CN112816693B - 一种用于结直肠癌早期筛查的试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及肿瘤学领域，更具体涉及一种用于结直肠癌早期筛查的试纸条。该试纸条上包含了能特异性检测NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体、ZCCHC24自身抗体的检测试剂，上述特异性检测试剂为其相应的抗原蛋白；通过将NSDHL抗原蛋白、NALCN抗原蛋白和ZCCHC24抗原蛋白这三种抗原蛋白联合用于早期结直肠癌的筛查，对早期结直肠癌的检测灵敏度达93.33％，特异度达88.67％；此外，本发明试纸条的检测对象为血清样本，相对于现有的粪便潜血、肠镜等检查手段，具有采样方便、需血量少，待检人群接受度高的优势，具有重要的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及肿瘤学领域，更具体涉及一种用于结直肠癌早期筛查的试纸条。
背景技术
结直肠癌是最常见的癌症之一，结直肠癌在我国恶性肿瘤的发病率中排第二、死亡率排第五，且结直肠癌的发病率在我国呈现出逐渐上升和逐渐年轻化的趋势。结直肠癌的发病从息肉到晚期结直肠癌总共有10年的发展周期，而最佳的干预时段为进展期腺瘤和早期结直肠癌(I-II期)。而当前我国结直肠癌的初治分期比例为：I期占15％；II期占20％-30％；III期占30％-40％；IV期占20％-25％。在生存期方面，进展期腺瘤患者的5年生存率可接近100％，II期患者的5年生存率可达90％以上，而IV期患者只有略大于10％的生存率。因此可以看出，没有实现结直肠癌的早诊早治，是导致我国结直肠癌发病率和死亡率高的重要原因。
现有对结直肠癌早期筛查方式如粪便潜血和肠镜等，由于粪便潜血受饮食和药物等的干扰，特异性低，在使用上存在一定的缺陷，总体筛查率低于5％；肠镜作为结直肠癌筛查的金标，也存在诸多缺陷，该方法对操作者要求高，同时作为一种入侵式的检查方式，患者的痛苦较大且接受度低，目前的筛查率不足3％。基于以上现状，开发一种非侵入式且灵敏度、特异度高的结直肠癌早期筛查手段是十分必要的。
外周血中肿瘤标志物的检测，具有快速、创伤小、易于接受等优势，适于大规模人群筛查，并且便于长期动态监测，为结直肠癌的早期发现提供了一种简单方便的无创诊断方法。尽管目前临床上常用一些肿瘤标志物，如CEA、CA19-9属于广谱性肿瘤标志物，对结直肠癌的筛查灵敏度和特异性都不高，尤其是对早期结直肠癌的诊断价值不高。
在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤患者血液中存在多种与肿瘤发生有关的抗原及自身抗体，近十余年来，肿瘤相关抗原自身抗体在多种肿瘤类型中作为早期生物标志物得到广泛研究，如肺癌、乳腺癌、食管鳞癌、贲门癌等。自身抗体具有如下优势：1.肿瘤相关抗原自身抗体能够在血清中持续稳定的存在，且在正常个体血液中的浓度极低；2.肿瘤相关抗原自身抗体可以在肿瘤患者出现主要临床症状之前的数月甚至数年即被检测到；3.用于检测自身抗体的方法成熟，相关试剂已商品化。这些优势使得肿瘤相关抗原自身抗体可能成为非常有潜力的肿瘤诊断标志物。
数年来，发明人所在研究团队致力于结直肠癌发生发展的机制研究，对结直肠癌的自身抗体谱也进行了大量的研究。以结直肠癌患者血清为研究对象，利用本研究团队建立的结直肠癌基因组学数据库联合自身抗体芯片技术，筛选出三种肿瘤相关抗原NSDHL、NALCN和ZCCHC24，其对应的肿瘤自身抗体在结直肠癌患者血清中表达水平与健康人体血清具有显著差异，且在进展期腺瘤和早期结直肠癌的血液样品中均能检测到，因此，三种肿瘤相关抗原有望应用于对结直肠癌的早期筛查诊断；以往大部分相关研究中所应用到的肿瘤相关抗原均是通过其它类型肿瘤而非结直肠癌肿瘤中鉴定出来，其在结直肠癌检测中的敏感性和特异性尚需进行充分的评价。因此，本研究团队筛选出使用结直肠癌患者血清筛选出来的肿瘤相关抗原及肿瘤相关抗原自身抗体，对结直肠癌的早期诊断更具有可靠性。
发明内容
