CN104694663A - Brca基因易感snp位点检测组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了BRCA基因易感SNP位点检测组合物，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物包括SEQ NO：1～SEQ NO：448的引物。本发明能够一次检测BRCA基因两千多个易感SNP位点，对乳腺癌及卵巢癌相关易感SNP位点具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对结乳腺癌和卵巢癌易感人群，尤其是具有这两种癌症家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。

Description

BRCA基因易感SNP位点检测组合物
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及BRCA基因SNPA位点检测的组合物。
背景技术
乳腺癌是一种严重影响妇女身体健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，其发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在妇女中仅次于子宫癌。乳腺癌的发病常与遗传有关，另外，40-60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高。
乳腺癌可分为散发性和遗传性两大类。其中遗传性乳腺癌约占乳癌发病率的5％-10％。乳腺癌易感基因BRCA1(the first familial breastand ovarian cancer susceptibility gene)和BRCA2(the second familialbreast cancer susceptibility gene)存在可遗传突变，BRCA1或BRCA2突变基因携带者一生中患乳腺癌的危险性估计为90％。此外，BRCA1和BRCA2的突变也和卵巢癌有关。不论有无家族史还是发病年龄，所有卵巢癌中2-6％有BRCA1的突变，3-4％有BRCA2的突变。因此，筛选BRCA基因的突变也来越受到研究者的关注。
BRCA1和BRCA2基因分别定位于17q12-21和13q12-13，编码序列分别为5711bp和10987bp，其表达有一定的组织特异性。BRCA1和BRCA2蛋白分别由1863个氨基酸和3418个氨基酸组成，这两个蛋白都具有Granin蛋白的某些特征。BRCA1/2是两种具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用。拥有这个基因突变的家族倾向于具有高乳腺癌发生率，通常发生在较年轻时，病人的两侧乳房都患癌，且同时患有卵巢癌。如果BRCA1/2基因的结构发生了某些改变，那么它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受影响。截止2013年，已发现的BRCA1/2的突变有数百种之多。有学者总结了BRCA1和BRCA2基因突变相关的癌症的终身风险，显示有BRCA1基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％～85％和15％～45％，有BRCA2基因突变者，患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％～85％和10％～20％。
通过对BRCA1/2的检测，可以反映乳腺癌的发生发展，也可筛检出乳腺癌、卵巢癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗。
目前，普遍应用的BRCA基因突变检测方法主要有以下几种：荧光定量PCR技术，该技术灵敏度高、特异性强、自动化程度高，但是会存在样品污染、假阳性高的情况，并且每次只能检测一种类型。限制小片段长度多态性分析法(RFLP发)用于检测酶切位点改变的基因，可直接判断基因型，但是不能用于没有产生新酶切位点的基因检测；此外，RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高，假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA一代测序法，两端靠近引物的序列容易测不准，且测序周期较长，操作复杂，易于污染，成本昂贵，所以该方法很难满足实际应用的需要。
因此，急需能够相对方便、快捷、检测周期短、针对性强、检测结果准确可靠的检测手段。
发明内容
为达到上述目的，本发明提供一种BRCA基因热点SNP位点检测组合物，该组合物检测通量高且灵敏度特异性强，一次检测能够覆盖2000多个热点SNP位点。
本发明的技术方案是：BRCA基因易感SNP位点检测组合物，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物包括SEQ NO：1～SEQ NO：448的引物；
所述SEQ NO：1～SEQ NO：448的引物序列见表1。
优选的，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物的组成是：Master Mix 11μl、包含所述SEQ NO：1～SEQ NO：448引物的引物panel 5.5μl、待测DNA样品4.5μl。
所述SEQ NO：1～SEQ NO：448引物在引物panel的浓度均为100nM。
所述Master Mix组成为：PCR buffer(5×)4μl、MgCl21.5μl、Taq酶1.5μl、ddH2O 4μl。
优选的，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物的PCR反应条件为：92～97℃预变性3～10分钟，聚合酶链式反应扩增阶段：92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～20s，并进行10～15个循环。
待测DNA样品采用多重PCR酶进行扩增后构建文库与上机质控品一起进行大规模平行测序(二代测序)，仪器获得的结果经数据处理和生物信息学分析，得出样本中含有的SNP位点等信息。
