KR20220062164A - Glis1 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 난소암 전이 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Glis1 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 난소암 전이 억제용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

GLIS1 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 난소암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 조성물은 난소암 세포의 이동능, 침윤능 등을 저해하여 난소암의 전이를 효과적으로 억제하고, 나아가 암세포의 증식 및 이동을 억제하므로 암의 전이 억제, 암의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, GLIS1의 발현과 난소암 전이와의 상관관계를 확인 하였는바, GLIS1의 발현 수준을 측정함으로써 전이성 암을 진단하거나 난소암 전이 억제용 제제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

GLIS1 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 난소암 전이 억제용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for inhibiting ovarian cancer metastasis comprising expression or activity inhibitors of GLIS1}
GLIS1 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 난소암 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
종양 미세환경(Tumor microenvironment: TME)은 기질 세포(stromal cells), 섬유아세포(fibroblast), 혈관(blood vessels), 면역 세포(immune cells) 및 세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 등을 포함하는 복잡한 구조를 가지며, 암의 발생과 성장, 치료에 관련이 있다고 알려져 있다. 특히, 이러한 종양 미세환경에 위치한 암 연관 섬유아세포(Cancer-associated Fibroblasts: CAFs)는 종양 미세환경을 조절하며, 혈관신생(angiogenesis) 또는 림프관신생(lymphangiogenesis)을 촉진하여 암 진행을 향상시키는 등 공격적인 암 진행에 영향을 미친다. 이에, 최근 암 진행에서의 암 연관 섬유아세포의 역할 및 서로 다른 암종에서 암 연관 섬유아세포-관련 마커와 예후와의 관련성이 연구되고 있다(MR Junttila et al. Nature, 501 (2013) 346-354; J Paulsson et al. Seminars in cancer biology, 25 (2014) 61-68).
한편, 난소암(Ovarian Cancer: OC)은 가장 치명적인 부인과 악성 종양으로, 적극적으로 치료받아도 약 80%가 재발하며 암 사망통계에서 폐암, 대장암, 위암 등에 이어 8번째로 사망률이 높아 발병 후 예후가 매우 나쁜 암이다. 난소암의 치료 방법에는 크게 수술, 항암화학요법, 방사선치료가 있으나, 대다수의 난소암 치료제들은 세포 독성 항암제로 구성되어 있으며, 표적 치료의 한계로 인한 구토, 탈모, 설사, 식욕감소, 출혈 등의 다양한 부작용을 초래하고 전이를 통한 재발을 극복하지 못하여 생존율 또한 낮다. 특히, 난소암은 전이가 빠르게 일어나는 암으로, 복강으로의 전이가 시작되면 타 장기로의 전이가 빠르게 일어나며, 이와 같은 난소암 전이는 난소암으로 인한 사망의 주 원인이다.
따라서, 난소암 전이 관련 신규 약물 타겟의 발굴, 표적 치료제 개발이 시급히 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 난소암에서 전이성 암 연관 섬유아세포 관련 유전자를 선별하고 난소암 전이의 새로운 치료 타겟을 발굴하기 위해, 난소암의 종양 미세환경에서 전이성 CAF(metastatic Cancer-associated Fibroblast: mCAFs) 및 비전이성 CAF(nonmetastatic Cancer-associated Fibroblast: nmCAFs) 간의 유전자 발현 프로필 및 차별발현 유전자들(Differentially expressed genes: DEGs)의 기능을 분석하였고, 그 결과 GLIS1이 난소암 세포의 이동 및 침윤에 영향을 미쳐 난소암 전이 억제 타겟이 될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 GLIS1(Glis Family Zinc Finger 1) 유전자의 발현 억제제 또는 GLIS1 단백질의 활성 억제제를 포함하는 난소암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 GLIS1 유전자의 발현 억제제 또는 GLIS1 단백질의 활성 억제제를 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 난소암 전이 억제용 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 난소암 전이에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 GLIS1(Glis Family Zinc Finger 1) 유전자의 발현 억제제 또는 GLIS1 단백질의 활성 억제제를 포함하는 난소암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 GLIS1(Glis Family Zinc Finger 1) 유전자는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열(NCBI Reference Sequence: NM_147193.3; GLIS1 isoform 1) 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열(NCBI Reference Sequence: NM_001367484.1; GLIS1 isoform 2)로 구성된 것일 수 있고, GLIS1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NP_671726.2) 또는 서열번호 4의 아미노산 서열(NCBI Reference Sequence: NP_001354413.1)로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 유전자는 서열번호 1 또는 2의 염기서열에서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 단백질은 서열번호 3 또는 4의 아미노산으로 구성된 단백질 또는 이의 단편을 의미할 뿐만 아니라, 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 삽입, 결실 등과 같은 돌연변이가 일어난 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 상기 GLIS1 유전자 및 단백질의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성(sequence identity)을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 의미한다.
상기 GLIS1(Glis Family Zinc Finger 1) 유전자는 Zinc Finger Protein GLIS1, GLI similar 1, Gli similar 1 또는 Gli related Kruppel-like zinc finger 1로도 불리며, 1번 염색체 상의 1p32.3에 위치하는 것일 수 있다.
GLIS 단백질은 암 발생을 포함하는 여러가지 세포 과정(cellular processes)에 관여하는 가장 큰 전사인자군(transcription factor family) 중 하나인 Kruppel-like zinc finger 단백질의 하위군(subfamily)이며, 암에서 GLIS 단백질의 생리적 역할에 대하여는 아직까지 거의 알려진 바가 없다.
상기 유전자의 발현 억제제는 GLIS1 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA: shRNA) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 단백질의 활성 억제제는 GLIS1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서는, siGLIS1로 형질감염시킨 암 연관 섬유아세포(CAF)에서 GLIS1 mRNA 및 단백질 발현이 현저히 감소됨을 확인하였다(도 7 참조).
또한, siGLIS1로 형질감염시킨 CAF와 암세포를 공배양하여 난소암 세포의 침윤(invasion), 세포 이동(migration), 혈관신생(angiogenesis), 세포-기질 부착(adhesion) 및 증식 정도를 분석하였고, 그 결과 GLIS1의 발현 억제에 의해 침윤, 이동, 혈관신생이 현저히 감소되고(도 10, 11, 12 참조), 세포-기질 부착 및 증식 역시 현저히 감소됨을 확인하였다(도 13, 14 참조).
