CN115125287A - 受试者中的心血管疾病发病风险和血管钙化的判定方法及检查试剂盒 - Google Patents

受试者中的心血管疾病发病风险和血管钙化的判定方法及检查试剂盒 Download PDF

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玉田瑛弥
N·埃尔纳兹
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Abstract

本发明旨在提供通过使用血液试样，更简便地判定受试者中的心血管疾病的发病风险的方法。由上述受试者中的心血管疾病的发病风险的判定方法解决课题，包括在固相上捕获来源于从受试者采集的血液试样的细胞外囊泡的工序，和对上述细胞外囊泡的碱性磷酸酶活性进行测定的工序，上述碱性磷酸酶活性的测定结果成为上述受试者中的心血管疾病的发病风险的指标。

Description

受试者中的心血管疾病发病风险和血管钙化的判定方法及检 查试剂盒
【技术领域】
本发明涉及判定受试者中的心血管疾病的发病风险的方法、判定受试者中的血管钙化的方法、及检查试剂盒。
【背景技术】
心血管疾病起因于年龄的增加、生活习惯、脂质异常症、高血压、糖尿病等的要因经长期发生相关的结果的血管钙化而患病。血管钙化是在正常情况下理应不发生钙结晶的沉积的的血管组织发生的异位性钙化(非专利文献1)。在以往临床现场的血管钙化的评价中，使用利用CT图像的冠状动脉钙化评分(以下，称为“CAC评分”或“CAC-S”)。报告了CAC评分与心血管事件的发病率显示正的相关。
【现有技术文献】
【非专利文献】
【非专利文献1】日肾会志2014；56(8)：1196-1200“生物体内的钙化机构”
【发明的概要】
【发明要解决的课题】
CAC评分尽管在临床现场中利用，不得不取得CT图像，难说是简便的评价方法。
本发明旨在提供通过使用血液试样，更简便地判定受试者中的心血管疾病的发病风险的方法、及判定受试者中的血管钙化的方法。另外，旨在提供用于在这些判定方法中使用的检查试剂盒。
【用于解决课题的手段】
本发明涉及判定受试者中的心血管疾病的发病风险的方法，其包括：在固相上捕获来源于从受试者采集的血液试样的细胞外囊泡的工序，和对上述细胞外囊泡的碱性磷酸酶活性进行测定的工序，上述碱性磷酸酶活性的测定结果成为上述受试者中的心血管疾病的发病风险的指标。
本发明涉及判定受试者中的血管钙化的方法，其包括在固相上捕获来源于从受试者采集的血液试样的细胞外囊泡的工序，和对上述细胞外囊泡的碱性磷酸酶活性进行测定的工序，上述碱性磷酸酶活性的测定结果成为上述受试者中的血管钙化的指标。
本发明涉及用于判定受试者中的心血管疾病的发病风险的方法或判定受试者中的血管钙化的方法的检查试剂盒，其含在固相上捕获细胞外囊泡的捕获抗体和用于捕获上述捕获抗体的固相。
【发明的效果】
通过使用血液试样，可更简便地判定受试者中的心血管疾病的发病风险、及/或受试者中的血管钙化。
【附图的简单的说明】
【图1】是血管的钙化部位的模式图。
【图2】是显示检查试剂盒的外观的图。
【图3A】显示购入的正常血浆受试体的供体信息的详细。
【图3B】显示购入的心血管疾病(CVD)既往患者受试体的供体信息的详细。
【图3C】显示购入的慢性肾脏病(CKD)患者受试体的供体信息的详细。
【图3D】显示购入的CAC评分附带受试体的供体信息的详细。
【图4A】显示在ELISA中使用的市售品的试剂。
【图4B】显示在ELISA中使用的自身调制试剂。
【图5A】是诱导2周后的位相差显微镜图像。左图显示未进行转化诱导的细胞。右图显示进行转化诱导的细胞。
【图5B】是诱导2周后的茜素红染色图像。左图显示未进行转化诱导的细胞。右图显示进行转化诱导的细胞。
【图5C】显示对钙量进行测定的结果。
【图5D】显示进行转化诱导的细胞的培养上清的纳米粒子追踪解析的结果。
【图5E】显示未进行转化诱导的细胞的培养上清的超离心后的沉渣和进行转化诱导的细胞的培养上清的超离心后的沉渣的碱性磷酸酶(ALP)活性。
【图6A】显示作为捕获抗体而使用抗CD9抗体时的碱性磷酸酶(ALP)的活性和细胞外囊泡的粒子数之间的稀释直线性。添加粒子数由纳米粒子追踪解析测定。