本发明的目的在于提供一组能够特异性检测NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体和ZCCHC24自身抗体的检测试剂在早期结直肠癌筛查试纸条中的应用，基于该组自身抗体的特异性检测试剂构建用于结直肠癌早期筛查的试纸条作为为本发明的另一个目的。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了能够特异性检测NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体和ZCCHC24自身抗体的检测试剂在早期结直肠癌筛查试纸条中的应用。
进一步地，上述检测试剂包括检测NSDHL自身抗体是否表达的分子、检测NALCN自身抗体是否表达的分子和检测ZCCHC24自身抗体是否表达的分子。
进一步地，上述检测NSDHL自身抗体是否表达的分子为能够与NSDHL自身抗体特异性结合的NSDHL抗原蛋白；检测NALCN自身抗体是否表达的分子为能够与NALCN自身抗体特异性结合的NALCN抗原蛋白；检测ZCCHC24自身抗体是否表达的分子为能够与ZCCHC24自身抗体特异性结合的ZCCHC24抗原蛋白。
进一步地，上述早期结直肠癌筛查试纸条的检测对象为血清样品。
第二方面，本发明提供了一种用于早期结直肠癌筛查的试纸条，该试纸条含有能够特异性检测NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体和ZCCHC24自身抗体的检测试剂。
进一步地，上述检测试包括检测NSDHL自身抗体是否表达的分子、检测NALCN自身抗体是否表达的分子和检测ZCCHC24自身抗体是否表达的分子。
进一步地，上述检测NSDHL自身抗体是否表达的分子为能够与NSDHL自身抗体特异性结合的NSDHL抗原蛋白；检测NALCN自身抗体是否表达的分子为能够与NALCN自身抗体特异性结合的NALCN抗原蛋白；检测ZCCHC24自身抗体是否表达的分子为能够与ZCCHC24自身抗体特异性结合的ZCCHC24抗原蛋白。
进一步地，试纸条包括底板，以及在底板上依次铺设的样品垫、结合垫、层析垫和吸收垫；结合垫上包被有鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体，鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体上均带有可检测的标记物；层析垫上设有三条检测线和一条质控线，检测线上包被有检测抗原，三条检测线包被的检测抗原分别为NSDHL抗原蛋白、NALCN抗原蛋白、ZCCHC24抗原蛋白；质控线上包被有羊抗兔IgG。
进一步地，层析垫上的三条检测线和一条质控线按照如下顺序排列而成：层析垫从靠近结合垫的一端至靠近吸收垫的一端，依次为第一检测线、第二检测线、第三检测线和质控线；所述第一检测线上包被有NSDHL抗原蛋白，第二条检测线上包被有NALCN抗原蛋白，第三条检测线上包被有ZCCHC24抗原蛋白；所述质控线上包被有羊抗兔IgG。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明首次通过检测人血清中的NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体、ZCCHC24自身抗体的表达水平，从而对早期结直肠癌进行检测，对上述三种自身抗体的检测试剂分别为其相应的抗原蛋白。相对于NSDHL抗原蛋白、NALCN抗原蛋白和ZCCHC24抗原蛋白这三种蛋白的任意一种、任意两种的组合，本发明采用将上述三种抗原蛋白作为一个组合联合用于早期结直肠癌的检测，对早期结直肠癌的检测灵敏度高达93.33％，检测特异度高达88.67％；由此可见，由本发明筛选出的三种肿瘤相关抗原联合用于早期结直肠癌的检测，具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期结直肠癌的检出率，适于对结直肠癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状结直肠癌高危人群早期发现，从而大大降低结直肠癌患者的死亡率。
(2)本发明试纸条的检测对象为血清样本，相对于现有的粪便潜血、肠镜等检查手段，具有采样方便、需血量少，待检人群接受度高的优势，且本发明提供的试纸条对早期结直肠癌的筛查具有较高的灵敏度和特异度。
附图说明
图1为本发明试纸条的结构示意图；
图2为不同组合的肿瘤相关抗原组合对早期结直肠癌检测的ROC曲线。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