나아가, 암세포와 siGLIS1로 처리된 CAF의 혼합물을 마우스에 이식했을 때, 전이성 결절의 수와 종양 결절의 총 중량이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 15 참조).
따라서, GLIS1은 난소암 세포의 침윤, 세포 이동, 혈관신생, 세포-기질 부착 및 증식을 조절하며, CAF에서의 GLIS1 과발현은 난소암 세포의 복막 전이와 관련되어 하향 조절하는 경우 난소암 전이 억제 타겟이 될 수 있음을 확인하였다.
상기 난소암은 이에 제한되지는 않으나 장액성(serous) 난소암, 점액성(mucinous) 난소암, 자궁내막양(endometroid) 난소암, 투명세포암(clear cell carcinoma), 브레너 종양(maligmant brenner tumor) 및 미분화세포암(undifferentiated carcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 장액성 난소암일 수 있다.
다른 양상은 GLIS1 유전자의 발현 억제제 또는 GLIS1 단백질의 활성 억제제를 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 구체예에서는, CAF에서 GLIS1의 하향 조절이 암세포의 증식을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하였으므로(도 12 참조), GLIS1의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 난소암 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다.
일 양상에 따른 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 유효성분인 GLIS1 유전자의 발현 억제제 또는 GLIS1 단백질의 활성 억제제를 0.0001 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 GLIS1 유전자의 발현 억제제 또는 GLIS1 단백질의 활성 억제제 외에 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 텍스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 사용할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 에어로졸 제형, 주사용 제형이 있을 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효 성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 일 양상에 따른 약학적 조성물은 당해 기술분야의 공지된 방법이라면 제한 없이 사용하여 목적에 맞게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 나이, 성별 체중에 따라 달라질 수 있으나 0.0001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 상기 약학적 조성물을 난소암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난소암의 치료 방법 또는 난소암 전이 억제 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있으며, 0.0001 내지 100mg/kg으로 투여할 수 있고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
또 다른 양상은 1) GLIS1 유전자 또는 GLIS1 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에 대해 GLIS1 유전자의 발현 정도 또는 GLIS1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 측정 결과에서 시험물질이 GLIS1 유전자의 발현 정도 또는 GLIS1 단백질의 발현 정도를 감소시키는 경우, 상기 시험물질을 난소암 전이 억제용 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 난소암 전이 억제용 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 시험물질은 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, DNAzyme, PNA, 항체, 앱타머, 천연 추출물 및 합성 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 단계 2)의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction: RT-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(eal-time polymerase chain reaction: real-time PCR), 웨스턴 블롯(western blot), 노던 블롯(northern blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis) 및 유세포 분석법(Fluorescence-activated cell sorting: FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것이 바람직하나, 당업자에게 알려진 유전자 발현 정도 또는 단백질 발현 정도를 측정하는 방법이면 제한없이 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 1) GLIS1 단백질에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 GLIS1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 측정 결과에서 시험물질이 GLIS1 단백질의 활성 정도를 감소시키는 경우, 상기 시험물질을 난소암 전이 억제용 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 난소암 전이 억제용 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 측정은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것이 바람직하나, 당업자에게 알려진 단백질 활성 정도를 측정하는 방법이면 제한없이 사용할 수 있다.
일 구체예에서는, GLIS1이 난소암의 전이성 CAF에서 과발현되고, CAF에서 GLIS1의 발현을 저해한 결과 인 비트로에서 암세포 이동성, 침윤, 기질부착 및 혈관생성이 감소하고, 인 비보에서 난소암 전이가 억제됨을 확인하였으므로, GLIS1의 발현 또는 활성 수준을 난소암 전이 억제용 후보물질을 스크리닝하는 방법에 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 1) 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 GLIS1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 GLIS1 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 선별된 개체를 난소암 전이 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 난소암 전이에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 1) 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 GLIS1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 GLIS1 단백질의 활성 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 선별된 개체를 난소암 전이 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 난소암 전이에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물일 수 있고, 바람직하게는 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 개, 고양이, 소 또는 쥐일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물은 난소암 세포의 이동능, 침윤능 등을 저해하여 난소암의 전이를 효과적으로 억제하고, 나아가 암세포의 증식 및 이동을 억제하므로 암의 전이 억제, 암의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다. 나아가, GLIS1의 발현과 난소암 전이와의 상관관계를 확인 하였는바, GLIS1의 발현 수준을 측정함으로써 전이성 암을 진단하거나 난소암 전이 억제용 제제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 난소암 암연관 섬유아세포(CAF)에서 비전이성 CAF(nmCAF)에 비해 전이성 CAF(mCAF)에서 유의한 발현 차이를 보이는 유전자들의 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)을 나타낸 히트맵(Heatmap)이다.
도 2는 mCAF vs. 정상 난소 섬유아세포 및 mCAF vs. nmCAF에서 유의한 발현 차이가 중첩되는 mRNA들을 벤 다이어그램으로 나타낸 도이다.
도 3은 선별된 7개 유전자 DCHS1, GLIS1, MIAT, LUM, SPON2, PLEKHH2 및 SATB1의 mCAF vs. nmCAF 및 nmCAF vs. 정상 난소 섬유아세포에서의 mRNA의 상대적 발현 수준 차이를 나타낸 도이다.
도 4는 NOF, nmCAF, mCAF 및 원발성 난소암 세포(primary OC)에서의 GLIS1, DCHS1의 RT-PCR 결과를 나타낸 도이다. mRNA의 상대적 발현 수준은 GAPDH 발현으로 정규화하였고, 각 실험은 3번 수행하였다(* p <0.05, ** p <0.005 및 *** p <0.0005).
도 5는 NOF, nmCAF, mCAF 및 원발성 난소암 세포(primary OC)에서의 GLIS1, DCHS1의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다. 단백질의 상대적 발현 수준은 β-액틴 또는 GAPDH 발현으로 정규화하였고, 각 실험은 3번 수행하였다(* p <0.05, ** p <0.005 및 *** p <0.0005).
도 6은 GLIS1을 기반으로 STRING 데이터베이스에 의해 식별되는 차별발현 유전자들(Differentially expressed genes: DEGs)의 단백질-단백질 상호작용(Protein-protein interaction: PPI) 네트워크를 나타낸 도이다. 각 노드(node)는 단백질을 나타내고, 엣지(edge)는 노드 간의 상호작용을 나타낸다.
도 7은 siRNA 처리한 CAF에서 GLIS1 mRNA 및 단백질 발현 수준의 변화를 나타낸 도이다.
