、好ましくは誘導プロモーター、特に好ましくはlac
-、lacUV5-、tac-またはT5プロモーターの調節下で右方
向に挿入するという方法で構造遺伝子を適切な発現ベク
ターにクローニングした。好ましい発現ベクターは、la
c-もしくはlacUV5プロモーターを有するpUCプラスミド
またはpKKプラスミドである。
【００２３】このことに関し、構造遺伝子をDm-dNKにつ
いてのプラスミドpUC18からEcoRIおよびHindIIIによっ
て切り出し、制限調製物をアガロース電気泳動により分
離し、約750bpの断片をアガロースゲルから単離した。
同時に、発現ベクターをEcoRIおよびHindIIIで切断し、
制限調製物をアガロースゲル電気泳動により分離し、得
られたベクター断片をアガロースゲルから単離した。得
られた断片を記載されたようにしてライゲートした。遺
伝子が適切に挿入されていることは制限分析および配列
決定によって確認した。
いてのプラスミドpUC18からEcoRIおよびHindIIIによっ
て切り出し、制限調製物をアガロース電気泳動により分
離し、約750bpの断片をアガロースゲルから単離した。
同時に、発現ベクターをEcoRIおよびHindIIIで切断し、
制限調製物をアガロースゲル電気泳動により分離し、得
られたベクター断片をアガロースゲルから単離した。得
られた断片を記載されたようにしてライゲートした。遺
伝子が適切に挿入されていることは制限分析および配列
決定によって確認した。
【００２４】pUC18、pKK177-3、pKKT5も好ましい発現ベ
クターである。pKKT5が特に好ましい。発現ベクターpKK
T5は、pKK177-3（Kopetzkiら, 1989, Mol. Gen. Genet.
216:149-155）から、tac-プロモーターをプラスミドpD
S（Bujardら, 1987, Methods Enzymol. 155:416-433）
から誘導されたT5-プロモーターと交換することによっ
て得られる。EcoRI-エンドヌクレアーゼ制限部位をT5-
プロモーターの配列から点突然変異により除去した。
クターである。pKKT5が特に好ましい。発現ベクターpKK
T5は、pKK177-3（Kopetzkiら, 1989, Mol. Gen. Genet.
216:149-155）から、tac-プロモーターをプラスミドpD
S（Bujardら, 1987, Methods Enzymol. 155:416-433）
から誘導されたT5-プロモーターと交換することによっ
て得られる。EcoRI-エンドヌクレアーゼ制限部位をT5-
プロモーターの配列から点突然変異により除去した。
【００２５】種々のE.coli発現株における発現ベクター
の形質転換 種々のE.coli株のコンピテント細胞をHanahanの方法
（J. Mol. Biol. 166(1983) pp.557）にしたがって調製
した。得られた細胞200μlを単離したプラスミドDNA
（発現ベクター）20ngと混合した。30分間氷上でインキ
ュベートした後、熱ショック（42℃で90秒）を行った。
その後、細胞を１mlのLB-培地に移し、37℃にて１時間
表現型発現のためにインキュベートした。この形質転換
調製物のアリコートを選択マーカーとしてアンピシリン
を含むLBプレート上に加え、37℃で15時間インキュベー
トした。
の形質転換 種々のE.coli株のコンピテント細胞をHanahanの方法
（J. Mol. Biol. 166(1983) pp.557）にしたがって調製
した。得られた細胞200μlを単離したプラスミドDNA
（発現ベクター）20ngと混合した。30分間氷上でインキ
ュベートした後、熱ショック（42℃で90秒）を行った。
その後、細胞を１mlのLB-培地に移し、37℃にて１時間
表現型発現のためにインキュベートした。この形質転換
調製物のアリコートを選択マーカーとしてアンピシリン
を含むLBプレート上に加え、37℃で15時間インキュベー
トした。
【００２６】適切な宿主細胞はE.coli K12、JM83、JM10
1、JM105、NM522、UT5600、TG1、RR1ΔM15、E.coli HB1
01、E.coli Bである。
1、JM105、NM522、UT5600、TG1、RR1ΔM15、E.coli HB1
01、E.coli Bである。
【００２７】E.coliにおけるDm-dNKの発現 Dm-dNKクローン含有プラスミドを発現させるために、３
mlのLbamp 培地中でインキュベートし、37℃でシェーカ
ー内でインキュベートした。550nmにおける吸光度0.5で
細胞を1mM IPTGを用いて誘導し、37℃で4時間シェーカ
ー内でインキュベートした。続いて、個々の発現クロー
ンの吸光度を測定し、OD550 が3/mlであるアリコートを
採取し、細胞を遠心分離した（6000rpm、4℃で10分
間）。細胞を400μlのTE緩衝液（50mM TRIS/50mM EDT
A、pH8.0）に再懸濁し、超音波により解離させ、遠心分
離（14000rpm、4℃にて10分間）により可溶性タンパク
質画分を不溶性タンパク質画分から分離した。SDSおよ
びβ-メルカプトエタノールを含有する緩衝液を全ての
画分に加え、タンパク質を煮沸（100℃にて5分間）によ
