CN116500277A - 核糖体蛋白l8在预测胃粘膜肠上皮化生结局中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及核糖体蛋白L8在预测胃粘膜肠上皮化生结局中的应用。具体地，本发明提供了一种预测肠化生结局的方法及所述实现所述方法的产品，所述方法包括：1)收集受试者的样本，2)对样本中RPL8的表达量进行检测，3)将检测结果与RPL8的阈值相比较，则可判断所述受试者的肠化生结局。

Description

核糖体蛋白L8在预测胃粘膜肠上皮化生结局中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及核糖体蛋白L8在预测胃粘膜肠上皮化生结局中的应用。
背景技术
胃粘膜肠上皮化生(Intestinal metaplasia，IM，肠化生)是指胃粘膜上皮细胞被肠型上皮细胞所代替，胃粘膜中出现类似小肠或大肠粘膜的上皮细胞的现象。胃癌发病与肠化生细胞外基质合成降解平衡失调、胃粘膜组织的分解退变、胃粘膜持续病理性炎症状态密切相关。胃黏膜肠化本身不引起症状，通常是在患者进行上消化道内镜检查时取胃部活检无意发现的。肠化会伴有胃酸缺乏，可导致小肠细菌过度生长，部分患者可反复出现上腹部不适、嗳气、烧心、腹泻等症状。胃黏膜肠上皮化生可分为三度：胃黏膜1/3以下者为轻度，胃黏膜1/3～2/3者为中度，大于胃黏膜2/3者为重度。
现有技术中已经提出了正常胃黏膜-慢性非萎缩性胃炎-慢性萎缩性胃炎-肠化生-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-胃癌的发展路径，研究证实肠化生是最重要的胃癌前病变之一。
根据肠化生的结局将其划分为肠化生-肠化生(好肠化，患者始终维持在肠化生阶段)和肠化生-胃癌(坏肠化，是患者从肠化生阶段逐渐进展至胃癌)2种肠化生类型(结局)，此2种肠化生的病程、进展速度、结局均具有极大差异，因此也决定了临床诊疗上完全不同的干预方式、监测频率以及随访周期等。
胃粘膜肠上皮化生阶段的诊断、干预及治疗是胃癌二级预防的重要内容，对于胃癌的防治具有重要意义，也可有效缓解我国胃癌疾病带来的经济和社会负担。目前肠化生-胃癌进展机制不明，缺乏相关生物标志物研究，导致临床无法对其进行针对性的干预。筛选肠化生-胃癌的生物标志物在阻滞肠化生进展，降低胃癌发病率等方面具有实际意义。
发明内容
本发明基于真实世界完成临床序贯病例的纳排，入组病例均为基于病理组织学确诊为肠化生的患者，且在同一医疗机构的不同时间点留取2次及以上的肠化生组织，根据其病变结局将其分为肠化生-肠化生(好肠化)和肠化生-胃癌(坏肠化)2种肠化生类型；通过收样、DSP平台处理病理切片、测序建库分析，提供了精准预测肠化生结局的重要生物标志物，有利于临床实现对肠化生患者的精准分流，显著提高肠化生的早筛、早诊、早治。
具体地，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种预测肠化生结局的方法及所述实现所述方法的产品，所述方法包括：
1)收集受试者的样本，
2)对样本中RPL8的表达量进行检测，
3)将检测结果与RPL8的阈值相比较，则可判断所述受试者的肠化生结局。
具体地，所述结局包括两种情况，在检测结果高于阈值时，预测结果为坏化生，详细地，所述坏肠化指患者从肠化生阶段逐渐进展至胃癌的情况。在检测结果不高于阈值时，预测结果为好化生，详细地，所述好肠化是指肠化生患者始终维持在肠化生阶段而不进展为胃癌患者的情况。
在一种具体的实施例中，所述预测肠化生结局也可称为胃癌的早期诊断、预测肠化生进展为胃癌的可能性。
示例性地，所述实现预测肠化生结局的方法的产品包括设备、计算机可读存储介质、系统等。
优选地，所述高于阈值也可以理解为高表达，所述高表达是指基因表达水平大于对照群体中表达水平，相对于对照高至少1.1倍，例如至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍或更多。
在本发明中是所述对照群体是维持在肠化生阶段而不进展为胃癌(肠化生-肠化生)的群体，也即好肠化的群体。
本发明中“样本”可以包括但不限于组织活检物、切除的组织、组织提取物、外周血、腹水液、组织间液、骨髓、脑脊液、胸腔积液、肿瘤浸润物、唾液、黏液、痰、精液、汗水、尿。
优选地，所述样本是组织。
更具体地，本发明涉及的组织包括行内镜或手术用于诊断或干预治疗肠化生患者所留取的肠化生组织。
优选地，本发明涉及的组织是通过石蜡包埋方法进行保存的组织样本。
优选地，所述受试者为人或非人的其他动物，更具体地，所述受试者为肠化生患者。
另一方面，本发明提供了检测RPL8表达量的试剂在制备预测肠化生结局的产品中的应用。
优选地，所述检测表达量的试剂包括检测mRNA表达量的试剂和/或检测蛋白表达量的试剂。
优选地，所述检测标志物蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，简称HE染色法)、番红O-固绿染色、蛋白质印迹(Western Blot法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、免疫组织化学(Immunohistochemistry)染色方法、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分辨技术和蛋白质芯片法。