도 8은 siGLIS1로 형질감염된 또는 형질감염 되지 않은 mCAF와 SKOV3 및 A2780 세포와의 공배양 결과를 나타낸 도이다(A). 그래프는 이동한 siGLIS1 처리된 CAF vs. siControl 처리된 CAF vs. 대조군 세포의 수를 나타낸 것이다(B).
도 9는 SKOV3 및 A2780 세포의 이동에 대한 siGLIS1 처리된 CAF의 영향을 상처 회복 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(A). 그래프는 대조군과 비교하여 이동된 세포에 의한 상처 회복 영역을 상대적 백분율로 나타낸 것이다(B).
도 10은 GLIS1 유전자 침묵(gene silencing)에 따른 HUVEC의 튜브 형성능 변화를 나타낸 도이다. 그래프는 HUVEC의 가지점(branch points) 수를 나타낸다.
도 11은 GLIS1 유전자 침묵에 따른 SKOV3 세포의 세포 부착 능력 변화를 나타낸 도이다. 그래프는 siGLIS1 또는 siControl 처리된 CAF의 조건배지로 배양한 후, 대조군 대비 부착된 세포 수의 배수 차이(Fold Change: FC)를 나타낸 것이다.
도 12는 GLIS1 유전자 침묵에 따른 암세포 증식 변화를 나타낸 도이다. 각 실험은 3번씩 수행하였으며, 실험 결과는 대조군 대비 각 암세포의 상대적 O.D. 값으로 나타내었다.
도 13은 난소암 전이에 대한 GLIS1 유전자 침묵의 생체 내 기능을 확인하기 위해 마우스를 3개 그룹으로 분류하고, PBS(control), scrambled siRNA-형질감염된 CAF 및 SKOV3 세포의 혼합물(siControl) 또는 siGLIS1-형질감염된 CAF 및 SKOV3 세포의 혼합물(siGLIS1)을 주사한 뒤, 10주 후 각 그룹의 체중 변화(A), 종양 결절의 총 중량(B) 및 평균 종양 결절 수(C)를 나타낸 도이다.
도 14는 난소암에서 전이성 암 연관 섬유아세포 관련 유전자를 선별하고, 마이크로어레이 및 유전자 기능분석을 통하여 일 양상에 따른 난소암 전이 억제 타겟인 GLIS1 유전자 및 단백질을 발굴하는 과정을 나타낸 모식도(A) 및 상기 GLIS1의 하향 조절에 따른 난소암 전이 억제 효과를 확인한 결과(B)를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 원발성 암세포 및 암연관 섬유아세포의 분리
분당 차병원에서 장액성 난소암(Ovarian Serous Carcinoma: OSC) 수술을 받은 환자 10명의 종양 조직에서 원발성 암세포 및 암연관 섬유아세포(Cancer-associated Fibroblast: CAF)를 분리하였다. 장액성 난소암은 모든 난소암 중 가장 높은 발생률과 치명률을 보이는 암이다. 5 ㎍/ml 콜라게나제 Type I (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 첨가한 PBS를 이용해 37℃에서 30분 동안 조직을 분해시켰다. 콜라게나제 처리된 조직을 PBS로 세척 후 90 xg에서 2분간 원심 분리하여, 암세포를 분리하였다. 암세포는 10% FBS(Invitrogen), EGF(100 μg/ml), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 McCoy's 5A(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지에서 배양하였다. CAF를 포함하는 상층액을 48 xg에서 8분간 추가로 원심분리하여, 얻은 펠렛을 성장 배지(growth medium)에 현탁시켰다.
정상 난소 섬유아세포(Normal ovarian fibroblasts: NOFs)는 자궁 근종으로 인해 난소 적출술과 함께 자궁 적출술을 받은 환자 3명의 비암성(noncancerous) 난소 조직으로부터 분리하였다. 분리한 세포를 15% FBS(Gibco-BRL, Grand Island, NY)가 첨가된 DMEM/F12(Invitrogen, Carlsbad, CA) 배지에 재현탁한 다음, 5% CO2의 습윤(humidified) 대기 하에서 37℃로 배양하였다. 섬유아세포의 순도는 FAP 및 CK7의 mRNA 발현 수준을 평가하여 결정하였고, 모든 실험에서 계대 배양은 3 내지 10회로 수행하였다.
2. 마이크로어레이 분석
cDNA 마이크로어레이는 4개 비전이성 CAF(nmCAF) 및 4개 전이성 CAF(mCAF)에 대하여 수행하였다. cDNA는 iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Reymond, WA)를 사용하여 수득하였다. 표적 cRNA 프로브의 합성 및 혼성화는 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification 키트(Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 사용하여 수행하였다. 증폭되고 표지된 cRNA는 cRNA Cleanup Module(Agilent Technology)로 정제하였다. 단편화된 cRNA는 조립된 Human Oligo Microarrays(60K)(Agilent Technology)에 바로 피펫팅하였다. 하이브리드 이미지는 DNA 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 스캔하고 특징 추출 소프트웨어(Agilent Technology)로 정량화하였다. 마이크로어레이 결과는 Agilent Feature Extraction Software v11.0(Agilent Technologies)을 사용하여 추출하였고, 플래그 A를 포함하는 어레이 프로브는 필터링되었다. 선택된, 처리된 신호값은 로그로 변환되고 분위수(quantile) 방법으로 정규화하였다. 발현 데이터의 통계적 유의성은 독립 표본 t-test 및 FC를 사용하여 결정하였으며, 귀무가설은 각 그룹간 차이가 없다는 것이다. FDR(false discovery rate)은 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 p값을 조정하여 제어되었다. 각 차별발현 유전자(Differentially expressed genes: DEGs) 세트에 대해 완전연결(complete linkage)과 유클리드 거리(Euclidean distance)를 유사성의 척도로 사용하여 계층적 클러스터링을 수행하였다.
중요한 DEG들의 유전자 농축(Gene enrichment) 및 기능 분석(functional annotation)은 GO(Gene Ontology; www.geneontology.org/) 및 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; www.genome.jp/kegg/)을 사용하여 수행하였다. 모든 데이터 분석 및 DEG 시각화는 R 3.1.2(www.r-project.org)를 사용하여 수행하였다.
3. 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석
nmCAF에 비해 mCAF에서 가장 차별적인 발현 양상을 나타낸 유전자인 GLIS1에 대한 단백질-단백질 상호작용(Protein-protein interaction: PPI)은 STRING 데이터베이스를 사용하여 예측하였다. 신뢰점수(confidence score)는 0.4로 세팅하였고, 상호작용 노드는 20개 이하로 세팅하였다. 근거의 강도(strength of evidence)는 트리 선 굵기에 따라 중간(0.4), 높음(0.7) 및 가장 높음(0.9)으로 분류하였다.