り変性させた。その後、それぞれ10μlずつを15％分析S
DSゲルにより分析した（Laemmli U.K.(1970) Nature 22
7:555-557）。
mlのLbamp 培地中でインキュベートし、37℃でシェーカ
ー内でインキュベートした。550nmにおける吸光度0.5で
細胞を1mM IPTGを用いて誘導し、37℃で4時間シェーカ
ー内でインキュベートした。続いて、個々の発現クロー
ンの吸光度を測定し、OD550 が3/mlであるアリコートを
採取し、細胞を遠心分離した（6000rpm、4℃で10分
間）。細胞を400μlのTE緩衝液（50mM TRIS/50mM EDT
A、pH8.0）に再懸濁し、超音波により解離させ、遠心分
離（14000rpm、4℃にて10分間）により可溶性タンパク
質画分を不溶性タンパク質画分から分離した。SDSおよ
びβ-メルカプトエタノールを含有する緩衝液を全ての
画分に加え、タンパク質を煮沸（100℃にて5分間）によ
り変性させた。その後、それぞれ10μlずつを15％分析S
DSゲルにより分析した（Laemmli U.K.(1970) Nature 22
7:555-557）。
【００２８】本発明のさらなる主題は、下記の工程： −ヌクレオシドから出発して酵素として本発明のキナー
ゼを用いる酵素的リン酸化によるヌクレオシド一リン酸
の合成 −リン酸基ドナーとしてのヌクレオチド三リン酸の触媒
量での使用 −再生系（CK/CP; PK/PEP;アセチルリン酸／アシルキナ
ーゼ、ピロリン酸／ピロホスホリラーゼ）によるリン酸
基ドナーのin situ再生によってより詳細に特徴付けら
れるヌクレオシド一リン酸の製造方法である。
ゼを用いる酵素的リン酸化によるヌクレオシド一リン酸
の合成 −リン酸基ドナーとしてのヌクレオチド三リン酸の触媒
量での使用 −再生系（CK/CP; PK/PEP;アセチルリン酸／アシルキナ
ーゼ、ピロリン酸／ピロホスホリラーゼ）によるリン酸
基ドナーのin situ再生によってより詳細に特徴付けら
れるヌクレオシド一リン酸の製造方法である。
【００２９】本発明のヌクレオシド一リン酸としては、
もともとのヌクレオシド一リン酸、デオキシヌクレオシ
ド一リン酸、ジデオキシヌクレオシド一リン酸ならびに
その他の糖−および塩基−修飾ヌクレオシド一リン酸が
適用可能である。
もともとのヌクレオシド一リン酸、デオキシヌクレオシ
ド一リン酸、ジデオキシヌクレオシド一リン酸ならびに
その他の糖−および塩基−修飾ヌクレオシド一リン酸が
適用可能である。
【００３０】本発明のさらなる主題は、ヌクレオシド一
リン酸の合成における本発明のキナーゼの使用である。
リン酸の合成における本発明のキナーゼの使用である。
【００３１】
【実施例】実施例１ 組換えDmキナーゼの製造および単離 E.coli株BL21をpGEX-2Tベクター（Amersham Pharmacia
Biotec）で形質転換した。そのDmキナーゼの構造遺伝子
はCaCl2 法によってクローニングした（Sambrook, Mole
cular cloning,第二版, Cold Spring Harbor Laborator
y press）。形質転換コロニーを、50μg/mlのアンピシ
リンを含む100mlのLB培地（10mgのトリプトン、５mgの
酵母抽出物、８mgのNaCl/l）に37℃にて一晩懸濁した。
翌日、培養物をLB培地１ｌでOD 0.6に調節し、100μl I
PTGにより発現を誘導した。一晩25℃の培養温度に維持
し、細胞を遠心分離により集めた。細胞を100mlの緩衝
液Ａ（20mMのリン酸カリウム（pH7.5）、５mMのMgC
l2 、１mMのDTT、10％のグリセリン、１％のトリトンX1
00および0.1mMのフェニルスルホニルフロリド）に再懸
濁した。混合物をフレンチプレスで粉砕した。ホモジナ
イズした物質を遠心分離（20000rpm/15分）し、１μmの
Whatmanガラスマイクロフィルターおよび0.45μmの酢酸
セルロースフィルターで濾過した。
Biotec）で形質転換した。そのDmキナーゼの構造遺伝子
はCaCl2 法によってクローニングした（Sambrook, Mole
cular cloning,第二版, Cold Spring Harbor Laborator
y press）。形質転換コロニーを、50μg/mlのアンピシ
リンを含む100mlのLB培地（10mgのトリプトン、５mgの
酵母抽出物、８mgのNaCl/l）に37℃にて一晩懸濁した。
翌日、培養物をLB培地１ｌでOD 0.6に調節し、100μl I
PTGにより発現を誘導した。一晩25℃の培養温度に維持
し、細胞を遠心分離により集めた。細胞を100mlの緩衝
液Ａ（20mMのリン酸カリウム（pH7.5）、５mMのMgC
l2 、１mMのDTT、10％のグリセリン、１％のトリトンX1
00および0.1mMのフェニルスルホニルフロリド）に再懸
濁した。混合物をフレンチプレスで粉砕した。ホモジナ
イズした物質を遠心分離（20000rpm/15分）し、１μmの
Whatmanガラスマイクロフィルターおよび0.45μmの酢酸
セルロースフィルターで濾過した。
【００３２】ホモジナイズした物質をGSHカラム（15×4
5mm）にかけ、該カラムは10カラム容の緩衝液Ｂ（140mM
のNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa2HPO4 、1.8mMのKH2P
O4 、1mMのDTT、10％グリセロール、１％トリトンX10
0、0.1mMのフェニルスルホニルフロリド、５mMのベンズ
アミジン、50mMのアミノカプロン酸）で平衡化しておい
た。カラムを50床容の緩衝液Ｂおよび10容の緩衝液Ｃ
（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM NaH2PO4、1.8mM KH2PO
4 ）で洗浄し、その後融合タンパク質を、400Uのトロン
ビンを含む１カラム容の緩衝液Ｃの２時間にわたる再循
環によって分離させた。次いで、Dm-ヌクレオシドキナ
ーゼを３カラム容の緩衝液Ｃで溶出した。
5mm）にかけ、該カラムは10カラム容の緩衝液Ｂ（140mM
のNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa2HPO4 、1.8mMのKH2P
O4 、1mMのDTT、10％グリセロール、１％トリトンX10
0、0.1mMのフェニルスルホニルフロリド、５mMのベンズ
アミジン、50mMのアミノカプロン酸）で平衡化しておい
た。カラムを50床容の緩衝液Ｂおよび10容の緩衝液Ｃ
（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM NaH2PO4、1.8mM KH2PO
4 ）で洗浄し、その後融合タンパク質を、400Uのトロン
ビンを含む１カラム容の緩衝液Ｃの２時間にわたる再循
環によって分離させた。次いで、Dm-ヌクレオシドキナ
ーゼを３カラム容の緩衝液Ｃで溶出した。
【００３３】実施例２ チオールを添加した場合と添加しない場合のd-CMPの合
成の比較 d-Cyt 22mg トリス緩衝液pH8.0 2ml MgAc 10mg ATP 66mg d-NK 0.132U DTT 7mg/0mg
成の比較 d-Cyt 22mg トリス緩衝液pH8.0 2ml MgAc 10mg ATP 66mg d-NK 0.132U DTT 7mg/0mg
【００３４】収量はHPLCを用いてピーク面積の積分によ
り測定する。反応は、DTTを添加しない場合の調製では
それほど遅くはなく、特に45時間後でも終結していない
（図２参照）。
り測定する。反応は、DTTを添加しない場合の調製では
それほど遅くはなく、特に45時間後でも終結していない
（図２参照）。
【００３５】実施例３ d-GMPおよびd-AMPの合成 d-Adoまたはd-Guo 28mg 水 2ml MgAc 32mg ATP 3mg CK 100U d-NK 0.396U CP（クレアチンリン酸） 20mg
【００３６】反応は減速することなく32時間進み、収率
は80％以上であり、チオールは加える必要はない。トリ
ス緩衝液の添加は必ずしも必要ない（図３参照）。
は80％以上であり、チオールは加える必要はない。トリ
ス緩衝液の添加は必ずしも必要ない（図３参照）。
【００３７】実施例４ d-CMPの合成 d-Cyt 22mg トリス緩衝液pH8.0 2ml MgAc 32mg ATP 3mg CK 100U d-NK 0.132U CP 20mg
【００３８】66時間後でさえ、チオール安定剤を含まな
いにもかかわらず酵素は依然として活性である。収率は
ほんの触媒量のATPを用いたにもかかわらず80％である
（図４参照）。
いにもかかわらず酵素は依然として活性である。収率は
ほんの触媒量のATPを用いたにもかかわらず80％である
（図４参照）。
【００３９】実施例５ NMP、dd-NMPおよび塩基修飾d-NTPの合成 基質溶液 CP 250mg ATP 7mg 酢酸Mg 160mg 25mlの50mMトリスpH8.0中
【００４０】それぞれ0.5mlの溶液を約2.5mgの対応する
ヌクレオシドに加える。次いで、50Uのクレアチンキナ
ーゼおよび0.32Uのd-NKを加える。
ヌクレオシドに加える。次いで、50Uのクレアチンキナ
ーゼおよび0.32Uのd-NKを加える。
【００４１】
【表１】 調製 ヌクレオシド 時間 収率 ───────────────────────────────── ａ） シチジン 15時間 90％ ｂ） dd-アデノシン 70時間 40％ ｃ） Iso-グアノシン 2時間 80％
【００４２】実施例６ 種々の温度でのD.Melanogaster由来のキナーゼの活性 Dm-ヌクレオシドキナーゼの活性を種々の温度で測定し
た。Dm-ヌクレオシドキナーゼは広範な最適温度を有
し、最高は60℃である（図６参照）。活性試験は参考文
献No.14に記載されている。
た。Dm-ヌクレオシドキナーゼは広範な最適温度を有
し、最高は60℃である（図６参照）。活性試験は参考文
献No.14に記載されている。
【００４３】実施例７ 天然Dm-キナーゼと比較した組換えDm-キナーゼの活性 天然の単離されたDm-キナーゼと比較した組換えDm-キナ
ーゼの活性を測定した。50mMトリスpH7.5＋2.5mM MgCl
2 中で37℃にて種々の時間インキュベーションした後、
残留活性を測定した。
ーゼの活性を測定した。50mMトリスpH7.5＋2.5mM MgCl