【图6B】显示作为捕获抗体而使用抗CD63抗体时的碱性磷酸酶(ALP)的活性和细胞外囊泡的粒子数之间的稀释直线性。添加粒子数由纳米粒子追踪解析测定。
【图6C】显示作为捕获抗体而使用抗Pit1抗体时的碱性磷酸酶(ALP)的活性和细胞外囊泡的粒子数之间的稀释直线性。添加粒子数由纳米粒子追踪解析测定。
【图6D】显示作为捕获抗体而使用抗膜联蛋白VI抗体时的碱性磷酸酶(ALP)的活性和细胞外囊泡的粒子数之间的稀释直线性。
【图7A】显示与用抗CD9抗体-ALP系测定的健康者的血浆(n＝4)和赋予CAC-S的CVD患者的血浆(n＝5)的碱性磷酸酶(ALP)的活性的比较。
【图7B】显示在抗CD9抗体-ALP系中测定的健康者的血浆(n＝4)和CVD患者的血浆(n＝16)的碱性磷酸酶(ALP)的活性的比较。
【图7C】显示在抗CD9抗体-ALP系中测定的健康者的血浆(n＝4)和CKD患者的血浆(n＝5)的碱性磷酸酶(ALP)的活性的比较。*p＜0.05及**p＜0.01表示显著差异。
【图8】显示在抗CD63抗体-ALP系中测定的健康者的血浆(n＝4)和赋予CAC-S的CVD患者的血浆(n＝6)的碱性磷酸酶(ALP)活性的比较。*p＜0.05表示显著差异。
【图9】显示在抗膜联蛋白VI抗体-ALP系中测定的健康者的血浆(n＝4)和CKD患者的血浆(n＝5)的碱性磷酸酶(ALP)活性的比较。*p＜0.05表示显著差异。
【图10】显示在抗Pit1抗体-ALP系中测定的健康者的血浆(n＝4)和赋予CAC-S的CVD患者的血浆(n＝6)的碱性磷酸酶(ALP)活性的比较。*p＜0.05表示显著差异。
【图11】显示4个分析系的分析性能比较。
【图12A】显示由抗CD9抗体-ALP系测定的碱性磷酸酶(ALP)活性和CAC评分的相关。
【图12B】显示由抗CD63抗体-ALP系测定的碱性磷酸酶(ALP)活性和CAC评分的相关。
【图12C】显示由抗Pit1抗体-ALP系测定的碱性磷酸酶(ALP)活性和CAC评分的相关。
【具体实施方式】
【1.受试者中的心血管疾病的发病风险的判定方法】
首先，对于血管的钙化，使用图1进行说明。图1是血管的钙化部位的模式图。动脉硬化在LDL-胆甾醇沉积的血管内皮中，通过形成噬斑发生。在血管内皮细胞(内膜)和血管平滑肌细胞(中膜)之间放入LDL-胆甾醇，收取其的巨噬细胞在血管内皮下成为泡沫细胞，通过蓄积形成粥样硬化。在粥样硬化内引发位于血管中膜的血管平滑肌细胞向内膜的游走，再者，诱导向成骨细胞样细胞的转化。结果，产生含羟基磷灰石的钙化细胞外囊泡(钙化EV)，在粥样硬化形成部位发生钙化。一般而言，钙化细胞外囊泡稳定，不认为离开粥样硬化形成部位而释放到血管内。钙化细胞外囊泡含一般被认为存在于细胞外囊泡的蛋白质(例如，CD9、CD63、CD81等)、对钙化细胞外囊泡具有特异性的蛋白质(膜联蛋白VI、Pit1等)等。再者，钙化细胞外囊泡含膜型的碱性磷酸酶(ALP)。
在本发明的实施方式中，通过使用从受试者采集的血液试样，对血液试样中的碱性磷酸酶活性进行测定，判定受试者中的心血管疾病的发病风险。具体而言，此方法包括在固相上捕获来源于从受试者采集的血液试样的细胞外囊泡的工序(以下，有时称为“工序1”)，及对上述细胞外囊泡的碱性磷酸酶活性进行测定的工序(以下，有时称为“工序2”)，碱性磷酸酶活性的测定结果成为上述受试者中的心血管疾病的发病风险的指标。再者，在此判定方法中实施的测定全部在体外进行。
(1)工序1
在工序1中，在固相上捕获来源于从受试者采集的血液试样的细胞外囊泡。
受试者不特别限制。例如，受试者是有动脉硬化的发病风险的患者。具体而言，受试者可例示具有肥胖症的者、具有高血压症的者、具有高脂血症的者、具有糖尿病的者、具有肾功能障碍的者等。
在心血管疾病中，可含选自缺血性心脏疾病、缺血性脑疾病、及缺血性肠道障碍的至少1种。在缺血性心脏疾病中，可含心绞痛、心肌梗塞等。在缺血性脑疾病中，可含脑梗塞等。在缺血性肠道障碍中，可含肠梗塞等。
血液试样，例如，是全血、血浆或血清。在作为血液试样而使用血浆时，在采血时使用的抗凝固剂不限制。可使用EDTA钾盐、EDTA钠盐、柠檬酸钠、肝素盐等。