4. RT-PCR
표적 유전자의 mRNA가 원발성 CAF 및 원발성 암세포에서 과발현되어 있는지 확인하기 위해, TRIzol 시약(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 mRNA를 추출하였다. Invitrogen Superscript Ⅲ First-strand Synthesis System(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 cDNA를 합성하기 위해 1㎍의 분리된 RNA를 사용하였다. 유전자 발현을 GAPDH 발현으로 정규화하고 ImageJ Gel 분석 도구를 사용하여 정량화하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.
유전자 서열(5'-3') 서열번호
FAP 정방향 GTTATTGCCTATTCCTATTATG 7
역방향 GTCCATCATGAAGGGTGGAAA 8
DCHS1 정방향 CTGAAACACGGTTGGTGCTG 9
역방향 CCCCAGTTGCCACTGATGAT 10
GLIS1 정방향 CCATTCAGAGACTGGCGTGA 11
역방향 TCTGGTGCACAGTTTGGTGA 12
Cytokeratin 7 정방향 TGAGATCGACAACATCAAGAAC 13
역방향 CGGATGGAATAAGCCTTCAG 14
GAPDH 정방향 GGACCTGACCTGCCGTCTAG 15
역방향 GGCCATGTGGGCCATGAGGTC 16
5. 웨스턴 블롯
표적 유전자의 단백질이 원발성 CAF 및 원발성 암세포에서 과발현되어 있는지 여부를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 화학발광 용액(Enhanced Chemiluminescent Detection Reagents; Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)을 사용하여 신호를 검출하였다. 단백질 발현을 β-액틴 및 GAPDH 발현으로 정규화하고 ImageJ 겔 분석 도구를 사용하여 정량화하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용한 1차 항체를 하기 표 2에 나타내었다.
단백질 카탈로그 번호 제조사
FAP ab53066 Abcam
DCHS1 ab130092 Abcam
GLIS1 GTX117785 GeneTex
GAPDH sc-47724 Santa Cruz Biotechnology
GAPDH sc-47778 Santa Cruz Biotechnology
6. RNA 간섭
Viromer Blue(Lipocalyx, Weinbergweg, Germany)를 사용하여 원발성 CAF를 siGLIS1 또는 siControl로 48시간 동안 형질감염(transfection)시킨 후, RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 형질감염 효율을 확인하였다. 상기 세포들은 세포의 침윤(invasion), 이동(migration) 분석 또는 조건배지(conditioned medium: CM) 준비에 사용하였다. 대조군으로 사용한 스크렘블(scrambled) siRNA는 구매하여 사용하였고(Bioneer), 실험에 사용한 siGLIS1의 구체적인 염기서열을 하기 표 3에 나타내었다.
서열(5'-3') 서열번호
siGLIS1 센스: GUC CUU GCC CGA CUA CCA A (dTdT) 5
안티센스: UUG GUA GUC GGG CAA GGA C (dTdT) 6
7. 조건배지의 수집
CAF는 15% FBS가 첨가된 DMEM/F12 배지에 플레이팅하고 24시간 동안 부착시켰다. 세포를 PBS로 세척한 다음, 무혈청 배지에서 24시간 동안 배양하고 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 조건배지를 수집하였다.
8. 세포 이동 및 침윤 분석
인간 난소암 세포주 SKOV3 및 A2780은 각각 American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA, USA) 및 European Type Culture Collection(Manassas, VA)에서 구입하였다. 세포는 McCoy's 5A(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지 및 10% FBS(Invitrogen), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지에서 배양하였다. 세포 침윤(invasion) 분석을 위해, CAF를 하부 챔버에 플레이팅하고 24시간 동안 무혈청 배양(serum starvation)된 SKOV3 세포를 매트리겔(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 코팅된 24-웰 Transwell 시스템(8 μm pore size; Corning, Corning, NY, USA)의 상부 챔버에 시딩하였다. 세포 이동(migration) 분석은 상부 챔버의 매트리겔 코팅을 제외하고는 세포 침윤 분석과 동일한 방법으로 수행하였다. 6시간 동안 배양한 뒤, 이동하여 막의 아래쪽으로 침투한 세포들을 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 뒤 현미경 필드 세 곳을 이미지화하고 세포수를 계수하였다. 정량화는 ImageJ 소프트웨어로 수행하였다.
9. 상처 회복 분석(wound healing assay)
백색 팁(white tip)으로 세포 단일층을 긁어 상처를 낸 뒤, 떨어진 세포들을 제거하기 위해 무혈청 배지로 배양물을 세척하였다. 그런 다음, 성장 배지와 조건배지를 1:2로 혼합하여 처리하고, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 0시간, 48시간 후 세포가 없는 부분으로 이동된 세포의 수를 측정하고, 이동된 영역은 초기 상처 너비로 정규화한 다음 대조군 샘플과 비교하였다.
10. 세포 증식 분석
세포 증식은 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석(Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan)으로 평가하였고, 흡광도(Optical density: OD)는 450nm에서 측정하였다.
11. 튜브 형성 분석
인간 탯줄 정맥 내피 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells: HUVECs)에서의 혈관신생을 평가하기 위해 튜브 형성 분석을 수행하였다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포를 CAF 조건배지 및 내피세포 성장 보충제를 함유하는 매트리겔이 코팅된 웰에서 37℃, 4시간 동안 플레이팅하였다. 튜브(tubules)는 위상차(phase contrast)를 사용하여 이미지화하였고, 튜브 구조의 가지 수를 정량화하였다.
12. 세포 부착 분석
암세포를 CAF 성장배지와 CAF 조건배지를 1:2로 혼합한 혼합물에서 18시간 동안 배양한 후, 배양한 세포를 PLL로 코팅된 96-웰 플레이트에 60분 동안 다시 시딩하였다. 부착되지 않은 세포들을 PBS로 제거하고 성장 배지로 덮었다. 부착된 세포의 수는 CCK-8 분석을 사용하여 측정하였다. 데이터는 대조군 세포에 대한 백분율로 계산하였다.