2 中で37℃にて種々の時間インキュベーションした後、
残留活性を測定した。
【００４４】組換えDm-キナーゼはBSAを添加しない場合
安定であるが、天然キナーゼの活性は50分以内に＜20％
に減少する。2.5mg/mlのBSAを加えることにより、天然
キナーゼは同様に安定である（図７(A)および７(B)）。
安定であるが、天然キナーゼの活性は50分以内に＜20％
に減少する。2.5mg/mlのBSAを加えることにより、天然
キナーゼは同様に安定である（図７(A)および７(B)）。
【００４５】MgCl2 の存在下でのトリス緩衝液における
半減期は50時間であり、MgCl2 を加えない場合31時間で
あり、純水においては28時間である。天然Dm-キナーゼ
は同一条件下で半減期が＜12分である。
半減期は50時間であり、MgCl2 を加えない場合31時間で
あり、純水においては28時間である。天然Dm-キナーゼ
は同一条件下で半減期が＜12分である。
【００４６】参考文献 １．Lee, L.-S.およびY.-C. Cheng(1976) Human deoxyt
hymidine kinase, I.Purification and general proper
ties of the cytoplasmic and mitocondrialisozymes d
erived from blast cells of acute myelocytic leukem
ia, J. Biol.Chem., 251, 2600-2604。
hymidine kinase, I.Purification and general proper
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【００４７】２．Cheng, Y.-C.およびM.Ostrander(197
6) Deoxythymidine kinase inducedin HeLa TK cells b
y herpes simplex virus type I and type II. II. Pur
ification and characterization, J. Biol. Chem., 25
1, 2605-2610。
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【００４８】３．Ellims, P.H., T.E.GanおよびL. Cosg
rove(1982) Human thymidine kinase: Purification an
d some properties of the TK1 isoenzyme from placen
ta,Mol. Cell. Biochem., 45, 113-116。
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【００４９】４．Gan, T.E., J.L.BrumleyおよびM.B.Va
n Der Weyden(1983) Human thymidine kinase. Purific
ation and properties of the cytosolic enzyme of pl
acenta, J. Biol. Chem., 258, 7000-7004。
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【００５０】５．Sherley, J.L.およびT.J.Kelly(1988)
Human cytosolic thymidine kinase, Purification an
d physical characterization of the enzyme from HeL
a cells, J. Biol. Chem., 263, 375-382。
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【００５１】６．Munch-Petersen, B., L.Cloos, G.Tyr
stedおよびS.Eriksson(1991) Diverging substrate spe
scificity of pure human thymidine kinase 1 and 2 a
gainst antiviral dideoxynucleosides, J. Biol. Che
m., 266, 9032-9038。
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【００５２】７．Bohman, C.およびS.Eriksson(1988) D
eoxycytidine kinase from human leukemic spleen: Pr
eparation and characterization of the homogenous e
nzyme, Biochemistry, 27, 4258-40265。
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【００５３】８．Kierdaszuk, B.およびS.Eriksson(199
0) Selective inactivation of thedeoxyadenosine pho