所述质控品为加入的1％control particles。是一种商品化试剂，包含在上机测序的试剂盒PGM Sequencing OT2kit中，作为上机测序实验的内参，对测序情况进行评估和质控，如果测序结果中不包含1％的control particles结果，说明上机实验失败，结果不可靠。
所述待测DNA样品为人类基因组DNA。
多重PCR过程同时进行阴性对照实验，所用阴性样本为正常人基因组DNA。
待测DNA样品为人类细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。
本发明的检测基因为BRCA1、BRCA2基因，包括其全部外显子和部分内含子中热点SNP位点(见表2)。
本发明所称的BRCA基因包含BRCA1和BRCA2基因的所有外显子和部分内含子易感SNP位点，包括BRCA1基因位点chr17：41219666(rs80357862)，BRCA2基因chr13：32888473(rs206115)等2007个易感SNP位点(表2)。
本发明组合物中的引物是针对BRCA1和BRCA2基因易感SNP位点可能的某一段序列进行设计。引物经优化设计和修饰后，偏向性扩增的程度降低，各引物之间相互干扰性小，特异性强，扩增效果好。这些引物以混合物形式溶解于一管中，在实验中同时加入。
测序反应体系的组成为：DNA模板多重PCR反应、模板文库构建、上机模板准备和富集反应、上机测序反应和测试数据处理分析。
上机模板准备和富集反应过程包括模板油包水扩增和阳性模板富集，所述两个过程中试剂组成包括Ion PGM Beads、PGM TemplateOT2Solutions、1％control particle等、仪器组成主要包含Ion OneTouch和Ion OneTouch ES。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与Ion Torrent二代测序平台相配套，包括PGM Template OT2kit、PGMSequencing OT2kit、Ion 318chip等部分。上机反应获得的数据结果通过序列筛选、拼接和比对等方法以及生物信息学分析，最终获得测试样本的SNP位点信息。
上机测序反应过程包括PGM测序反应过程，其原理是利用半导体技术来检测合成过程中核苷酸掺入时释放的质子，以此测定DNA的碱基序列。
模板文库构建过程包括末端补平修复、末端连接测序接头、模板扩增和纯化，所述反应体系中包含0.2-1U末端补平酶、0.2-1U连接酶、0.2-1U扩增Taq酶、10-50mM测序接头A和P1、10-20mM测序接头A和P1通用引物、1-10×Buffer和0.2-1.8×Ampure纯化磁珠等试剂。
所述检测结果数据处理、生物信息学分析得出检测基因的特定SNP位点情况。
测试数据处理分析包括测序数据的转换、拼接、质控和突变位点分析等过程，通过数据的处理最终获得检测样本SNP位点的信息。
本发明具备检测通量高、灵敏度高、特异性高的特性，灵敏度可以达到0.01％，样本的DNA浓度可以低至0.1-1ng/μl。
SEQ NO：1～SEQ NO：448的引物序列如表1所示。
表1 BRCA基因易感SNP位点检测引物序列
测试数据处理分析包括测序数据的转换、拼接、质控和突变位点分析等过程，通过数据的处理最终获得检测样本SNP位点的信息。
所述检测基因为BRCA1和BRCA2基因，本发明待检测易感SNP位点如下：
表2 BRCA1和BRCA2基因易感SNP位点
Gene Location RS_ID Gene Location RS_ID Gene Location RS_ID
BRCA1 chr17：41245027 rs1800709 BRCA1 chr17：41243954 rs80357562 BRCA2 chr13：32914708 rs80359567
BRCA1 chr17：41215969 rs1800747 BRCA1 chr17：41242984 rs80357565 BRCA2 chr13：32914711 rs80359568
BRCA1 chr17：41244429 rs4986852 BRCA1 chr17：41256181 rs80357568 BRCA2 chr13：32914730 rs80359569
BRCA1 chr17：41258504 rs28897672 BRCA1 chr17：41246224 rs80357570 BRCA2 chr13：32914732 rs80359570
BRCA1 chr17：41243800 rs28897686 BRCA1 chr17：41242980 rs80357572 BRCA2 chr13：32914865 rs80359577
BRCA1 chr17：41215920 rs28897696 BRCA1 chr17：41244150 rs80357577 BRCA2 chr13：32914865 rs80359578
BRCA1 chr17：41245285 rs41286296 BRCA1 chr17：41243778 rs80357579 BRCA2 chr13：32890660 rs80359582
BRCA1 chr17：41234451 rs41293455 BRCA1 chr17：41243706 rs80357584 BRCA2 chr13：32914923 rs80359587
BRCA1 chr17：41215947 rs41293459 BRCA1 chr17：41243918 rs80357589 BRCA2 chr13：32914936 rs80359590
BRCA1 chr17：41215390 rs41293461 BRCA1 chr17：41245470 rs80357595 BRCA2 chr13：32914942 rs80359595
BRCA1 chr17：41203088 rs41293463 BRCA1 chr17：41246207 rs80357597 BRCA2 chr13：32914982 rs80359599
BRCA1 chr17：41197784 rs41293465 BRCA1 chr17：41245294 rs80357602 BRCA2 chr13：32915027 rs80359601
BRCA1 chr17：41209139 rs45553935 BRCA1 chr17：41244943 rs80357603 BRCA2 chr13：32915045 rs80359603
BRCA1 chr17：41245759 rs55650082 BRCA1 chr17：41215940 rs80357608 BRCA2 chr13：32915083 rs80359606