细胞外囊泡(以下，也称为“EV”)是被从细胞释放的以磷脂作为主成分的膜覆盖的粒子，具有数十至数千nm程度的尺寸。在细胞外囊泡中，含外泌体、微囊泡、凋亡小体等。在多数情况，在细胞外囊泡内或细胞外囊泡的膜上，存在生物体分子。例如，外泌体或微囊泡含多肽、多核苷酸(mRNA、miRNA、非编码RNA等的RNA、及DNA)等。例如，凋亡小体含多肽、多核苷酸、片段化的核、细胞器等。其中，多肽是指多个氨基酸经肽键键合的化合物，含分子量的比较大的蛋白质及分子量的比较小的肽。
在工序1中，在固相上捕获细胞外囊泡的方法不特别限定，可使用公知的手段。例如，可使血液试样、与细胞外囊泡结合的捕获体和固相接触，在固相上形成含细胞外囊泡和捕获体的复合体(以下，也称为“捕获体-EV复合体”)。优选地，固相和捕获体各自含结合物质和结合偶体。作为结合物质，例示亲和素、亲和素样物质(链霉亲和素、Tamavidin(商标)、NeutrAvidin等)、针对结合偶体的抗体等。结合偶体是与结合物质特异性地结合的物质，例示生物素、生物素类似物、2,4-二硝基苯酚等。优选捕获体经结合物质和结合偶体与固相结合。作为捕获体，只要是能与细胞外囊泡特异性地结合的物质，就不特别限定，例如，可使用抗体、适体等。
在工序1中，可使固定捕获体的固相接触含细胞外囊泡的血液试样，在固相上形成捕获体-EV复合体。捕获体、血液试样和固相的接触顺序不特别限定。例如，使固相和血液试样先接触，其后添加捕获体。在别的实施方式中，使固相和捕获体先接触，其后添加血液试样。此时，优选地，在固相上固定捕获体之后，由B/F分离除去未反应的游离成分，其后添加血液试样。在别的实施方式中，通过使捕获体和含细胞外囊泡的血液试样先接触，在溶液中形成捕获体-EV复合体，其后添加固相。在任何实施方式中，也优选在固相上形成捕获体-EV复合体之后，在实施工序2之前进行B/F分离。工序1的反应通常在缓冲液中进行。缓冲液中所含的缓冲剂的种类只要是不是抑制反应的物质，就不特别限定，可使用本领域公知的物质。另外，在B/F分离中，可使用缓冲剂、含表面活性剂等的清洗液。缓冲剂或表面活性剂只要是可适合地进行B/F分离的物质，就不特别限定，可使用本领域公知的物质。反应时间或反应温度等的条件可由捕获体的种类等适宜调整。
尽管在固相上捕获细胞外囊泡之前进行由尺寸排除层析法、超离心法、亲和性纯化法、聚合物沉淀法等的细胞外囊泡的提取作业，本实施方式即使不进行这些提取作业也能测定。
作为捕获体使用的抗体(以下，称为“捕获抗体”)只要是能捕获细胞外囊泡，就不限制。优选为捕获抗体至少能与存在于细胞外囊泡中的蛋白质的一部分结合。另外，捕获抗体可仅使用1种，也可使用多种。“抗体”也可使用多克隆抗体、单克隆抗体、还原型抗体、双特异性抗体及它们的片段(例如，Fab、F(ab')、F(ab)2等)之任一者。免疫球蛋白的类及亚类不特别限制。另外，上述抗体可从抗体库筛选，也可为嵌合抗体、scFv等。
作为捕获抗体，例如，可举出抗CD9抗体(克隆：H19a,12A12等)、抗CD63抗体(克隆：H5C6等)、CD81(克隆：5A6等)、抗膜联蛋白VI抗体(克隆：E-5等)、抗Pit1抗体/SLC20A1(克隆：6A9-F2等)的抗体等，可使用这些中至少1种。对于这些抗体，可使用市售品。
作为固相，可使用本领域公知的固相。固相的原料不特别限定，例如，可选自有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可将这些中的2种以上组合使用。固相的形状不特别限定，例如，可举出粒子、微平板、膜、微管、试管等。
(2)工序2
在工序2中，测定到细胞外囊泡的碱性磷酸酶活性。具体而言，在上述(1)中使捕获到固相的细胞外囊泡和碱性磷酸酶的底物接触，测定到由酶反应发生的产物。此产物的测定值是反映碱性磷酸酶活性的值。测定条件只要是碱性磷酸酶显示活性的条件，就不限制。
作为碱性磷酸酶的底物，可举出CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物等。特别优选为化学发光底物CDP-Star(注册商标)。由酶反应发生的发光优选用光度计检测化学发光信号。