下列实施例所述的试验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购得的常规产品。
实施例1试纸条的制备
本发明用于早期结直肠癌筛查的试纸条的制备过程如下：
1.用于早期结直肠癌筛查的试纸条的结构
用于早期结直肠癌筛查的试纸条的结构如图1所示，包括底板，以及在底板上依次铺设的样品垫、结合垫、层析垫和吸收垫，样品垫的末端搭接于结合垫的始端上表面，结合垫的末端搭接于层析垫的始端上表面，层析垫的末端交叠于吸收垫的下方；层析垫上设有三条检测线(T1、T2、T3)和一条质控线(C)；其中，底板的长度为65mm，宽度为10mm，其中，样品垫的长度为7mm，结合垫的长度为8mm，层析垫的长度为42mm，吸收垫的长度为11mm；层析垫上第一条检测线T1距层析垫始端的距离为11mm，检测线T2、检测线T3、质控线C与检测线T1之间的间距为依次为7mm、14mm、21mm。
结合垫上含有胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体；层析垫上的检测线T1位置处包被有NSDHL抗原蛋白，检测线T2位置处包被有NALCN抗原蛋白，检测线T3位置处包被有ZCCHC24抗原蛋白，质控线C位置处包被有羊抗兔IgG。
2.实验材料的来源及制备
本发明中所用的生物活性原料均为市售产品。其中，鼠抗人IgG单克隆抗体、兔IgG单克隆抗体、羊抗兔IgG单克隆抗体、均购自abcam公司；NSDHL抗原蛋白、NALCN抗原蛋白、ZCCHC24抗原蛋白均购自Invitrogen公司。
试纸条中底板的材质为硬质纤维板，样品垫的材质为吸水性玻璃纤维，结合垫的材质为玻璃纤维膜，层析垫的材质为硝酸纤维素膜，吸收垫的材质为吸水性玻璃纤维膜，试纸条中的底板、样品垫、结合垫、层析垫、结合垫所用材料均为市售常规产品。
2.1结合垫的制备
(1)胶体金合成
采用柠檬酸三钠还原法制备直径为25～35nm的胶体金溶液。在洗净的烧瓶中加入300mL0.01％的氯金酸溶液，加热至沸。磁力搅拌下快速加入4.8mL 0.1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，直至颜色逐渐稳定为透亮的酒红色。将烧瓶置于室温冷却，用蒸馏水恢复至原体积，4℃保藏。
(2)胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的制备
用0.1M碳酸钾溶液将1mL胶体金溶液pH调至8.0，向胶体金溶液中加入鼠抗人IgG单克隆抗体和兔IgG单克隆抗体，混合均匀，室温放置15min，加入稳定剂(10％的BSA溶液)，混匀后室温静置10min，12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用缓冲液重悬，得到胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的混合溶液(该混合溶液中胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的浓度均为35μg/mL)；其中，所述缓冲液为含有1％BSA、5％蔗糖的0.01mol/L PH8.0的PBS溶液。
(3)结合垫的制备
选用玻璃纤维膜作为结合垫材料，将玻璃纤维膜在胶体金颗粒标记的鼠抗人IgG单克隆抗体和胶体金颗粒标记的兔IgG单克隆抗体的混合溶液中浸泡5-15min，取出后冷冻干燥，得到结合垫。
2.2层析垫的制备
选用硝酸纤维素膜作为层析垫材料，在硝酸纤维素膜上标记好三条检测线T1、T2、T3和一条质控线C的位置，彼此之间间隔7mm。将NSDHL抗原蛋白、NALCN抗原蛋白、ZCCHC24抗原蛋白均稀释至1mg/mL，羊抗兔IgG稀释至2mg/mL，用划膜仪在硝酸纤维素膜上三条检测线T1、T2、T3和三条质控线C的位置上按0.1-0.5μL/mm用量进行划线，37℃烘干过夜；然后将硝酸纤维素膜浸入1％BSA的0.01mol/L，PH8.0的PBS溶液中，然后取出硝酸纤维素膜用PBS清洗，干燥后得到层析垫。层析垫上的检测线T1位置处包被有NSDHL抗原蛋白，检测线T2位置处包被有NALCN抗原蛋白，检测线T3位置处包被有ZCCHC24抗原蛋白，质控线C位置处包被有羊抗兔IgG。
2.3样品垫的制备