BRCA1 chr17：41215948 rs55770810 BRCA1 chr17：41246567 rs80357610 BRCA2 chr13：32915130 rs80359612
BRCA1 chr17：41258494 rs55851803 BRCA1 chr17：41244627 rs80357611 BRCA2 chr13：32915133 rs80359613
BRCA1 chr17：41245333 rs56329598 BRCA1 chr17：41244539 rs80357617 BRCA2 chr13：32915135 rs80359614
BRCA1 chr17：41246077 rs62625303 BRCA1 chr17：41276040 rs80357633 BRCA2 chr13：32915136 rs80359615
BRCA1 chr17：41245159 rs62625306 BRCA1 chr17：41244319 rs80357635 BRCA2 chr13：32915170 rs80359620
BRCA1 chr17：41243950 rs62625307 BRCA1 chr17：41244862 rs80357636 BRCA2 chr13：32915174 rs80359621
BRCA1 chr17：41243941 rs62625308 BRCA1 chr17：41223181 rs80357641 BRCA2 chr13：32915301 rs80359625
BRCA1 chr17：41246540 rs67284603 BRCA1 chr17：41276048 rs80357642 BRCA2 chr13：32920967 rs80359628
BRCA1 chr17：41219625 rs80187739 BRCA1 chr17：41245587 rs80357643 BRCA2 chr13：32905070 rs80359630
BRCA1 chr17：41244980 rs80356832 BRCA1 chr17：41246625 rs80357644 BRCA2 chr13：32905074 rs80359633
BRCA1 chr17：41209069 rs80356854 BRCA1 chr17：41243786 rs80357645 BRCA2 chr13：32929022 rs80359635
BRCA1 chr17：41242961 rs80356857 BRCA1 chr17：41243646 rs80357646 BRCA2 chr13：32929146 rs80359639
BRCA1 chr17：41215926 rs80356860 BRCA1 chr17：41234582 rs80357649 BRCA2 chr13：32929216 rs80359643
BRCA1 chr17：41223063 rs80356862 BRCA1 chr17：41245337 rs80357654 BRCA2 chr13：32929350 rs80359646
BRCA1 chr17：41258525 rs80356864 BRCA1 chr17：41222986 rs80357655 BRCA2 chr13：32930572 rs80359652
BRCA1 chr17：41243707 rs80356866 BRCA1 chr17：41245264 rs80357657 BRCA2 chr13：32905122 rs80359654
BRCA1 chr17：41199678 rs80356868 BRCA1 chr17：41245136 rs80357664 BRCA2 chr13：32930654 rs80359656
BRCA1 chr17：41244627 rs80356872 BRCA1 chr17：41246446 rs80357665 BRCA2 chr13：32930672 rs80359657
BRCA1 chr17：41197751 rs80356873 BRCA1 chr17：41243841 rs80357666 BRCA2 chr13：32930672 rs80359658
BRCA1 chr17：41245390 rs80356875 BRCA1 chr17：41246652 rs80357670 BRCA2 chr13：32930685 rs80359660
BRCA1 chr17：41219652 rs80356879 BRCA1 chr17：41243631 rs80357678 BRCA2 chr13：32905129 rs80359661
BRCA1 chr17：41226471 rs80356881 BRCA1 chr17：41244259 rs80357686 BRCA2 chr13：32930722 rs80359665
BRCA1 chr17：41226499 rs80356885 BRCA1 chr17：41246594 rs80357690 BRCA2 chr13：32931888 rs80359668
BRCA1 chr17：41256190 rs80356888 BRCA1 chr17：41243023 rs80357691 BRCA2 chr13：32931950 rs80359674
BRCA1 chr17：41245549 rs80356889 BRCA1 chr17：41244676 rs80357693 BRCA2 chr13：32931980 rs80359676
BRCA1 chr17：41246196 rs80356891 BRCA1 chr17：41245158 rs80357695 BRCA2 chr13：32932022 rs80359678
BRCA1 chr17：41245936 rs80356893 BRCA1 chr17：41226427 rs80357699 BRCA2 chr13：32932023 rs80359679
BRCA1 chr17：41215963 rs80356896 BRCA1 chr17：41245142 rs80357706 BRCA2 chr13：32932052 rs80359681
BRCA1 chr17：41245861 rs80356898 BRCA1 chr17：41251853 rs80357708 BRCA2 chr13：32936701 rs80359685