(3)对于心血管疾病的发病风险判定
如后述的实施例所示，CAC评分高的受试者相比CAC评分低的受试者碱性磷酸酶活性相对显著地高，CAC评分和碱性磷酸酶活性相关。知晓CAC评分对于心血管疾病的风险预测有用。从而，碱性磷酸酶活性的测定结果可作为受试者的心血管疾病的风险的指标利用。其中，CAC评分是由冠状动脉CT定量化钙化重症度的数值，作为钙化的重症度的指标使用。CAC评分0分评价为无钙化(无斑)，1～10分评价为极轻度(少量斑)，11～100分评价为轻度(一些斑)，101～400分评价为中度(中等量斑)，401分以上评价为高度(大量斑)。
在本说明书中，“碱性磷酸酶活性的测定结果”可为反映碱性磷酸酶的活性的值。所述值是例如化学发光强度的测定值。化学发光强度的测定值是反映由酶反应发生的产物的物质量的值，所述值反映碱性磷酸酶的活性。
在优选的实施方式中，碱性磷酸酶活性的测定结果在指定的阈值以上之时，提示上述受试者中的心血管疾病的发病风险高。在别的优选的实施方式中，碱性磷酸酶活性的测定结果不足指定的阈值之时，提示上述受试者中的心血管疾病的发病风险低。在更优选的实施方式中，碱性磷酸酶活性的测定结果在指定的阈值以上之时，提示上述受试者中的心血管疾病的发病风险高，碱性磷酸酶活性的测定结果不足指定的阈值之时，提示上述受试者中的心血管疾病的发病风险低。
“指定的阈值”是指碱性磷酸酶活性的测定结果的阈值。所述阈值可基于CAC评分低的受试者或健康者的碱性磷酸酶活性的测定结果和CAC评分高的受试者的碱性磷酸酶活性的测定结果而设定。
例如，使用从多个健康者采集的血液试样取得碱性磷酸酶活性的测定结果，使用从CAC评分401分以上的多个受试者采集的血液试样取得碱性磷酸酶活性的测定结果。可以可基于这些测定结果而最高精度地分类健康者和CAC评分401分以上的受试者的值作为“阈值”。其中，“可最高精度地分类的值”可由检查的目的，考虑灵敏度、特异性、阳性的中率、阴性的中率等的指标而适宜设定。例如，可基于ROC解析等而设定。
在多个健康者中的碱性磷酸酶活性的测定结果之中，也可以最高的测定结果作为阈值。在需要高额的治疗时，在治疗药的副作用强时等，有减少治疗行为导致的患者的经济的－身体的负担的必要时，由于使假阳性尽可能降低，可适宜地使用所述阈值。
也可从CAC评分401分以上的多个受试者中的碱性磷酸酶活性的测定结果之中以最低的测定结果作为阈值。如筛选检查一样，在想要使假阴性尽可能降低时，可适宜地使用所述阈值。
“碱性磷酸酶活性的测定结果”也可为相同受试者中的测定结果的经时变化。所述经时变化成为心血管疾病的发病风险的指标。例如，也可对特定的一位受试者的第1时间点的测定结果和第2时间点的测定结果进行比较，由其测定结果的变化评价心血管疾病的发病风险。再者，第1时间点和第2时间点是不同的时间点。在评价在第2时间点的测定结果时，也可作为“阈值”，使用在第1时间点的测定结果。
本发明的别的实施方式是包括上述的工序1、上述的工序2及判定工序的心血管疾病的发病风险的判定方法。判定工序是基于工序2中得到的碱性磷酸酶活性的测定结果而判定上述受试者中的心血管疾病的发病风险的工序。在判定工序中，也可对碱性磷酸酶活性的测定结果和阈值进行比较，基于比较结果而判定发病风险。在所述比较中，在碱性磷酸酶活性的测定结果在阈值以上时，可判定为心血管疾病的发病风险高，在碱性磷酸酶活性的测定结果不足阈值时，可判定为心血管疾病的发病风险低。
再者，也可包括对判定为发病风险高的受试者进行对于心血管疾病的医学介入的工序。包括所述工序的实施方式涉及由上述的判定方法治疗心血管疾病的发病风险高的受试者的方法(以下，也称为“治疗方法”)。医学介入的例含降压疗法、与心血管疾病或血管钙化相对应的药剂的施用等。作为药剂的例，可举出磷吸附药、高胆甾醇治疗药、血栓溶解剂、抗血栓药、抗血小板药、血管扩张药等。
【2.受试者中的血管钙化的判定方法】
受试者中的血管钙化的判定方法包括在固相上捕获来源于从受试者采集的血液试样的细胞外囊泡的工序(以下，有时称为“工序A”)，及对上述细胞外囊泡的碱性磷酸酶活性进行测定的工序(以下，有时称为“工序B”)，碱性磷酸酶活性的测定结果成为受试者中的血管钙化的指标。再者，在此判定方法中实施的测定全部在体外进行。工序A及工序B各自与上述工序1及工序2同样。