样品垫的材质为玻璃纤维膜，将玻璃纤维膜放入样品垫封闭液中浸泡30min，37℃烘干，即得样品垫；其中样品垫封闭液为含1％BSA、1.0％～2.0％蔗糖、0.1～0.5％Tween-20、0.1％～1.0％PVP聚乙烯基吡咯烷酮的0.01mol/L PBS溶液(pH＝7.4)。
3.试纸条的检测原理
将试纸条插入待测血清样品中，样品流向吸收垫的方向；当流到结合垫上时，结合垫上胶体金标记的鼠抗人IgG(金标鼠抗人IgG)和胶体金标记的兔IgG(金标兔IgG)溶解，其中，胶体金标记的鼠抗人IgG与血清样品中可能含有的NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体、ZCCHC24自身抗体结合分别形成NSDHL自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物、NALCN自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物、ZCCHC24自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物；由于毛细管效应，胶体金标记的兔IgG与这三种免疫复合物向吸样垫泳动，免疫复合物与包被在层析垫检测线T1上的NSDHL抗原蛋白、检测线T2上的NALCN抗原蛋白、检测线T3上的ZCCHC24抗原蛋白发生特异性免疫结合反应，分别形成NSDHL抗原-NSDHL自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物、NALCN抗原-NALCN自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物、ZCCHC24抗原-ZCCHC24自身抗体-金标鼠抗人IgG免疫复合物，上述三种免疫复合物被依次截留于检测线T、检测线T2、检测线T3上，逐渐富集形成紫红色条带；金标兔IgG由于毛细效应继续向前泳动，与包被在质控线上的羊抗兔IgG发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带，多余的未结合的物质继续层析到吸样垫上，因此在检测线和质控线都出现条带的判为阳性结果。若血清样品中不含NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体、ZCCHC24自身抗体，胶体金标记的鼠抗人IgG和兔IgG到达检测线时，不与包被在检测线上的NSDHL抗原、NALCN抗原和ZCCHC24抗原发生免疫反应，因此在检测线处没有出现显色带，而金标兔IgG继续向前泳动与包被于质控线处羊抗兔IgG发生特异的免疫反应而被截留，逐渐富集在质控线上形成紫红色条带，因此仅在质控上出现条带判为阴性结果。如质控线未显色则表明该试剂无效。
4.试纸条的使用方法
将样品垫插入待测血清样品中至少10s，试纸条取出后平放静置5～15min，观察检测线和质控线颜色的变化。
5.试纸条的检测结果判定
阳性结果：在T1、T2、T3三条检测线中任意一条检测线出现紫红色条带，质控线上出现紫红色条带，则结果判定为阳性。
阴性结果：在T1、T2、T3三条检测线中均未出现紫红色条带，仅质控线上出现紫红色条带，则结果判定为阴性。
无效结果：在质控线上未出现紫红色条带，则检测结果判定为无效，应重新检测。
实施例2试纸条对早期结直肠癌的诊断价值分析
利用本发明实施例1制得的试纸条对经病理确诊的早期结肠癌患者和正常人的血清样品进行检测，评估分析本发明试纸条对早期结肠癌筛查和诊断的价值。
1.血清样本采集
收集来自河南省人民医院的150例早期结直肠癌患者血清样品作为癌症组，以及150例正常健康人血清作为对照组。其中150例早期结直肠癌患者血清均来自病理确诊且未接受任何放化疗的初诊病人，男性78例，女性72例，平均年龄48±5.2岁，35～75岁；150例正常健康人血清来自来自门诊健康体检人群，并经肠镜病理活检排出早期结肠癌，其中，男性80例，女性70例，平均年龄45±6.7岁，年龄范围为35～65岁。
2.检测结果
利用实施例构建的试纸条以及实施例1中给出的使用方法，对上述癌症组150例血清标本和对照组150例血清标本进行早期结肠癌检测，检测结果如表1、表2和图2所示，其中，表1为三种自身抗体在癌症组和对照组中的差异分析。