13. 마우스에서의 인 비보 복막암 형성
6주령 BALB/C 누드 마우스(Orient Bio, Sungnam, Korea)를 PBS 처리군(control), 음성대조군으로 scrambled siRNA-형질감염된 CAF(siControl) 및 siGLIS1-형질감염된 CAF(siGLIS1)의 3개 그룹(각 그룹당 5마리)으로 무작위 분류하였다. 상기 siControl 또는 siGLIS1 그룹의 마우스에 scrambled siRNA-형질감염된 CAF 및 SKOV3 세포의 혼합물; 또는 siGLIS1-형질감염된 CAF 및 SKOV3 세포의 혼합물을 복강 주사하였다. 상기 각 혼합물은 100 μl PBS 내에서, CAF:암세포 = 4(3.2 x 107):1(8 x 106)의 비율로 혼합하였다. 마우스의 체중은 주 3회 모니터링하였다. 마우스는 세포 주사 10주 후 안락사시킨 뒤, 눈에 보이는 종양 결절(tumor nodule)을 절제하여 그 무게와 수를 그룹 별로 측정하였다.
14. 통계적 분석
인 비트로 및 인 비보 실험에서 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타내었고, 통계 분석은 각각 PRISM 5.0 프로그램(nonparametric t-test) 및 Microsoft Excel(Student's t-test)을 사용하여 수행하였다. 오차 막대는 SD를 의미한다. 모든 결과는 3번의 개별 실험으로부터 얻었고, p value <0.05 (*), <0.01 (**) 및 <0.005 (***)의 값을 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
실험 결과
실시예 1. 장액성 난소암 환자의 암조직에서 분리된 원발성 CAF의 마이크로어레이 분석
정상 난소 섬유아세포(Normal ovarian fibroblasts: NOFs), 원발성 장액성 난소암 조직의 전이성 CAF(metastatic Cancer-associated Fibroblast: mCAFs) 및 비전이성 CAF(nonmetastatic Cancer-associated Fibroblast: nmCAFs)의 유전자 프로필을 마이크로어레이를 통해 분석하였다. 구체적으로, >3.0 또는 <-3.0의 신호 비율 컷오프(cutoff)와 p value <0.05를 사용하였다. 그 결과, mCAF와 nmCAF 간의 현저한 차별발현 유전자(Differentially expressed genes: DEGs)들이 존재함을 확인하였다(도 1).
DAVID 분석 툴에 상기 DEG들을 업로드하고, mCAF 및 nmCAF에서 과다대표되는(overrepresented) GO categories 및 KEGG pathways를 확인하였다. 그 결과, 농축된(enriched) categories 및 pathways는 암세포 운동성(motility)과 침윤(invasion)과 관련이 있음을 확인하였다. KEGG 분석에서는, mCAF와 nmCAF 간에 차별적으로 농축된 KEGG pathways 상위 20개를 선별하였다. 가장 현저한 경로 변경을 보인 pathway들은 암, 국소 부착(focal adhesion), 부착 연접(adherens junction) 및 PI3K-Akt 신호전달경로로 확인되었다. GO 분석에서는, mCAF와 nmCAF 간에 차별적으로 농축된 GO term들은 결합(binding)(p <0.001), 단백질 결합(protein binding)(p <0.001) 및 촉매 활성(catalytic activity)(p <0.001)으로 확인되었다.
마이크로어레이 분석에서는, 181개 유전자가 정상 난소 섬유아세포보다 mCAF에서 현저히 높은 발현 양상을 보였고, 157개 유전자가 nmCAF보다 mCAF에서 현저히 높은 발현 양상을 보임을 확인하였다(FC(Fold Change, 배수 차이) value >2.0; p value <0.05) (도 2). 이들 중 26개 유전자는, mCAF/nmCAF 및 mCAF/정상 난소 섬유아세포 간에 현저한 차이를 보였고, 그 중에서도 7개 유전자는 발현이 현저히 증가됨을 확인하였다(FC value >4.0; p value <0.05) (도 3). 그 중 DCHS1 및 GLIS1은 nmCAF와 비교하여 mCAF에서 가장 과발현된 유전자임을 확인하였고, 이를 통해 mCAF에서의 DCHS1과 GLIS1 과발현이 장액성 난소암의 전이 진행을 유도할 것으로 예상되었다. 이에, 상기 두 유전자를 선별하여 이후 실험을 수행하였다.
실시예 2. GLIS1 및 DCHS1에 대한 DEG 분석
nmCAF에 비해 mCAF에서 현저히 과발현된 2개 유전자인 DCHS1(FC value 14.4) 및 GLIS1(FC value 10.25)에 대하여, RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, mRNA 발현 수준은 GLIS1(2.3배, p <0.0001) 및 DCHS1(14.6- 배, p =0.003) 모두 mCAF가 nmCAF보다 현저히 높음을 확인하였다(도 4의 A 및 B). 단백질 발현 수준 또한 GLIS1(5.5배, p =0.0032) 및 DCHS1(5.2배, p =0.018) 모두 mCAF가 nmCAF에서 현저히 높은 것으로 나타났다(도 5의 A 및 B). 이중 GLIS1의 경우, 단백질 발현 수준이 NOF보다 mCAF에서 유의하게 높았으나(5.7배, p =0.005), DCHS1은 NOF에 비해 mCAF에서 단백질 발현 수준이 유의하게 높지 않았다(1.23배, p >0.05). 한편, 원발성 암세포는 GLIS1 또는 DCHS1의 mRNA 또는 단백질을 발현하지 않았다. 또한, GLIS1의 단백질 발현 패턴은 원발성 CAF 및 암세포에서의 mRNA 발현 패턴과 잘 연관되어 있는 반면, DCHS1의 단백질 발현은 mRNA 발현과 상관관계가 없음을 확인하였다. 이에, 난소암 전이에서의 세포 이동, 침윤 및 혈관신생 등을 평가하기 위해 GLIS1을 선택하여 이후 실험을 수행하였다.
실시예 3. 단백질-단백질 상호작용 분석
상기 실시예 1 및 2를 통해 선택한 GLIS1에 대하여, 단백질-단백질 상호작용(Protein-protein interaction: PPI) 분석을 수행하였다. 최소 요구 상호작용 점수를 0.4 컷오프로 하였을 때, 다음 유전자들과 관련된 21개 노드(node)와 50개 엣지(edge)를 확인하였다: MYC, TSC1, FGF18, CLEC3b, KLK7, KLK6, SPRP1B, IVL, SPRR1A 및 TGM1(조직 발달과 관련), POU5F1, NANOG, SOX2 및 LIN28A(체세포성 줄기세포 군집 유지와 관련)[GO category: biological process], IVL, SPRP1A 및 SPRP1B(단백질 결합, 연결)[GO category: molecular function](도 6). 상기 유전자들은 GLIS1과 상호작용하면서 암세포 침윤 및 전이와 관련된 세포 외 기질 리모델링, 단백질 결합 및 암 줄기세포의 분화 조절 등에 관여함을 확인하였다. 이와 같은 결과는 mCAF에 대한 KEGG 분석 결과와도 일치하여, GLIS1이 mCAF의 기능에서 핵심적 역할을 함을 알 수 있었다.