如后述的实施例所示，CAC评分高的受试者相比CAC评分低的受试者碱性磷酸酶活性相对显著地高，CAC评分和碱性磷酸酶活性相关。另外，在CVD患者或CKD患者中，与健康者相比碱性磷酸酶活性显著地高。知晓CAC评分成为血管钙化的指标，另外，在CVD患者或CKD患者中观察到血管钙化。即，碱性磷酸酶活性的测定结果可作为受试者的血管钙化的指标利用。
优选为碱性磷酸酶活性的测定结果在指定的阈值以上时，提示上述受试者中存在血管钙化、或者血管钙化的亢进。另外，碱性磷酸酶活性的测定结果不足指定的阈值之时，提示上述受试者中不存在血管钙化、或者治疗等导致的血管钙化的改善。
“指定的阈值”是指碱性磷酸酶活性的测定结果的阈值。所述阈值可基于CAC评分低的受试者或健康者的碱性磷酸酶活性的测定结果和CAC评分高的受试者、CVD患者或CKD患者的碱性磷酸酶活性的测定结果而设定。
例如，使用从多个健康者采集的血液试样取得碱性磷酸酶活性的测定结果，取得使用从CAC评分401分以上的多个受试者采集的血液试样的碱性磷酸酶活性的测定结果。可以可基于这些测定结果而最高精度地分类健康者和CAC评分401分以上的受试者的值作为“阈值”。其中，“可最高精度地分类的值”可由检查的目的，基于灵敏度、特异性、阳性的中率、阴性的中率等的指标而适宜设定。例如，可基于ROC解析等而设定。
在多个健康者中的碱性磷酸酶活性的测定结果之中，也可以最高的测定结果作为阈值。在需要高额的治疗时，在治疗药的副作用强时等，有减少治疗行为导致的患者的经济的－身体的负担的必要时，由于使假阳性尽可能降低，可适宜地使用所述阈值。
也可从CAC评分401分以上的多个受试者中的碱性磷酸酶活性的测定结果之中以最低的测定结果作为阈值。如筛选检查一样，在想要使假阴性尽可能降低时，可适宜地使用所述阈值。
“碱性磷酸酶活性的测定结果”也可为相同受试者中的测定结果的经时变化。所述经时变化成为心血管疾病的发病风险的指标。例如，也可对特定的一位受试者的第1时间点的测定结果和第2时间点的测定结果进行比较，由其测定结果的变化评价心血管疾病的发病风险。再者，第1时间点和第2时间点是不同的时间点。在评价在第2时间点的测定结果时，也可作为“阈值”，使用在第1时间点的测定结果。
本发明的别的实施方式是包括上述的工序A、上述的工序B及判定工序的血管钙化的判定方法。判定工序是基于工序B中得到的碱性磷酸酶活性的测定结果而判定上述受试者中的血管钙化的工序。在判定工序中，也可对碱性磷酸酶活性的测定结果和阈值进行比较，基于比较结果而判定血管钙化。在所述比较中，在碱性磷酸酶活性的测定结果在阈值以上时，可判定为存在血管钙化，在碱性磷酸酶活性的测定结果不足阈值时，可判定为不存在血管钙化。
再者，也可包括对判定为存在血管钙化的受试者进行对于心血管疾病的医学介入的工序。包括所述工序的实施方式涉及由上述的判定方法治疗判定为存在血管钙化的受试者的方法(以下，也称为“治疗方法”)。医学介入的例含降压疗法、与心血管疾病或血管钙化相对应的药剂的施用等。作为药剂的例，可举出磷吸附药、高胆甾醇治疗药、血栓溶解剂、抗血栓药、抗血小板药、血管扩张药等的施用。
【3.检查试剂盒】
本发明的有的实施方式涉及在上述1或上述2.中所述的方法中使用的检查试剂盒。检查试剂盒的一例示于图2。在检查试剂盒50中，包括含捕获体的第1容器51、作为固相含多个粒子的第2容器52、及含碱性磷酸酶的底物的第3容器53、记载了所述试剂盒的使用方法等的附带文书54。这些收容在捆包箱55。关于捕获体、固相及碱性磷酸酶的底物的说明将上述1.的说明援用于其中。在图2的例显示固相是粒子的情况，但也可代替第2容器52而作为固相含微平板、膜、微管、试管等的别的形状的固相。
【实施例】
接下来，显示实施例，对于本发明更详细地进行说明。但是，本发明不限定于实施例而解释。
【1.材料和方法】
【1-1.细胞培养及钙化诱导、茜素红染色、钙化细胞外囊泡的调制】