优选地，所述检测标志物mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR原理的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。
具体地，所述试剂可以包括检测标志物蛋白表达量的方法(也可以称为免疫方法、蛋白检测方法，是基于特异性结合的检测方法)中可能使用的以下成分：封闭液、抗体稀释液、缓冲液(清洗缓冲液、封闭缓冲液等)、显色终止液、制备标准曲线的标准品等。
具体地，所述试剂可以包括聚合酶链式反应体系，所述聚合酶链式反应体系包含：PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料等。更具体地，所述试剂还可以包括使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、cDNA扩增试剂、制备标准曲线所用的标准品等。
优选地，为读取检测结果，所述产品中还可以含有可检测的标记，例如酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、放射性核素(如3H、125I、35S、14C、32P等)、荧光染料(如FITC、TRITC、PE、Texas Red、量子点、Cy7、Alexa 750等)、吖啶酯类化合物、磁珠、胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)或生物素。
优选地，所述产品中还包括检测JUN和/或ETS2表达量的试剂。如本领域所熟悉的，增加生物标志物的数量可以提高预测的准确性。
进一步，所述产品中还可以包含选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、滤器、缓冲液(例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂(如通过酶标记发生化学改变的底物)、表位修复溶液、对照切片等。
如本发明所述，术语“标志物”或“生物标志物”一般指其在组织或细胞中/上表达或分泌的可以通过已知的方法(或本发明所披露的方法)来检测且是预测性的或可以用于预测(或帮助预测)患者患病风险的分子，所述生物标志物包括基因、mRNA、蛋白质或以上任意一种的衍生物。本发明中特别感兴趣的生物标志物主要是RPL8，还包括JUN和/或ETS2。更具体地，JUN、ETS2在细胞核中表达，RPL8在细胞质中表达，JUN、ETS2、RPL8均在肠化生组呈低表达，在胃癌组呈高表达。
术语“表达量”或“表达水平”通常可互换使用，且一般指生物学样品中多核苷酸、mRNA或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此，依照本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白质、或甚至蛋白质的翻译后修饰的步骤，转录得到的多核苷酸的、翻译得到的蛋白质的、或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的产物。
另一方面，本发明提供了一种基于RPL8的肠化生结局预测装置及其应用，所述预测装置包括：
获取单元，用于获取待测样本的RPL8表达数据；
处理单元，用于将所述RPL8表达数据与阈值相比较，获得待测样本肠化生结局预测的预测结果。
优选地，所述阈值的确定方式包括：
1)获取肠化生患者的RPL8表达数据；
2)根据所述肠化生患者的结局将其分为好肠化和坏肠化两组
3)将两组患者的RPL8表达数据进行数据分析，则获得阈值。
更具体地，所述肠化生患者的结局需在检测步骤1)中所述RPL8表达数据检测后一定时间进行，例如1年、2年、3年、4年、5年或更久。或者，所述步骤1)中的RPL8表达数据是可以通过对早期保存的样本进行检测而得到的，具体地是早期在肠化生阶段时得到的样本。
如本领域技术人员所公知的，本发明所述“阈值”或“cutoff”取决于特定的测量技术，不同的测量技术会得到不同的测量结果。如果使用不同的方法，则可能需要类推转换。但这种转换是在本领域技术人员技能范畴之内的。同时，容易理解的是，不同生物标志物的阈值不相同，需根据实际检测情况确定，其确定方法是本领域技术人员所熟悉的。
在本申请所提供的几个实施例中，应该理解到，所述装置可以通过其它的方式实现。例如，所述单元的划分，仅仅为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式。
优选地，所述装置还包括显示单元、通信单元等其他为了合理使用本发明装置而另设的附加设备。
优选地，所述预测装置中获取单元还可以获取待测样本的JUN和/或ETS2表达数据；以及所述处理单元还可以将所述JUN和/或ETS2表达数据与相应的阈值相比较，获得待测样本肠化生结局预测的预测结果。在JUN、ETS2和RPL8中至少一种生物标志物的表达量高于其对应的阈值时，则预测结果为坏肠化。
同时，容易理解的是，不同生物标志物的阈值不相同，需根据实际检测情况确定，其确定方法是本领域技术人员所熟悉的。