BRCA1 chr17：41243830 rs80356903 BRCA1 chr17：41215951 rs80357710 BRCA2 chr13：32936788 rs80359688
BRCA1 chr17：41245927 rs80356904 BRCA1 chr17：41234492 rs80357716 BRCA2 chr13：32936808 rs80359689
BRCA1 chr17：41245603 rs80356907 BRCA1 chr17：41244840 rs80357717 BRCA2 chr13：32937368 rs80359691
BRCA1 chr17：41246490 rs80356908 BRCA1 chr17：41246696 rs80357719 BRCA2 chr13：32937397 rs80359692
BRCA1 chr17：41258473 rs80356913 BRCA1 chr17：41246749 rs80357724 BRCA2 chr13：32937406 rs80359693
BRCA1 chr17：41197776 rs80356914 BRCA1 chr17：41246645 rs80357726 BRCA2 chr13：32937426 rs80359695
BRCA1 chr17：41246215 rs80356915 BRCA1 chr17：41243506 rs80357727 BRCA2 chr13：32937469 rs80359696
BRCA1 chr17：41243908 rs80356923 BRCA1 chr17：41267793 rs80357728 BRCA2 chr13：32937558 rs80359697
BRCA1 chr17：41244945 rs80356925 BRCA1 chr17：41215365 rs80357730 BRCA2 chr13：32937592 rs80359704
BRCA1 chr17：41245801 rs80356928 BRCA1 chr17：41256895 rs80357738 BRCA2 chr13：32937636 rs80359705
BRCA1 chr17：41276061 rs80356929 BRCA1 chr17：41242963 rs80357742 BRCA2 chr13：32937661 rs80359706
BRCA1 chr17：41228617 rs80356932 BRCA1 chr17：41246850 rs80357747 BRCA2 chr13：32944550 rs80359708
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BRCA1 chr17：41256277 rs80356936 BRCA1 chr17：41197807 rs80357757 BRCA2 chr13：32944643 rs80359710
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BRCA1 chr17：41228562 rs397507231 BRCA2 chr13：32911946 rs80359385 BRCA2 chr13：32915150 rs80359618
BRCA1 chr17：41251873 rs397507236 BRCA2 chr13：32911950 rs80359386 BRCA2 chr13：32915321 rs80359626
BRCA1 chr17：41219631 rs397507239 BRCA2 chr13：32912062 rs80359390 BRCA2 chr13：32915325 rs80359627
BRCA1 chr17：41201158 rs397507249 BRCA2 chr13：32890633 rs80359393 BRCA2 chr13：32921016 rs80359631
BRCA1 chr17：41197709 rs397507254 BRCA2 chr13：32912130 rs80359394 BRCA2 chr13：32921029 rs80359632
BRCA1 chr17：41245596 rs397508922 BRCA2 chr13：32912177 rs80359397 BRCA2 chr13：32905141 rs80359671
BRCA1 chr17：41245351 rs397508949 BRCA2 chr13：32912181 rs80359398 BRCA2 chr13：32905145 rs80359675
BRCA1 chr17：41245307 rs397508953 BRCA2 chr13：32890633 rs80359399 BRCA2 chr13：32936764 rs80359686
BRCA1 chr17：41244954 rs397508984 BRCA2 chr13：32912209 rs80359401 BRCA2 chr13：32936767 rs80359687
BRCA1 chr17：41244865 rs397508997 BRCA2 chr13：32912229 rs80359402 BRCA2 chr13：32953959 rs80359741
BRCA1 chr17：41244743 rs397509012 BRCA2 chr13：32912329 rs80359404 BRCA2 chr13：32907409 rs276174813
BRCA1 chr17：41244593 rs397509027 BRCA2 chr13：32912346 rs80359406 BRCA2 chr13：32907411 rs276174814
BRCA1 chr17：41244269 rs397509050 BRCA2 chr13：32912352 rs80359409 BRCA2 chr13：32912550 rs397507322
BRCA1 chr17：41243496 rs397509132 BRCA2 chr13：32912352 rs80359411 BRCA2 chr13：32912897 rs397507331
BRCA1 chr17：41243476 rs397509136 BRCA2 chr13：32912403 rs80359415 BRCA2 chr13：32914825 rs397507369