sphorylating activity of pure human deoxycytidine
kinase: Stabilization of different forms of the en
zyme by substrates and biological detergents, Bioc
hemistry, 29, 4109-4144。
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【００５４】９．Kristensen, T. Quantification of t
hymidine kinase (TK1) mRNA in normal and leukemic
cells and investigation of structure-function rela
tionship of recombinant TK1 enzyme, 1996, Departme
nt of Life Sciences and Chemistry, Roskilde Univer
sity, Denmark, Ref Type: Thesis/Dissertation, Avai
lable at Roskilde University Library。
hymidine kinase (TK1) mRNA in normal and leukemic
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【００５５】10．Hanahan D.(1983) J. Mol. Biol. 16
6:557。 11. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T.,(1989)
Molecular cloning: ALaboratory Manual second Editi
on, B.27 Cold Spring Harbor Laboratory Press NY(US
A)。
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【００５６】12. Mullis, K.B.およびFaloona, F.A.(19
87) Methods in Enzymol. 155:335-350。 13. Munch-Peterson B., Piskur J.およびSondergaard
L.(1998) J. Biol.Chem. 273, 3926-3931。 14. Laemmli U.K.(1970) Nature 227:pp.555-557。
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L.(1998) J. Biol.Chem. 273, 3926-3931。 14. Laemmli U.K.(1970) Nature 227:pp.555-557。
【００５７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH <120> Deoxynucleoside kinase from insect cells for thesynthesis of nucle oside monophosphates <130> PA99-329 <140> <141> <150> DE 198 46 838.5 <151> 1998-10-12 <150> DE 199 14 644.6 <151> 1999-03-31 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 753 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 1 atggcggagg cagcatcctg tgcccgaaag gggaccaagt acgccgaggg cacccagccc 60 ttcaccgtcc tcatcgaggg caacatcggc agcgggaaga ccacgtattt gaaccacttc 120 gagaagtaca agaacgacat ttgcctgctg accgagcccg tcgagaagtg gcgcaacgtc 180 aacggggtaa atctgctgga gctgatgtac aaagatccca agaagtgggc catgcccttt 240 cagagttatg tcacgctgac catgctgcag tcgcacaccg ccccaaccaa caagaagcta 300 aaaataargg agcgctccat ttttagcgct cgctattgct tcgtggagaa catgcgacga 360 aacggctcgc tggagcaggg catgtacaat acgctggagg agtggtacaa gttcatcgaa 420 gagtccattc acctgcaggc ggacctcatc atatatctgc gcacctcgcc ggaggtggcg 480 tacgaacgca tccggcagcg ggctcgttct gaggagagct gcgtgccgct taagtacctt 540 caggagctgc atgagttgca ccaggactgg