表1三种自身抗体在癌症组和对照组中的差异分析
表1中的OR值即Oddsratio，表示患有早期结直肠癌的可能性与非结直肠癌的可能性之比，以NSDHL+组和NSDHL-组为例，说明OR的具体计算公式为：OR＝NSDHL+组中患早期结直肠癌比值/NSDHL-组中患早期结直肠癌比值，即OR＝(37/10)/(113/140)＝4.58，表明，NSDHL阳性者患早期结直肠癌的风险程度为NSDHL阴性者的4.58倍。
当OR值小于等于1时，表示该基因对早期结直肠癌的发生没有指示作用；OR值大于1时，表示该基因是产生早期结直肠癌的危险因素，对早期结直肠癌的发生具有重要指示作用。由表1的结果可知，NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体和ZCCHC24自身抗体的OR值分别为4.58、4.25、5.81，由此，表明这三种自身抗体对应的肿瘤相关抗原标志物能够用于早期结直肠癌的风险评估。
为进一步探究由上述三种抗原蛋白标志物形成的不同组合对早期结直肠癌的检测效果进行分析，结果如表2和图2所示。
表2不同组合的抗原蛋白对早期结直肠癌的检测结果
由表2可知，随着标志物数量的增加，对早期结直肠癌的检测灵敏度由24.67％增加至93.33％，当三种肿瘤相关抗原NSDHL、NALCN、ZCCHC24联合用于对血清中相应自身抗体进行检测时，对早期结直肠癌的检测灵敏度为93.33％，高于其他标志物组合，表明，对于早期结直肠癌患者应用本发明试纸条进行检测时，能够被正确地诊断为早期结肠癌的百分比为93.33％。虽然，随着标志物数量的增加，检测特异度呈下降趋势，但当三种肿瘤相关抗原NSDHL、NALCN、ZCCHC24联合用于对血清中相应自身抗体进行检测时，其对早期结直肠癌的检测特异度仍能达到88.67％，表明，对于非早期结直肠癌患者应用本发明试纸条进行检测时，能够被正确地诊断为非早期结直肠癌的百分比为88.67％；由上述分析可知，使用NSDHL抗原蛋白、NALCN抗原蛋白、ZCCHC24抗原蛋白这三种抗原蛋白联合用于早期结直肠癌筛查时，能够在保证检测特异度的前提下，大幅度提高检测灵敏度。
此外，随着检测试纸条中抗原蛋白数量的增加，约登指数呈增加趋势，且当NSDHL抗原蛋白、NALCN抗原蛋白、ZCCHC24抗原蛋白这三种抗原蛋白联合用于早期结直肠癌筛查时，约登指数最大，表明，当上述三种抗原蛋白联合使用时对早期结直肠癌具有较高的诊断价值。
此外，依据上述检测结果进行ROC曲线绘制，如图2所示，可以看出，随着抗原蛋白组合数目的增加，ROC曲线下面积不断升高，当NSDHL抗原蛋白、NALCN抗原蛋白、ZCCHC24抗原蛋白这三种抗原蛋白联合用于早期结直肠癌筛查时，ROC曲线下面积达到最大值，表明当上述三种抗原蛋白联合使用时，对早期结直肠癌具有较高的灵敏度和特异度。
综上所述，本发明通过对待测人群血清中的NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体和ZCCHC24自身抗体进行联合检测，用于对早期结直肠癌的筛查，具有较高的灵敏度和特异度，适用于大规模高危人群的筛查，具有重要的推广应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不限于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.能够特异性检测NSDHL自身抗体、NALCN自身抗体、ZCCHC24自身抗体的检测试剂在制备早期结直肠癌筛查试纸条中的应用；
所述检测试剂包括检测NSDHL自身抗体是否表达的分子、检测NALCN自身抗体是否表达的分子和检测ZCCHC24自身抗体是否表达的分子；
所述检测NSDHL自身抗体是否表达的分子为能够与NSDHL自身抗体特异性结合的NSDHL抗原蛋白；所述检测NALCN自身抗体是否表达的分子为能够与NALCN自身抗体特异性结合的NALCN抗原蛋白；所述检测ZCCHC24自身抗体是否表达的分子为能够与ZCCHC24自身抗体特异性结合的ZCCHC24抗原蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述早期结直肠癌筛查试纸条的检测对象为血清样品。
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