BRCA1 chr17：41234577 rs397509151 BRCA2 chr13：32912411 rs80359416 BRCA2 chr13：32906441 rs397507400
BRCA1 chr17：41222940 rs397509211 BRCA2 chr13：32890600 rs80359418 BRCA2 chr13：32911718 rs397507659
BRCA1 chr17：41215931 rs397509228 BRCA2 chr13：32912540 rs80359422 BRCA2 chr13：32914884 rs398122555
BRCA1 chr17：41215889 rs397509231 BRCA2 chr13：32912568 rs80359424 BRCA2 chr13：32918712 rs398122568
BRCA1 chr17：41201213 rs397509264 BRCA2 chr13：32899303 rs80359425 BRCA2 chr13：32911184 rs398122752
BRCA1 chr17：41201203 rs397509268 BRCA2 chr13：32899306 rs80359427 BRCA2 chr13：32910963 rs276174823
BRCA1 chr17：41199682 rs397509284 BRCA2 chr13：32912622 rs80359428 BRCA2 chr13：32913223 rs276174846
BRCA1 chr17：41197746 rs397509295 BRCA2 chr13：32912661 rs80359433 BRCA2 chr13：32936775 rs276174897
BRCA1 chr17：41267798 rs397509326 BRCA2 chr13：32912680 rs80359434 BRCA2 chr13：32929175 rs397507383
BRCA1 chr17：41246455 rs398122627 BRCA2 chr13：32912750 rs80359436 BRCA2 chr13：32911076 rs80359336
BRCA1 chr17：41246256 rs398122629 BRCA2 chr13：32912763 rs80359437 BRCA2 chr13：32911078 rs80359337
BRCA1 chr17：41246221 rs398122630 BRCA2 chr13：32912768 rs80359438 BRCA2 chr13：32913709 rs80359496
BRCA1 chr17：41246212 rs398122631 BRCA2 chr13：32912775 rs80359439 BRCA2 chr13：32914772 rs80359572
BRCA1 chr17：41246187 rs398122632 BRCA2 chr13：32912776 rs80359440 BRCA2 chr13：32914503 rs397507362
BRCA1 chr17：41258544 rs398122635 BRCA2 chr13：32912806 rs80359441 BRCA2 chr13：32913709 rs80359497
BRCA1 chr17：41246036 rs398122636 BRCA2 chr13：32912831 rs80359443 BRCA2 chr13：32914774 rs80359573
BRCA1 chr17：41245920 rs398122640 BRCA2 chr13：32912915 rs80359447 BRCA2 chr13：32954002 rs80359746
BRCA1 chr17：41245804 rs398122641 BRCA2 chr13：32912941 rs80359448 BRCA2 chr13：32914926 rs397507371
BRCA1 chr17：41245789 rs398122642 BRCA2 chr13：32912970 rs80359453 BRCA2 chr13：32906506 rs276174914
BRCA1 chr17：41245673 rs398122646 BRCA2 chr13：32913038 rs80359456 BRCA2 chr13：32929402 rs80359649
BRCA1 chr17：41245627 rs398122650 BRCA2 chr13：32913046 rs80359458 BRCA2 chr13：32937539 rs398122599
BRCA1 chr17：41245162 rs398122657 BRCA2 chr13：32913123 rs80359460 BRCA2 chr13：32911422 rs80359364
BRCA1 chr17：41256936 rs398122661 BRCA2 chr13：32913123 rs80359461 BRCA2 chr13：32953647 rs276174915
BRCA1 chr17：41244894 rs398122663 BRCA2 chr13：32913130 rs80359462 BRCA2 chr13：32915235 rs80359622
BRCA1 chr17：41244862 rs398122664 BRCA2 chr13：32913289 rs80359465 BRCA2 chr13：32914312 rs80359539
BRCA1 chr17：41244800 rs398122667 BRCA2 chr13：32913300 rs80359466 BRCA2 chr13：32930725 rs80359667
BRCA1 chr17：41244774 rs398122669 BRCA2 chr13：32913396 rs80359471 BRCA2 chr13：32971074 rs397508062
BRCA1 chr17：41244344 rs398122673 BRCA2 chr13：32913427 rs80359472 BRCA2 chr13：32913762 rs80359502