ttgatacacc agagacgacc gcagtcgtgc 600 aaggtcctag tcctcgatgc cgatctgaac ctggaaaaca ttggcaccga gtaccagcgc 660 tcggagagca gcatattcga cgccatctca agtaaccaac agccctcgcc ggttcgtgtg 720 tcgcccagca agcgccagag ggtcgccaga taa 753 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gggaagtggc aggagtagct cccg 24 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 ctcccgttgt agccgtcgcc cttctgg 27 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 gacgactggc tcgggcagct cttcaccgcg ttg 33 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 ttcgattttt attacctcgc gaggtaa 27 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 aggtaaaaat cgcgagcgat aacgaagcac 30 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 caccgcatgc ttgcgtaggc cgtcgcccga gcaagactcc tc 42 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 gactacatgt ttctagggtt cttcacc 27 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 tcccaatctc acgtgcagat c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 ttcatcgaag agtccattca c 21 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 gcgcgaattc atggcggagg cagcatcctg tgc 33 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 gcgcaagctt attatctggc gaccctctgg c 31 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 13 cgcgaattca tggcggaagc ggcgagctgc gcgcgtaagg ggacc 45 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 14 cgcaagctta ttaacgggcg accctctggc 30
【００５８】
配列番号２：合成ＤＮＡ 配列番号３：合成ＤＮＡ 配列番号４：合成ＤＮＡ 配列番号５：合成ＤＮＡ 配列番号６：合成ＤＮＡ 配列番号７：合成ＤＮＡ 配列番号８：合成ＤＮＡ 配列番号９：合成ＤＮＡ 配列番号10：合成ＤＮＡ 配列番号11：合成ＤＮＡ 配列番号12：合成ＤＮＡ 配列番号13：合成ＤＮＡ 配列番号14：合成ＤＮＡ
【図１】種々のヌクレオシドキナーゼの速度定数を示す
（hTK1/2=ヒトチミジンキナーゼ1/2; hdCK=ヒトデオキ
シ−シチジンキナーゼ; hdGK=ヒトデオキシ−グアノシ
ンキナーゼ; HSV=単純ヘルペスウイルス）。データは ａ）Munch Petersenら, J. Biol. Chem. 266, 9032(199
1); J. Biol. Chem. 268, 15621(1993), ｂ）Biochem. Biophys. Acta 1250, 158(1995), ｃ）BohmannおよびEriksson Biochemistry, 27 4258(19
88), ｄ）Wangら, J. Biol. Chemistry 268, 22847(1993), ｅ）Iwatsukiら. J. Mol. Biol. 29, 155(1967), ｆ）Blackら, J. Gen. Virology 77, 1521(1996), ｇ）Maら, P.N.A.S. 93, 14385(1996) から採用したものである。
（hTK1/2=ヒトチミジンキナーゼ1/2; hdCK=ヒトデオキ
シ−シチジンキナーゼ; hdGK=ヒトデオキシ−グアノシ
ンキナーゼ; HSV=単純ヘルペスウイルス）。データは ａ）Munch Petersenら, J. Biol. Chem. 266, 9032(199
1); J. Biol. Chem. 268, 15621(1993), ｂ）Biochem. Biophys. Acta 1250, 158(1995), ｃ）BohmannおよびEriksson Biochemistry, 27 4258(19