来源于人骨肉瘤的细胞株Saos-2细胞从理化学研究所生物资源研究中心(RIKENBRC)购入。细胞根据RIKEN BRC的培养方法而使用添加15％FBS的McCoy's 5A培养基(Sigma-Aldrich)，5％CO2、于37℃培养。
钙化诱导用的Saos-2细胞通过添加10％FBS的αMEM(GIBCO)培养至变得汇合后，更换为钙化诱导用培养基(含10％FBS、10mM HEPES(NACALAI TESQUE)、50μg/mL抗坏血酸2-磷酸盐(Sigma-Aldrich)及1.8mM磷酸二氢钾(富士膜和光纯药)的αMEM)继续培养14天。更换为钙化诱导用培养基后至第10天，培养基2～3天更换1次，第10天～第14天用相同培养基培养而回收培养液。回收后的Saos-2细胞使用4％PFA于4℃固定10分钟，用PBS清洗3次，使用50mM茜素红(pH 4.2)于室温进行茜素红染色10分钟。
将培养液以300g离心10分钟，再以2,000g离心10分钟，向超离心管移上清，以100,000g(50,000rpm)进行28分钟的超离心。采集超离心管内的沉淀，通过在5mM磷酸缓冲液或含1％BSA的5mM磷酸缓冲液中再悬浮，调制钙化细胞外囊泡。
【1-2.购入受试体及钙化细胞外囊泡除去正常人混合血浆受试体的制作】
正常人混合血浆及正常人单供体血浆受试体(抗凝固剂：全部EDTA-2K)各自从Kohjin Bio(Product#12271430)及Cosmo Bio(Product#12271420)购入。其供体信息如图3A所示。在这些健康者血浆中未赋予CAC评分，通常，由于在健康者中CAC评分是0分或极其低的评分，在本实施例中，健康者血浆的CAC评分看作0分而进行以下的评价。心血管疾病(CVD)既往患者受试体(全16受试体、抗凝固剂：EDTA-2K、除外基准是慢性肾功能衰竭和透析患者)从Promedex公司购入。其供体信息如图3B所示。慢性肾脏病(CKD)受试体(全5受试体)及CAC评分附带受试体(全6受试体、除外基准是慢性肾功能衰竭和透析患者)各自从Reprocell公司及BioIVT公司购入(抗凝固剂：全部EDTA-2K)。该供体信息如图3C及图3D所示。如图3D所示，CAC评分附带受试体是CAC评分均超400分，钙化重症度评价为“高度”的受试体。
钙化细胞外囊泡除去正常人混合血浆受试体如以下一样调制。将购入的正常人混合血浆受试体以300g离心10分钟、及以2,000g离心10分钟，向超离心管移该上清。将其以100,000g(50,000rpm)实施28分钟超离心，使细胞外囊泡沉淀。以上清作为受试体回收。
【1-3.碱性磷酸酶活性测定】
在ELISA中使用的各试剂示于图4A及图4B。另外，作为受试体，使用在上述1-1中含在体外诱导的钙化细胞外囊泡的试样、及在上述1-2.中调制的受试体。
将96孔板(Nunc,高结合ELISA平板,#436110)用50mM Tris-HCl(pH 7.5)清洗2次。将图4A中所示的各抗体用50mM Tris-HCl(pH 7.5)调整到5μg/mL的浓度，准备各抗体的抗体溶液。向96孔板的各孔以50μL/各孔添加各抗体溶液。舍孔中的溶液而用5mM磷酸缓冲液清洗3次后，以各200μL/孔添加封闭缓冲液I，一边在600rpm的摇床中搅拌，一边于室温温育2小时30分钟。仅在固相抗体是抗CD63抗体时，将温育时间设为1小时。作为受试体，在固相抗体是抗CD63抗体或抗Pit1抗体时，准备未稀释的血浆受试体，在抗CD9抗体时，准备被等量的cEV试样稀释缓冲液稀释的50％血浆，在抗膜联蛋白VI抗体时，准备被含等量的2.6mMCaCl2的cEV试样稀释缓冲液稀释的50％血浆/1.3mM CaCl2。废弃封闭缓冲液I后，以各100μL/孔添加各受试体，于室温、在600rpm的摇床中温育2小时30分钟。仅在固相抗体是抗CD63抗体时，将温育时间设为1小时。废弃孔中的溶液后，在固相抗体是抗CD63抗体、抗CD9抗体或抗Pit1抗体时，以300μL/孔使用HISCL清洗液，在固相抗体是抗膜联蛋白VI抗体时，以300μL/孔使用含1.3mM CaCl2的HISCL清洗液，将各孔清洗6次。