BRCA1 chr17：41243876 rs398122677 BRCA2 chr13：32913457 rs80359475 BRCA2 chr13：32912864 rs80358672
BRCA1 chr17：41243454 rs398122681 BRCA2 chr13：32913527 rs80359477 BRCA2 chr13：32972884 rs1801426
BRCA1 chr17：41234424 rs398122685 BRCA2 chr13：32913565 rs80359480 BRCA2 chr13：32888021 rs9534160
BRCA1 chr17：41226530 rs398122687 BRCA2 chr13：32913565 rs80359481 BRCA2 chr13：32888473 rs206115
BRCA1 chr17：41215971 rs398122690 BRCA2 chr13：32913650 rs80359489 BRCA2 chr13：32889363 rs3092989
BRCA1 chr17：41215357 rs398122692 BRCA2 chr13：32913672 rs80359491 BRCA2 chr13：32889792 rs206118
BRCA1 chr17：41197821 rs398122699 BRCA2 chr13：32900637 rs80359492 BRCA2 chr13：32890026 rs9562605
BRCA1 chr17：41247862 rs398122706 BRCA2 chr13：32913730 rs80359499 BRCA2 chr13：32891706 rs206120
BRCA1 chr17：41246612 rs398122709 BRCA2 chr13：32913843 rs80359508 BRCA2 chr13：32893791 rs9534174
BRCA1 chr17：41267747 rs431825385 BRCA2 chr13：32913843 rs80359509 BRCA2 chr13：32900149 rs3783265
BRCA1 chr17：41246114 rs431825386 BRCA2 chr13：32913946 rs80359513 BRCA2 chr13：32900933 rs3752451
BRCA1 chr17：41256212 rs431825397 BRCA2 chr13：32913958 rs80359514 BRCA2 chr13：32908629 rs1029304
BRCA1 chr17：41243789 rs431825398 BRCA2 chr13：32913963 rs80359515 BRCA2 chr13：32920618 rs206079
BRCA1 chr17：41242959 rs431825406 BRCA2 chr13：32913984 rs80359517 BRCA2 chr13：32921536 rs11571684
BRCA1 chr17：41199657 rs431825417 BRCA2 chr13：32914018 rs80359518 BRCA2 chr13：32921944 rs9567578
BRCA1 chr17：41215945 rs483353099 BRCA2 chr13：32914034 rs80359519 BRCA2 chr13：32922136 rs206081
BRCA1 chr17：41251875 rs483353104 BRCA2 chr13：32914173 rs80359527 BRCA2 chr13：32926944 rs721185
BRCA1 chr17：41215890 rs587776491 BRCA2 chr13：32914216 rs80359532 BRCA2 chr13：32927894 rs9943876
BRCA1 chr17：41244518 rs80357510 BRCA2 chr13：32914255 rs80359534 BRCA2 chr13：32928202 rs9943888
BRCA1 chr17：41245210 rs80357515 BRCA2 chr13：32914315 rs80359540 BRCA2 chr13：32942956 rs3837580
BRCA1 chr17：41245670 rs80357516 BRCA2 chr13：32914320 rs80359541 BRCA2 chr13：32944056 rs9634672
BRCA1 chr17：41243788 rs80357520 BRCA2 chr13：32914349 rs80359545 BRCA2 chr13：32951111 rs3764791
BRCA1 chr17：41244218 rs80357525 BRCA2 chr13：32914355 rs80359546 BRCA2 chr13：32951115 rs3764792
BRCA1 chr17：41243035 rs80357529 BRCA2 chr13：32914423 rs80359548 BRCA2 chr13：32956757 rs206146
BRCA1 chr17：41226489 rs80357534 BRCA2 chr13：32914438 rs80359550 BRCA2 chr13：32959199 rs2238162
BRCA1 chr17：41276043 rs80357536 BRCA2 chr13：32914493 rs80359553 BRCA2 chr13：32959240 rs11571789
BRCA1 chr17：41244804 rs80357540 BRCA2 chr13：32914516 rs80359554 BRCA2 chr13：32959534 rs542551
BRCA1 chr17：41244889 rs80357541 BRCA2 chr13：32914563 rs80359556 BRCA2 chr13：32959839 rs2238163
BRCA1 chr17：41226397 rs80357542 BRCA2 chr13：32914595 rs80359559 BRCA2 chr13：32963947 rs11571805
BRCA1 chr17：41246221 rs80357543 BRCA2 chr13：32900729 rs80359560 BRCA2 chr13：32965310 rs206340