실시예 4. GLIS1 유전자 침묵(gene silencing)에 따른 난소암 세포 이동 및 침윤 억제
CAF-유래된 GLIS1이 난소암 세포의 전이에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여, Viromer Blue를 사용하여 mCAF를 siGLIS1로 48시간 동안 형질감염시킨 후, 난소암 세포에서 세포 침윤 및 세포 이동 분석을 수행하였다. 그 결과, CAF에서 siGLIS1 처리에 의한 GLIS1 유전자 침묵은 GLIS1 mRNA 및 단백질의 발현을 현저히 감소시킴을 확인하였다(도 7).
다음으로, CAF와 6시간 동안 공배양한 SKOV3 및 A7860 난소암 세포의 세포 침윤능을 확인하였다. 그 결과, siGLIS1 처리된 CAF와 공배양한 SKOV3 세포(14.3)는 siControl 처리된 CAF와 공배양한 SKOV3 세포(24.3)에 비해 현저히 감소된 침윤능을 보였다(p <0.05). siGLIS1 처리된 CAF와 공배양한 A2780 세포(89.5) 역시, siControl 처리된 CAF와 공배양한 A2780 세포(166)에 비해 현저히 감소된 침윤능을 보였다(p <0.05)(도 8).
상처 회복 분석(wound healing assay)에서는, siGLIS1 처리된 CAF의 조건배지로 48시간 동안 처리한 SKOV3 및 A2780 세포의 상처 회복 능력이 siControl 처리된 CAF의 조건배지로 처리한 세포에 비해 현저히 낮음을 확인하였다(SKOV3: sicontrol vs. siGLIS1; 105.5% vs. 64.4%, p <0.05, A2780: sicontrol vs. siGLIS1; 72.6% vs. 47.6%, p <0.05) (도 9).
상기 결과를 통해, CAF의 GLIS1 유전자는 전이의 초기 단계와 관련된 난소암 세포 침윤 및 이동을 조절함을 확인하였다.
실시예 5. GLIS1 유전자 침묵에 따른 혈관신생(angiogenesis) 억제
CAF의 GLIS1이 종양 혈관신생을 조절하는지 여부를 확인하기 위해, siGLIS1 처리된 CAF의 조건배지로 처리된 인간 탯줄 정맥 내피 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells: HUVECs)를 사용하여 튜브 형성 분석을 수행하였다. 그 결과, siGLIS1 처리된 CAF의 조건배지로 처리한 HUVEC(9.5)은 siControl 처리된 CAF의 조건배지로 처리한 경우(35)에 비해 모세관-유사 가지점(capillary-like branch points)이 현저히 적음을 확인하였다(p <0.05) (도 10). 상기 결과를 통해, CAF에서 GLIS1의 하향 조절은 혈관신생을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. GLIS1 유전자 침묵에 따른 세포 부착 억제
CAF의 GLIS1이 세포 부착을 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 암세포를 CAF 성장배지와 CAF 조건배지를 1:2로 혼합한 혼합물에서 배양하였다. 구체적으로, 상기 CAF 조건배지는 siControl 처리된 CAF의 조건배지 또는 siGLIS1 처리된 CAF의 조건배지를 사용하였다. 그 결과, siGLIS1 조건배지는 배양 플레이트에 부착된 SKOV3 세포의 수를 현저히 감소시킴을 확인하였다(sicontrol vs. siGLIS1; 82.8% vs. 77.2%, p <0.05) (도 11).
또한, CCK-8 분석을 사용하여 GLIS1이 암 세포 증식에 관여하는지 확인한 결과, SKOV3 세포의 증식은 siGLIS1 처리된 CAF의 조건배지로 처리한 경우 현저히 억제됨을 확인하였다(SKOV3; sicontrol vs. siGLIS1; 93.6% vs. 83.8%, p <0.05) (도 12). 상기 결과를 통해, CAF에서 GLIS1의 하향 조절은 암세포 부착 및 증식을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7. GLIS1 유전자 침묵에 따른 암 전이 억제
CAF의 GLIS1이 암 전이를 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 누드 마우스에 SKOV3 세포와 siGLIS1 또는 siControl로 처리된 CAF를 1:4 비율로 혼합하여 복강(peritoneal cavity)에 주사하고, 10주 후 마우스를 희생시켜 마우스의 체중, 종양 결절의 무게, 수를 확인하였다. 마우스는 PBS 처리군(control), 음성대조군으로 scrambled siRNA-형질감염된 CAF(siControl) 및 siGLIS1-형질감염된 CAF(siGLIS1)의 3개 그룹으로 무작위 분류하였다.
그 결과, siGLIS 그룹의 마우스는 control 및 siControl 그룹의 마우스보다 체중이 더 높음을 확인하였다(siGLIS1 vs. sicontrol vs. control; 20.8 g vs. 18.7 g vs. 18.4 g, p <0.05) (도 13의 A). 종양 결절의 총 중량은 siGLIS1 그룹이 siControl 또는 control 그룹과 비교하여 현저히 낮았다(siGLIS1 vs. sicontrol vs. control; 0.49 g vs. 0.97 g vs. 1.82 g; p <0.05) (도 13의 B). 또한, 종양 결절의 수 역시 siGLIS1 그룹이 siControl 또는 control 그룹과 비교하여 현저히 적은 것을 확인하였다(siGLIS1 vs. sicontrol vs. control; 8.7 vs. 17.5 vs. 22.2, p <0.05) (도 13의 C).
상기 결과를 통해, CAF의 GLIS1 과발현은 난소암 세포의 전이와 관련이 있으며, CAF에서 GLIS1을 하향 조절함으로써 난소암 전이를 억제할 수 있음을 확인하였다.