清洗后，以100μL/孔添加HISCL R5试剂，于室温温育20分钟后，用平板读数仪(TECAN,Infinite Pro200)检测化学发光，进行ALP活性测定。
【2.结果】
【2-1.诱导的钙化细胞外囊泡的评价】
由上述1-1.中记载的方法评价从骨肉瘤细胞株Saos-2细胞诱导转化的骨芽样细胞中的钙化。结果示于图5A～图5E。图5A是诱导2周后的位相差显微镜图像，图5B是茜素红染色图像。图5A及图5B的左图是未进行转化诱导的细胞，图5A及图5B的右图是进行转化诱导的细胞。在进行转化诱导的细胞中，可确认到钙化。图5C显示对于未进行转化诱导的细胞、及进行转化诱导的细胞，从一个15cm板回收细胞，由o-邻甲酚酞络合剂法测定钙量的结果。含进行转化诱导的细胞的板相比含未进行转化诱导的细胞的板，钙量高127倍。图5D显示对于进行转化诱导的细胞的培养上清，由纳米粒子追踪解析法解析的粒子数及粒子尺寸的分布。测定对于1个上清进行3次，各回进行5次连续测定。粒子尺寸的平均值是246.7±3.7nm，粒子浓度的平均值是1.92×1010(粒子)/mL。另外，对于未进行转化诱导的细胞的培养上清和进行转化诱导的细胞的培养上清，在上述1-1.中所示的条件下进行超离心，使用透过电子显微镜观察沉渣。在此观察中，在未进行转化诱导的细胞的培养上清的沉渣中确认不到细胞外囊泡。一方面，在进行转化诱导的细胞的培养上清的沉渣中确认到细胞外囊泡。图5E显示未进行转化诱导的细胞的培养上清的超离心后的沉渣和进行转化诱导的细胞的培养上清的超离心后的沉渣的ALP活性。向用超离心法回收的沉渣试样(1μg/孔)加HISCLR5试剂而测定ALP活性。从各自的沉渣试样采集3个测定样品，进行测定。测定实施2次。在未进行转化诱导的细胞的培养上清的超离心后的沉渣中几乎确认不到ALP活性，进行转化诱导的细胞的培养上清的超离心后的沉渣显示高的ALP活性。
接下来，使用对钙化细胞外囊泡阶段性地进行稀释的稀释系列，探讨细胞外囊泡的粒子数和ALP的活性之间的稀释直线性。粒子数由纳米粒子追踪解析测定。作为捕获抗体(固相抗体)，使用抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗Pit1抗体、及抗膜联蛋白VI抗体，对ALP活性和粒子数进行比较，探讨稀释直线性。结果，如图6所示，使用任何捕获抗体也得到了良好的直线性。
【2-2.使用血液试样的效果的验证】
作为受试体，使用健康者血浆、CAC评分(CAC-S)赋予者血浆、CKD患者血浆、及CVD既往患者血浆，探讨分析性能。
(1)抗CD9抗体-ALP系
作为捕获抗体而使用抗CD9抗体时的结果示于图7A～图7C。图7A显示健康者的血浆(n＝4)和赋予CAC-S的患者的血浆(n＝6)的ALP活性的比较。图7B显示健康者的血浆(n＝4)和CVD患者的血浆(n＝16)的ALP活性的比较。图7C显示健康者的血浆(n＝4)和CKD患者的血浆(n＝5)的ALP活性的比较。*p＜0.05及**p＜0.01表示显著差异。健康者血浆的细胞外囊泡的ALP活性比患者的细胞外囊泡的ALP活性显著地低。
(2)抗CD63抗体-ALP系
作为捕获抗体而使用抗CD63抗体时的结果示于图8。对健康者的血浆(n＝4)和赋予CAC-S的患者的血浆(n＝5)的ALP活性进行比较。*p＜0.05表示显著差异。健康者血浆的细胞外囊泡的ALP活性比患者的细胞外囊泡的ALP活性显著地低。
(3)抗膜联蛋白VI抗体-ALP系
作为捕获抗体而使用抗膜联蛋白VI抗体时的结果示于图9。对健康者的血浆(n＝4)和CKD患者的血浆(n＝5)的ALP活性进行比较。*p＜0.05表示显著差异。健康者血浆的细胞外囊泡的ALP活性比患者的细胞外囊泡的ALP活性显著地低。
(4)抗Pit1抗体-ALP系
作为捕获抗体，使用抗Pit1抗体时的结果示于图10。对健康者的血浆(n＝4)和赋予CAC-S的患者的血浆(n＝6)的ALP活性进行比较。*p＜0.05表示显著差异。健康者血浆的细胞外囊泡的ALP活性比患者的细胞外囊泡的ALP活性显著地低。
(5)测定系间的比较