BRCA1 chr17：41245157 rs80357546 BRCA2 chr13：32914621 rs80359561 BRCA2 chr13：32970031 rs1012130
BRCA1 chr17：41244494 rs80357547 BRCA2 chr13：32914646 rs80359562 BRCA2 chr13：32970586 rs517118
BRCA1 chr17：41258518 rs80357550 BRCA2 chr13：32914670 rs80359563 BRCA2 chr13：32970736 rs1012129
BRCA1 chr17：41245291 rs80357557 BRCA2 chr13：32914693 rs80359565 BRCA2 chr13：32973012 rs15869
本发明具有以下优点：(1)特异性强：针对特定SNP设计的引物，获得BRCA基因特定位置附近的全部碱基序列，特异性极强；(2)灵敏度高，检测灵敏度达到0.01％；(3)检测通量高，一次反应可以检测两千多个位点；(4)结果判读明确客观，检测结果直接反映碱基序列，判读结果更直观明确；(5)安全，整个体系不包含有毒有害物质，对试验人员以及环境都无危害。
本发明全面综合了对乳腺癌及卵巢癌具有检测意义的相关易感SNP位点，对各引物的序列以及实验反应体系进行优化，显示出检测能力的强大优势，不仅使得检测简单易行，而且具有较高的准确度、特异性以及可重复性，对乳腺癌及卵巢癌相关易感SNP位点具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对乳腺癌和卵巢癌易感人群，尤其是对具有这两种癌症家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。
附图说明
图1是样本文库构建完整性分析图。
图2是样本上机测试数据分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1：乳腺癌病人BRCA基因突变筛选
一、实验材料
1.本实验中涉及的20例临床血液样本来自浙江大学医学院附属第一医院。样本采集后，立即放入-80度冰箱中保存。
2.所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。
3.所有试剂购买自正规厂家：多重PCR酶(KAPA公司)、Ampure磁珠(Beckman Coulter公司)、PGM Template OT2kit、PGMSequencing OT2kit(Life Technologies公司)。
二、主要仪器
IonTorrent PGM测序仪、Qubit2.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。
三、实验设计
检测15例正常人血液样本和5例有乳腺癌家族史患者易感SNP位点，根据检测结果确定SNP位点的类型。
四、反应体系及程序
1.根据实验室现有实验基础和经验研究，及参考IonTorrent PGM上机测试的操作规程和多重PCR扩增要求，制定的多重反应体系如下：Master Mix 11μl、包含SEQ NO：1～SEQ NO：448引物的引物panel 5.5μl、待测基因4.5μl。
Master Mix组成为：PCR buffer(5×)4μl、MgCl21.5μl、Taq酶1.5μl、ddH2O 4μl。
2.根据以上反应体系进行多重PCR扩增反应程序：95℃预变性3分钟，聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸20s，并进行13个循环。实验完成后，对实验结果进行数据处理与分析。
3.多重反应完成后进行文库构建和上机测试，模板文库构建过程包括末端补平修复、末端连接测序接头、模板扩增和纯化，所述反应体系中包含0.2-1U末端补平酶、0.2-1U连接酶、0.2-1U扩增Taq酶、10-50mM测序接头A和P1、1-10×Buffer和0.2-1.8×Ampure纯化磁珠等试剂。
文库构建过程中使用的Ampure磁珠用量为：末端补平后进行纯化的磁珠为70μl体系中加入120μl的Ampure磁珠；连接接头后的纯化步骤，70μl反应体系中加入70μl的Ampure磁珠；两步法片段选择过程中，第一步200bp左右的片段及100μl反应体系中加入90μl的Ampure磁珠，第二步产物中加入20μl的Ampure磁珠；扩增后纯化步骤中，50μl的体系加入70μl的Ampure磁珠。纯化后的产物按照操作规程进行上机测试。
文库构建具体步骤如下：
1.末端补平修复：末端补平酶混合物20μl和DNA模板50μl混合后20℃孵育30min；
2.末端补平后纯化步骤：加入120μl Ampure纯化磁珠吸附DNA片段，80％乙醇洗两次后晾干加水溶解；
3.测序接头连接步骤：测序接头A和P1各10μl与20μl补平后的产物混合，20℃孵育15min，随后65℃孵育5min；
4.连接完成后采用不同浓度的Ampure磁珠进行纯化和片段选择；
5.模板扩增：在体系中加入纯化后的产物20μl，扩增Taq酶混合物25μl，通用引物5μl进行PCR扩增。反应程序为95-98℃30-45s预变性；95-98℃10-15s，60-65℃20-40s，68-72℃20-45s循环8-12次扩增；68-72℃50-60s，4℃保存；
6.扩增后纯化：扩增产物中加入70μl Ampure磁珠进行吸附，80％乙醇洗两次后晾干加水溶解。
图1是文库构建完成后的片段分布图，横坐标代表片段的长度，纵坐标代表片段的浓度(含量)。按照实验方案的设定，经引物panel多重扩增和文库构建后，目的产物应该是130-260bp左右，图1说明实际产物与实验设计相符合。
图2是样本上机测试数据分析图，是经过序列剪切、拼接以及位点分析等数据分析处理，而获得的初步的突变位点概况图，经数据分析可得出易感基因上的热点SNP数。
五、实验结果与分析
实验结束以后，对获得的测序数据进行分析，根据软件分析的结果，筛选出与参考基因组hg19不同的位点。通过比对设计的引物panel和位点信息，筛选出BRCA基因上SNP位点。参考基因组hg19是人类(Homo sapiens)标准参考基因组(GRCh37/hg19)，是国际通用作为筛选目标序列突变位点或SNP位点的参考基因序列，NCBIGenBank assembly accession：GCA_000001405.1。