이상의 실험 결과로부터, GLIS1 유전자는 난소암의 전이성 CAF에서 과발현되며, 상기 전이성 CAF에서 GLIS1의 발현을 억제시키면 암세포의 운동성(motility), 부착능(adhesion), 혈관 신생(angiogenesis) 및 전이(metastasis)가 인 비트로 및 인 비보 모두에서 현저히 감소함을 확인하였다. 따라서, 전이성 CAF의 GLIS1 유전자는 난소암 전이 억제 및 난소암의 예방 및 치료 타겟으로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for inhibiting ovarian cancer metastasis comprising expression or activity inhibitors of GLIS1 <130> PN136770KR <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1863 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLIS1 isoform1 <400> 1 atggcagagg cccgcacatc cctgtctgcc cactgtcggg gcccgctggc cactggcctg 60 cacccagacc tggacctccc gggccgaagc ctcgccaccc ctgcgccttc ctgctacctt 120 ctgggcagcg aacccagctc tggcctgggc ctccagcccg agacccacct ccccgagggc 180 agcctgaagc ggtgctgcgt cttgggccta ccccccacct ccccagcctc ctcctcaccc 240 tgtgcctcct ccgacgtcac ctccatcatc cgctcctccc agacgtctct ggtcacctgt 300 gtaaatggac tccggagccc ccctctgacg ggagatctgg ggggcccttc caagcgggcc 360 cggcctggcc ctgcatcgac ggacagccat gagggcagct tgcaacttga agcctgccgg 420 aaggcgagct tcctgaagca ggaacccgcg gatgagtttt cagagctctt tgggcctcac 480 cagcagggcc tgccgccccc ctatcccctg tctcagttgc cgcctggccc aagccttgga 540 ggcctggggc tgggcctggc aggcagggtg gtggccgggc ggcaggcgtg ccgctgggtg 600 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ccagcccaca aggttaccag ggcagtttcc actccatcca gagttgcttc 2100 ccctatggcg actgctaccg gatggctgaa ccagcagccg gtggggacgg actggtcggg 2160 gagacccacg gtttcaaccc cctgcggccc aatggctacc acagcctcag cacgcccttg 2220 cctgccacag gctatgaggc cctggctgag gcctcatgcc ccacagcgct gccacagcag 2280 ccatctgaag atgtggtgtc cagcggcccc gaggactgtg gcttcttccc caatggagcc 2340 tttgaccact gcctgggcca catcccctcc atctacacag acacctga 2388 <210> 3 <211> 620 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GLIS1 isoform1 protein <400> 3 Met Ala Glu Ala Arg Thr Ser Leu Ser Ala His Cys Arg Gly Pro Leu 1 5 10 15 Ala Thr Gly Leu His Pro Asp Leu Asp Leu Pro Gly Arg Ser Leu Ala 20 25 30 Thr Pro Ala Pro Ser Cys Tyr Leu Leu Gly Ser Glu Pro Ser Ser Gly 35 40 45 Leu Gly Leu Gln Pro Glu Thr His Leu Pro Glu Gly Ser Leu Lys Arg 50 55 60 Cys Cys Val Leu Gly Leu Pro Pro Thr Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro 65 70 75 80 Cys Ala Ser Ser Asp Val Thr Ser Ile Ile Arg Ser Ser Gln Thr Ser 85 90 95 Leu Val Thr Cys Val Asn Gly Leu Arg Ser Pro Pro Leu Thr Gly Asp 100 105 110 Leu Gly Gly Pro Ser Lys Arg Ala Arg Pro Gly Pro Ala Ser Thr Asp 115 120 125 Ser His Glu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Ala Cys Arg Lys Ala Ser Phe 130 135 140 Leu Lys Gln Glu Pro Ala Asp Glu Phe Ser Glu Leu Phe Gly Pro His 145 150 155 160 Gln Gln Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Leu Ser Gln Leu Pro Pro Gly 165 170 175 Pro Ser Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Ala 180 185 190 Gly Arg Gln Ala Cys Arg Trp Val Asp Cys Cys Ala Ala Tyr Glu Gln 195 200 205 Gln Glu Glu Leu Val Arg His Ile Glu Lys Ser His Ile Asp Gln Arg 210 215 220 Lys Gly Glu Asp Phe Thr Cys Phe Trp Ala Gly Cys Val Arg Arg Tyr 225 230 235 240 Lys Pro Phe Asn Ala Arg Tyr Lys Leu Leu Ile His Met Arg Val His 245 250 255 Ser Gly Glu Lys Pro Asn Lys Cys Met Phe Glu Gly Cys Ser Lys Ala 260 265 270 Phe Ser Arg Leu Glu Asn Leu Lys Ile His Leu Arg Ser His Thr Gly 275 280 285 Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Gln His Pro Gly Cys Gln Lys Ala Phe Ser 290 295 300 Asn Ser Ser Asp Arg Ala Lys His Gln Arg Thr His Leu Asp Thr Lys 305 310 315 320 Pro Tyr Ala Cys Gln Ile Pro Gly Cys Ser Lys Arg Tyr Thr Asp Pro 325 330 335 Ser Ser Leu Arg Lys His Val Lys Ala His Ser Ala Lys Glu Gln Gln 340 345 350 Val Arg Lys Lys Leu His Ala Gly Pro Asp Thr Glu Ala Asp Val Leu 355 360 365 Thr Glu Cys Leu Val Leu Gln Gln Leu His Thr Ser Thr Gln Leu Ala 370 375 380 Ala Ser Asp Gly Lys Gly Gly Cys Gly Leu Gly Gln Glu Leu Leu Pro 385 390 395 400 Gly Val Tyr Pro Gly Ser Ile Thr Pro His Asn Gly Leu Ala Ser Gly 405 410 415 Leu Leu Pro Pro Ala His Asp Val Pro Ser Arg His His Pro Leu Asp 420 425 430 Ala Thr Thr Ser Ser His His His Leu Ser Pro Leu Pro Met Ala Glu 435 440 445 Ser Thr Arg Asp Gly Leu Gly Pro Gly Leu Leu Ser Pro Ile Val Ser 450 455 460 Pro Leu Lys Gly Leu Gly Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ser Ser Gln Ser 465 470 475 480 His Ser Pro Gly Gly Gln Pro Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Pro Ser 485 490 495 Tyr Pro Pro Phe Gln Ser Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Pro Gln 500 505 510 Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His Ser Ile Gln Ser Cys Phe Pro Tyr Gly 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Ser Glu Lys Ser Leu Leu Asp Leu Asp Leu Ala Glu Gly Pro Gly 100 105 110 Pro Thr Cys Cys Gln Gly Leu Phe Leu Pro Ala Gly Ser Pro Pro Pro 115 120 125 Arg Ala His Pro Gln Ala Cys Glu Arg Leu Leu His Phe Pro His Pro 130 135 140 Asp Arg Ser Pro Arg Pro Gln Ala Thr Tyr Val Asn Gly Ser Leu Pro 145 150 155 160 Thr Thr Gln His Ile Lys Gln Glu Ser Leu Pro Asp Tyr Gln Ala Met 165 170 175 Ala Glu Ala Arg Thr Ser Leu Ser Ala His Cys Arg Gly Pro Leu Ala 180 185 190 Thr Gly Leu His Pro Asp Leu Asp Leu Pro Gly Arg Ser Leu Ala Thr 195 200 205 Pro Ala Pro Ser Cys Tyr Leu Leu Gly Ser Glu Pro Ser Ser Gly Leu 210 215 220 Gly Leu Gln Pro