在图11显示上述(1)～(4)中所示的测定计间的分析性能的比较。在使用抗CD9抗体及抗膜联蛋白VI抗体的测定系中，可在全部健康者血浆中以最低检测灵敏度以上测定。在使用抗CD63抗体和抗CD9抗体的测定系中，与健康者血浆组比较，探讨的3个患者血浆组显示ALP活性高的倾向。在被作为特异性的抗体的抗膜联蛋白VI抗体捕获到钙化细胞外囊泡时，关于CAC-S患者血浆组和CKD血浆组，与健康者血浆组比较而显示ALP活性高的倾向。当考虑最低检测灵敏度(LOD)、动态范围、同时再现性、测定者间再现性的整体时，使用抗CD9抗体的测定系的检测性能最高。
【2-3.CAC评分与ALP活性相关】
求出由抗CD9抗体-ALP系和抗Pit1抗体-ALP系测定的ALP活性和CAC评分的相关。结果示于图12A～图12C。图12A显示由抗CD9抗体-ALP系测定的ALP活性和CAC评分的相关，相关系数是0.84。图12B显示由抗CD63抗体-ALP系测定的ALP活性和CAC评分的相关，相关系数是0.87。图12C显示由抗Pit1抗体-ALP系测定的ALP活性和CAC评分的相关，相关系数是0.85。均显示高的相关。
【3.对于心血管疾病发病风险及血管钙化的评价】
如上所述，知晓CAC评分作为表示血管钙化的重症度的指标使用，可在心血管疾病的风险预测中利用。在本实施例中测定的ALP活性与CAC评分良好相关，在伴随血管钙化的CKD患者或CVD患者中是显著地高值。结果提示，血中钙化细胞外囊泡的ALP活性能作为表示血管钙化的重症度的指标利用，还能作为用于心血管疾病的发病风险判定的指标利用。
【符号的说明】
50：检查试剂盒

Claims (13)

1.判定所述受试者中的心血管疾病的发病风险的方法，其包括：
在固相上捕获来源于从受试者采集的血液试样的细胞外囊泡的工序，及
对所述细胞外囊泡的碱性磷酸酶活性进行测定的工序，
其中所述碱性磷酸酶活性的测定结果成为所述受试者中的心血管疾病的发病风险的指标。
2.权利要求1所述的方法，其中所述血液试样是全血、血浆或血清。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述捕获工序包括：通过使所述受试者的血液试样、所述固相和能捕获所述细胞外囊泡的捕获抗体接触，在所述固相上形成所述细胞外囊泡和所述捕获抗体的复合体。
4.权利要求3所述的方法，其中所述捕获抗体是选自下列的至少1种：抗CD9抗体、抗CD81抗体、抗CD63抗体、抗膜联蛋白VI抗体及抗Pit1抗体。
5.权利要求1～4之任一项所述的方法，其中所述测定工序包括：使固定于所述固相的所述细胞外囊泡的碱性磷酸酶接触发光底物，检测由此发生的化学发光信号。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中在所述碱性磷酸酶活性的测定结果在指定的阈值以上之时，提示所述受试者中的心血管疾病的发病风险高。
7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其中在所述碱性磷酸酶活性的测定结果不足指定的阈值之时，提示所述受试者中的心血管疾病的发病风险低。
8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中所述心血管疾病是选自下列的至少1种：缺血性心脏疾病、缺血性脑疾病及缺血性肠道障碍。
9.判定所述受试者中的血管钙化的方法，其包括：
在固相上捕获来源于从受试者采集的血液试样的细胞外囊泡的工序，及
对所述细胞外囊泡的碱性磷酸酶活性进行测定的工序，
其中所述碱性磷酸酶活性的测定结果成为所述受试者中的血管钙化的指标。
10.权利要求9所述的方法，其中在所述碱性磷酸酶活性的测定结果在指定的阈值以上之时，提示所述受试者中存在血管钙化。
11.权利要求9或10所述的方法，其中在所述碱性磷酸酶活性的测定结果不足指定的阈值之时，提示所述受试者中不存在血管钙化。
12.用于权利要求1～11之任一项所述的方法的检查试剂盒，其含：
在固相上捕获细胞外囊泡的捕获抗体，及
用于捕获所述捕获抗体的固相。
13.权利要求12所述的检查试剂盒，其还含对于碱性磷酸酶的底物。
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