另外，在本发明各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理单元中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个单元中。上述集成的单元既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能单元的形式实现。
本发明所述“肠化生结局预测”也可以称为区分好肠化和坏肠化患者、预测肠化生患者进展为胃癌的可能性、预测肠化生患者的结局，或者，胃癌早期诊断。
附图说明
图1是基于DSP技术获取肠化生－胃癌的细胞形态学标记图像与对应的IHC图像；A：肠化生；B：胃腺癌。
图2是CD45和PanCK为细胞形态学标记的背景下得到的肠化生-癌差异基因火山图；A是CD45为细胞形态学标记，B是PanCK为细胞形态学标记。
图3是免疫组化实验鉴定RPL8在肠化生组织和胃癌组织中表达情况的结果图。
图4是RPL8在肠化生-胃癌组间差异统计分析结果图。
图5是在人肠化生-胃癌组织中RPL8免疫组化半定量分析结果绘制的ROC曲线。图6是在人肠化生-胃癌组织中JUN、ETS2和RPL8免疫组化半定量分析结果绘制的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、通过数字空间分析技术平台筛选差异基因
1、实验材料
临床序贯人胃粘膜肠化生组织8例
数字空间分析(GeoMx Digital Spatial Profiler，DSP)技术平台
2、实验方法
2.1临床样本收集
病例样本收集：以望京医院为中心单位，联合各个分中心单位，基于临床医生、病理学专家、临床患者、就诊系统等多途径收集肠化生患者。根据肠化生结局分组如下：
肠化生-肠化生(好肠化组)：肠化生后的时间点依然保持肠化生(5年以内未进展)；
肠化生-胃癌(坏肠化组)：肠化生后的时间点进展为胃黏膜上皮内瘤变或胃癌；
共纳入2组，每组4例，共8例。所选组织均为10％的中性缓冲福尔马林固定的石蜡包埋组织。
2.2DSP技术平台分析
胃粘膜肠化生序贯组织样本切片制备。切片厚度为5μm，推荐使用新鲜切片，如需要保存，保存时间不能超过14天；如果样品表面暴露于空气中，最初的2-3片弃掉不用；3year-old FFPE blocks；组织切片须放置于玻片上的有效位置内(长35.3mm×宽14.1mm)，若每张载玻片上有多个切片，请确保组织间隔至少2–3mm，具体放置情况可根据组织大小确定；推荐使用阳离子防脱片(SuperFrostTM Plus载玻片)来制备切片，以防出现组织脱落。质控合格后使用。
石蜡组织切片及HE染色：石蜡切片脱蜡，梯度酒精水化；蒸馏水洗；苏木素染8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化3-5秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗；伊红染色1-3min；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；免疫组织化学染色：常规组织固定、脱水、包埋、石蜡切片，65℃烤片1h，脱蜡、水化，酶修复法进行抗原修复，细胞样本95％乙醇充分固定，3％过氧化氢孵育10min，PBS洗2次，一抗孵育30min，PBS洗2次，二抗孵育20min，PBS洗2次，DAB染色，自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片；
病理HE载玻片备用，启用DSP分析平台，RNA探针原位杂交孵育，形态学markers染色，加载仪器并设置；将载玻片装入仪器，识别载玻片，定义扫描区域，可选择ROIs，点击“Approve ROIs”进入UV切割，通过毛细管针将切割后的oligos收集到孔板中；NGS文库制备和质控；测序文库构建质控，对Oligo进行Illumina测序定量。获取好肠化和坏肠化的差异基因，进行生信分析。
2.2关键差异基因筛选
通过DSP分析平台得到好肠化和坏肠化组的差异表达基因，标记基因的筛选条件为：adjusted p-value<0.05；Log2(fold change)>1.2。
3、实验结果
图1是基于DSP技术获取肠化生－胃癌的细胞形态学标记图像与对应的IHC图像。A.肠化生：该列的图片依次为肠化生的HE图像、基于DSP技术获取的同部位形态学标记图像、CD45形态学标记图像、PanCK形态学标记图像；B.胃腺癌：该列的图片依次为胃腺癌的HE图像、基于DSP技术获取的同部位形态学标记图像、CD45形态学标记图像、PanCK形态学标记图像。
分别以CD45(炎症细胞)和PanCK(上皮细胞)为细胞形态学标记的背景基础，筛选获得了CD45/PanCK共同表达的一组肠化生-胃癌的差异基因，其中包括：JUN、ETS2、RPL8。差异基因火山图如图2所示。
表1、CD45、PanCK基础上肠化生-癌的差异基因表
实施例2、分子标志物鉴定实验
1、实验材料
人胃粘膜肠化生组织30例
Anti-JUN Antibody(JUN，博士德生物，BM4168，)
RabbitAnti-ETS2 antibody(ETS2，博奥森生物，bs-5964R)