88), ｄ）Wangら, J. Biol. Chemistry 268, 22847(1993), ｅ）Iwatsukiら. J. Mol. Biol. 29, 155(1967), ｆ）Blackら, J. Gen. Virology 77, 1521(1996), ｇ）Maら, P.N.A.S. 93, 14385(1996) から採用したものである。
【図２】実施例２に記載した条件下でのシチジンからの
d-CMPの生成を示す。
d-CMPの生成を示す。
【図３】実施例４に記載した条件下でのアデノシンから
のd-AMP、グアノシンからのd-GMPの生成を示す。
のd-AMP、グアノシンからのd-GMPの生成を示す。
【図４】実施例３に記載した条件下でのシチジンからの
d-CMPの生成を示す。
d-CMPの生成を示す。
【図５】クローンのDNA配列を示す。
【図６】D.Melanogaster由来のヌクレオシドキナーゼの
最適温度を示す。
最適温度を示す。
【図７】単離されたDm-ヌクレオシドキナーゼと比較し
た組換えDm-ヌクレオシドキナーゼの安定性を示す。(A)
はBSAを添加することなく測定したものであり、(B)はBS
Aを添加して測定したものである。
た組換えDm-ヌクレオシドキナーゼの安定性を示す。(A)
はBSAを添加することなく測定したものであり、(B)はBS
Aを添加して測定したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブリジット ミュンヒ−ピーターセン デンマーク国 ディーケー−3520ファル ム，バフネブジェルクシュパルク 36 (72)発明者 ジュル ピスクル デンマーク国 ディーケー−2100コペンハ ーゲン，ルドルフ ベルクスガード 22 (72)発明者 ライフ ソンダーガート デンマーク国 ディーケー−2820ゲントフ ト，ヴァンゲデベユ 39
Claims (14)
- 【請求項１】 ヌクレオシド一リン酸の合成中に、安定
化SH試薬を加えることなく、タンパク質を安定化するこ
となく安定であり、そして４種の天然デオキシヌクレオ
シド全てを受け入れる、非脊椎動物生物の細胞から取得
可能な組換えキナーゼ。 - 【請求項２】 昆虫細胞から取得可能な請求項１に記載
の組換えキナーゼ。 - 【請求項３】 ４種の天然デオキシヌクレオシド全てに
対して少なくとも20U/mg（1U＝1μmol/分）の特異的活
性を示す精製状態にある請求項１または２に記載の組換
えキナーゼ。 - 【請求項４】 全ての天然デオキシヌクレオシドに対し
て＞10000M-1s-1の特異性定数kc/Km を示す、請求項１
〜３のいずれか１項に記載の組換えキナーゼ。 - 【請求項５】 キナーゼが、37℃において、5mM MgCl2
を含むトリス緩衝液中でt1/2 ≧50時間、水中でt1/2 ≧
25時間の半減期を有するものである、請求項１〜４のい
ずれか１項に記載の組換えキナーゼ。 - 【請求項６】 40〜60℃の広範な最適温度を示す、請求
項１〜５のいずれか１項に記載の組換えキナーゼ。 - 【請求項７】 Drosophila Melanogasterから取得可能
な請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えキナー
ゼ。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載のDr
osophila Melanogaster由来のキナーゼをコードするDNA
配列。 - 【請求項９】 配列番号２〜８の配列がそのDNA配列上
にハイブリダイズするものである、請求項８に記載のDN
A配列。 - 【請求項１０】 請求項８または９に記載のDNA配列お
よびプロモーターを含むベクター。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載のベクターで形質転
換された宿主。 - 【請求項１２】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の
組換えキナーゼの製造方法であって、下記工程： １）Dm-dNKのコード配列を単離すること、 ２）誘導プロモーターを有するE.coli用の好ましい発現
ベクターに構造遺伝子をクローニングすること、 ３）好ましいE.coli宿主株における発現ベクターを形質
転換すること、および ４）適切な誘導によってE.coliにおいてDm-dNK遺伝子を
発現させること を行うものである、前記製造方法。 - 【請求項１３】 ヌクレオシド一リン酸の合成に対す
る、請求項１〜７のいずれか１項に記載のDrosophila M
elanogasterから取得可能な組換えキナーゼの使用。 - 【請求項１４】 請求項１〜７のいずれか１項に記載の
組換えキナーゼがヌクレオシドのリン酸化に使用される
ものである、ヌクレオシド一リン酸の製造方法。
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2003
- 2003-10-07 US US10/680,635 patent/US7625735B2/en not_active Expired - Lifetime
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