Glu Thr His Leu Pro Glu Gly Ser Leu Lys Arg Cys 225 230 235 240 Cys Val Leu Gly Leu Pro Pro Thr Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro Cys 245 250 255 Ala Ser Ser Asp Val Thr Ser Ile Ile Arg Ser Ser Gln Thr Ser Leu 260 265 270 Val Thr Cys Val Asn Gly Leu Arg Ser Pro Pro Leu Thr Gly Asp Leu 275 280 285 Gly Gly Pro Ser Lys Arg Ala Arg Pro Gly Pro Ala Ser Thr Asp Ser 290 295 300 His Glu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Ala Cys Arg Lys Ala Ser Phe Leu 305 310 315 320 Lys Gln Glu Pro Ala Asp Glu Phe Ser Glu Leu Phe Gly Pro His Gln 325 330 335 Gln Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Leu Ser Gln Leu Pro Pro Gly Pro 340 345 350 Ser Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Ala Gly 355 360 365 Arg Gln Ala Cys Arg Trp Val Asp Cys Cys Ala Ala Tyr Glu Gln Gln 370 375 380 Glu Glu Leu Val Arg His Ile Glu Lys Ser His Ile Asp Gln Arg Lys 385 390 395 400 Gly Glu Asp Phe Thr Cys Phe Trp Ala Gly Cys Val Arg Arg Tyr Lys 405 410 415 Pro Phe Asn Ala Arg Tyr Lys Leu Leu Ile His Met Arg Val His Ser 420 425 430 Gly Glu Lys Pro Asn Lys Cys Met Phe Glu Gly Cys Ser Lys Ala Phe 435 440 445 Ser Arg Leu Glu Asn Leu Lys Ile His Leu Arg Ser His Thr Gly Glu 450 455 460 Lys Pro Tyr Leu Cys Gln His Pro Gly Cys Gln Lys Ala Phe Ser Asn 465 470 475 480 Ser Ser Asp Arg Ala Lys His Gln Arg Thr His Leu Asp Thr Lys Pro 485 490 495 Tyr Ala Cys Gln Ile Pro Gly Cys Ser Lys Arg Tyr Thr Asp Pro Ser 500 505 510 Ser Leu 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His Gly Phe Asn Pro Leu Arg Pro Asn Gly Tyr His Ser Leu 725 730 735 Ser Thr Pro Leu Pro Ala Thr Gly Tyr Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ser 740 745 750 Cys Pro Thr Ala Leu Pro Gln Gln Pro Ser Glu Asp Val Val Ser Ser 755 760 765 Gly Pro Glu Asp Cys Gly Phe Phe Pro Asn Gly Ala Phe Asp His Cys 770 775 780 Leu Gly His Ile Pro Ser Ile Tyr Thr Asp Thr 785 790 795 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siGLIS1 sense <400> 5 guccuugccc gacuaccaa 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siGLIS1 anti-sense <400> 6 uugguagucg ggcaaggac 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP_F <400> 7 gttattgcct attcctatta tg 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP_R <400> 8 gtccatcatg aagggtggaa a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCHS1_F <400> 9 ctgaaacacg gttggtgctg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DCHS1_R <400> 10 ccccagttgc 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Claims (12)

  1. GLIS1(Glis Family Zinc Finger 1) 유전자의 발현 억제제 또는 GLIS1 단백질의 활성 억제제를 포함하는 난소암 전이 억제용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자의 발현 억제제는 GLIS1 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA: shRNA) 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질의 활성 억제제는 GLIS1 단백질에 상보적으로 결합하는 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질 유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 난소암은 장액성(serous) 난소암, 점액성(mucinous) 난소암, 자궁내막양(endometroid) 난소암, 투명세포암(clear cell carcinoma), 브레너 종양(maligmant brenner tumor) 및 미분화세포암(undifferentiated carcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. GLIS1 유전자의 발현 억제제 또는 GLIS1 단백질의 활성 억제제를 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 1) GLIS1 유전자 또는 GLIS1 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 세포에 대해 GLIS1 유전자의 발현 정도 또는 GLIS1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 측정 결과에서 시험물질이 GLIS1 유전자의 발현 정도 또는 GLIS1 단백질의 발현 정도를 감소시키는 경우, 상기 시험물질을 난소암 전이 억제용 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 난소암 전이 억제용 후보물질을 스크리닝하는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 시험물질은 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, DNAzyme, PNA, 항체, 앱타머, 천연 추출물 및 합성 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 단계 2)의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction: RT-PCR), 실시간 중합효소 연쇄반응(eal-time polymerase chain reaction: real-time PCR), 웨스턴 블롯(western blot), 노던 블롯(northern blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis) 및 유세포 분석법(Fluorescence-activated cell sorting: FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것인, 방법.
  9. 1) GLIS1 단백질에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 GLIS1 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 측정 결과에서 시험물질이 GLIS1 단백질의 활성 정도를 감소시키는 경우, 상기 시험물질을 난소암 전이 억제용 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는 난소암 전이 억제용 후보물질을 스크리닝하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 단계 2)의 측정은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것인, 방법.
  11. 1) 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 GLIS1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    2) 상기 GLIS1 단백질의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 개체를 선별하는 단계; 및
    3) 상기 선별된 개체를 난소암 전이 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 난소암 전이에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  12. 1) 개체로부터 분리된 세포 또는 조직으로부터 GLIS1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계;
    2) 상기 GLIS1 단백질의 활성 수준이 정상 대조군에 비해 증가한 개체를 선별하는 단계; 및
    3) 상기 선별된 개체를 난소암 전이 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 난소암 전이에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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