Anti-RPL8 Antibody(RPL8，博士德生物，A06793-1)
2、实验方法
2.1标本收集
按照实施例1中2.1临床样本收集的标准另收集人胃粘膜肠化生组织30例。样本为根据临床实际诊疗情况，必须行内镜或手术用于诊断或干预治疗肠化生/胃癌患者所留取的肠化生/胃癌病变组织。
2.2免疫组化染色及判读
常规组织固定、脱水、包埋、石蜡切片，65℃烤片1h，脱蜡、水化，酶修复法进行抗原修复，细胞样本95％乙醇充分固定，3％过氧化氢孵育10min，PBS洗2次，一抗孵育30min，Anti-Aggrecan Antibody稀释浓度为1:50，PBS洗2次，二抗孵育20min，PBS洗2次，DAB染色，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。封片后使用显微镜观察染色结果。
切片的病理学结果由两名经验丰富的病理学家双盲阅片，并使用共识解释作为最终的结果。不同的结果由第三位病理学家裁决。
2.3ROC曲线
随机对每张免疫组化切片进行3个视野的随机采图，每个视野在10X镜下被拍摄。通过image pro plus软件分析每张切片3个随机视野的JUN、ETS2+阳性细胞数，将细胞总数进行统计分析；RPL8+阳性表达的积分光密度采用3个随机视野的平均值。病理学结果由两名病理学家独立分析，并使用共识解释作为最终的结果，不同的结果由第三位病理学家裁决。
采用spss软件通过平均值对人肠化生-胃癌组织绘制ROC曲线，计算AUC曲线下面积和阈值，评价新发现的肠化生-胃癌特征性基因RPL8以及标志物组合对肠化生病变程度的诊断价值。
3、实验结果
3.1免疫组化实验结果
通过免疫组化(IHC)实验鉴定RPL8在人胃粘膜肠化生-胃癌组织中的表达趋势。
可见胃癌组较肠化生组RPL8阳性细胞的数量明显增多，肠化生组阳性细胞约占总细胞的10-30％，胃癌组阳性细胞约占总细胞的50-70％。也即，RPL8在肠化生组呈低表达，在胃癌组呈高表达。结果如图3所示，RPL8在肠化生-胃癌的细胞质中呈阳性表达，RPL8在肠化生组呈低表达，在胃癌组呈高表达。
3.2ROC曲线分析
组间统计学差异见图4，RPL8在肠化生组与胃癌组的表达相比(L/H)存在显著差异P＝0.0003，P<0.001，H代表胃癌高表达组L代表肠化生低表达组。免疫组化半定量分析结果及其ROC曲线如图5。联合其他标志物(JUN+ETS2)进行检测，ROC曲线如图6所示。ROC曲线参数如表2所示。
表2、RPL8和标志物组合(JUN、ETS2和RPL8)的ROC曲线参数
结果表明JUN和标志物组合是能够区分肠化生-胃癌病变的生物标志物，尤其在区别诊断肠化生类型和极早期胃癌中存在价值。

Claims (10)

1.检测RPL8表达量的试剂在制备预测肠化生结局的产品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，所述试剂包括基于扩增进行的表达量检测方法所使用的试剂、通过免疫检测方法检测表达量的试剂、原位杂交检测方法检测表达量的试剂、基因芯片、或高通量测序平台。
3.如权利要求1所述应用，所述检测表达量的试剂包括检测mRNA表达量的试剂和/或检测蛋白表达量的试剂。
4.如权利要求3所述应用，所述检测标志物蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：免疫组织化学染色方法、苏木精-伊红染色法、番红O-固绿染色、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、夹心测定、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分辨技术和蛋白质芯片法。
5.如权利要求3所述应用，所述检测标志物mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR原理的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。
6.如权利要求1所述应用，所述检测是针对来自受试者的样本进行的，所述样本是组织；
更具体地，所述组织包括内镜或手术所留取的肠化生组织；
优选地，所述组织包括通过石蜡包埋方法进行保存的组织。
7.如权利要求6所述应用，所述受试者为人；更优选地，所述受试者是肠化生患者。
8.如权利要求1所述应用，所述产品中还包括检测JUN和/或ETS2表达量的试剂。
9.一种基于RPL8的肠化生结局预测装置，包括：
获取单元，用于获取待测样本的RPL8表达数据；
处理单元，用于将所述RPL8表达数据与阈值相比较，获得待测样本肠化生结局预测的预测结果。
10.如权利要求9所述装置，所述阈值的确定方式包括：
1)获取肠化生患者的RPL8表达数据；
2)根据所述肠化生患者的结局将其分为好肠化和坏肠化两组
3)将两组患者的RPL8表达数据进行数据分析，则获得阈值。
CN202310490658.4A 2023-05-04 2023-05-04 核糖体蛋白l8在预测胃粘膜肠上皮化生结局中的应用 Pending CN116500277A (zh)

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