根据收集的样本检测情况，去除正常的SNP位点，5例乳腺癌家族史患者在BRCA基因上共检测出26个易感SNP位点，结果如表3所示。
表3中位点名称包含以下信息：基因编号+(基因名称)+突变碱基序列+(氨基酸变化)，基因名称是指被检测位点所在的基因，RS编号为NCBI网站SNP数据库统一编号、染色体是指被检测位点所在的染色体位置、起始位置是指被检测位点所在染色体上的起始位置。
表3 5例乳腺癌家族史患者检测结果
SNP位点名称 基因名称 RS编号 染色体 起始位置
NM_000059.3(BRCA2)：c.9371A＞T(p.Asn3124Ile) BRCA2 28897759 13 32968940
NM_000059.3(BRCA2)：c.2376C＞A(p.Tyr792Ter) BRCA2 80358503 13 32910868
NM_000059.3(BRCA2)：c.37G＞T(p.Glu13Ter) BRCA2 80358622 13 32890634
NM_000059.3(BRCA2)：c.3812C＞A(p.Ser1271Ter) BRCA2 80358623 13 32912304
NM_000059.3(BRCA2)：c.4965C＞G(p.Tyr1655Ter) BRCA2 80358721 13 32913457
NM_000059.3(BRCA2)：c.4965C＞A(p.Tyr1655Ter) BRCA2 80358721 13 32913457
NM_000059.3(BRCA2)：c.581G＞A(p.Trp194Ter) BRCA2 80358809 13 32900700
NM_000059.3(BRCA2)：c.582G＞A(p.Trp194Ter) BRCA2 80358810 13 32900701
NM_000059.3(BRCA2)：c.688A＞T(p.Lys230Ter) BRCA2 80358913 13 32905062
NM_007294.3(BRCA1)：c.3253dupA(p.Arg1085Lysfs) BRCA1 80357517 17 41244295
NM_007294.3(BRCA1)：c.2835dupT(p.Ile946Tyrfs) BRCA1 80357519 17 41244713
NM_007294.3(BRCA1)：c.2074delC(p.His692Metfs) BRCA1 80357554 17 41245474
NM_007294.3(BRCA1)：c.882delA(p.Asp295Thrfs) BRCA1 80357587 17 41246666
NM_007294.3(BRCA1)：c.4843dupG(p.Ala1615Glyfs) BRCA1 80357615 17 41223088
NM_007294.3(BRCA1)：c.3820dupG(p.Val1274Glyfs) BRCA1 80357616 17 41243728
NM_007294.3(BRCA1)：c.5274delA(p.Lys1759Argfs) BRCA1 80357732 17 41209072
NM_007294.3(BRCA1)：c.668delA(p.Lys223Argfs) BRCA1 80357745 17 41247865
NM_007294.3(BRCA1)：c.2468delG(p.Arg823Lysfs) BRCA1 80357799 17 41245080
NM_007294.3(BRCA1)：c.195delG(p.Asn66Metfs) BRCA1 80357869 17 41258490
NM_007294.3(BRCA1)：c.4391delC(p.Pro1464Leufs) BRCA1 80357916 17 41228598
NM_007294.3(BRCA1)：c.2475delC(p.Asp825Glufs) BRCA1 80357970 17 41245073
NM_007294.3(BRCA1)：c.80+1G＞T BRCA1 80358010 17 41276033
NM_007294.3(BRCA1)：c.134+5G＞A BRCA1 80358038 17 41267738
NM_007294.3(BRCA1)：c.212+3A＞G BRCA1 80358083 17 41258470
NM_007294.3(BRCA1)：c.4986+6T＞C BRCA1 80358086 17 41222939
由表3可见，本发明检测的结果与临床检测结果一致，乳腺癌家族史患者在表中的热点SPN位点上有突变，而正常人群则没有。这也表明乳腺癌家族史患者患有乳腺癌的风险较正常人高，本发明可以较好地作为乳腺癌早期发现和治疗的辅助手段。
本发明的引物偏向性扩增的程度低，各引物之间相互干扰性小，特异性强，扩增效果好，对乳腺癌及卵巢癌相关易感SNP位点具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对结乳腺癌和卵巢癌易感人群，尤其是对具有这两种癌症家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.BRCA基因易感SNP位点检测组合物，其特征在于，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物包括SEQ NO：1～SEQ NO：448的引物；
所述SEQ NO：1～SEQ NO：448引物的序列如下：
2.根据权利要求1所述的BRCA基因易感SNP位点检测组合物，其特征在于，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物包括：MasterMix 11μ1、包含所述SEQ NO：1～SEQ NO：448引物的引物panel 5.5μ1、待测DNA样品4.5μ1。
3.根据权利要求2所述的BRCA基因易感SNP位点检测组合物，其特征在于，所述BRCA基因易感SNP位点检测组合物的PCR反应条件包括：首先92～97℃预变性3～10分钟；然后聚合酶链式反应扩增阶段：92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～20s，并进行10～15个循环。
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