CN105617382A - miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用 - Google Patents

miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105617382A
CN105617382A CN201511029276.3A CN201511029276A CN105617382A CN 105617382 A CN105617382 A CN 105617382A CN 201511029276 A CN201511029276 A CN 201511029276A CN 105617382 A CN105617382 A CN 105617382A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mirna
glt
mir
expression
glutamate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201511029276.3A
Other languages
English (en)
Inventor
瞿少刚
张云龙
何小亮
张秀萍
吴晓娟
童辉纯
陆伶俐
秦笙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN201511029276.3A priority Critical patent/CN105617382A/zh
Publication of CN105617382A publication Critical patent/CN105617382A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

本发明公开了miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用。在本发明中，筛选并验证了miRNA-543-3p对谷氨酸转运体的表达与功能具有调节作用；并进一步验证了miRNA-543-5p直接作用于谷氨酸转运体。发现miRNA-543-5p？inhibitors可以抑制miRNA-543-5p的功能，从而减弱miRNA-543-5p对谷氨酸转运体mRNA翻译的抑制效应，谷氨酸转运体蛋白的表达水平有所提高，从而降低谷氨酸的神经毒性效应，缓解帕金森病病情，为临床治疗帕金森病提供新靶标、新途径。

Description

miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用
技术领域
本发明涉及miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用。
背景技术
帕金森病(PD)是一种常见的神经变性疾病，患者会出现静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常，许多患者还伴有嗅觉丧失、抑郁以及痴呆等症状，病情呈进行性加重，晚期往往全身僵硬，生活不能自理，是中老年人常见的致残疾病之一，严重影响患者的生活质量，给社会和家庭带来沉重的负担。帕金森病的主要病理变化表现为中脑黑质多巴胺能神经元进行性变性和死亡；残存神经元内出现嗜酸性蛋白包涵体(Lewybody，LB)，纹状体内多巴胺显著减少。尽管PD的病因仍不甚明确，人们通过对各种动物与细胞模型的研究发现，谷氨酸兴奋性毒性、神经炎性反应、神经再生抑制、氧化应激、线粒体功能障碍、凋亡等参与了黑质多巴胺能神经元死亡的病理过程。在众多PD病因学说中，兴奋性氨基酸毒性学说是国内外研究的热点，而谷氨酸转运体是这一学说的关键环节。兴奋性氨基酸(尤其是谷氨酸)与PD发生、发展的相关性研究，已经成为国际学术界的一个前沿课题。研究表明，谷氨酸通过其受体介导的兴奋性毒性在PD的发生和发展过程中发挥了重要作用[1]。
谷氨酸(glutamate,Glu)是中枢神经系统兴奋性突触传递的主要神经递质。神经末梢释放的谷氨酸主要由神经元细胞和神经胶质细胞上的谷氨酸转运体(glutamatetransporter)回收入细胞膜内，以终止谷氨酸能神经传递，并使胞外谷氨酸浓度保持在较低水平，以免神经元遭受高浓度谷氨酸的兴奋性毒性效应。谷氨酸的分布具有区域依赖性，大部分位于细胞内，极少部分位于胞外，跨膜浓度梯度大约是几千倍。由于胞外没有谷氨酸代谢酶，快速移走胞外谷氨酸的唯一方法是谷氨酸转运体摄取。在生理条件下，位于神经元和神经胶质细胞上的谷氨酸转运体迅速摄取谷氨酸，有效地抑制了细胞外谷氨酸的堆积。病理情况下，谷氨酸转运体对谷氨酸的摄取能力降低，甚至出现向细胞外的逆转运，导致细胞外谷氨酸浓度上升，兴奋谷氨酸受体，导致黑质多巴胺能神经元变性或坏死。真核生物高亲和力谷氨酸转运体(excitatoryaminoacidtransporter,EAAT)分为GLAST(EAAT1)GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4和EAAT5等5个亚型。五个亚型之间氨基酸序列的同源性约为50％。GLT-1和GLAST主要表达于脑内的胶质细胞，GLT-1主要表达于前脑、海马、大脑皮层和纹状体等部位，GLAST在小脑的Bergmann胶质细胞表达较高，在脊髓和前脑也有少量表达。GLT1和GLAST不仅可单独表达在不同神经胶质细胞，亦可同时表达于同一细胞的不同部位。清除聚积的谷氨酸，防止兴奋毒性主要由GLT-1和GLAST完成。星形胶质细胞通过其谷氨酸转运体可以清除细胞间隙80％以上的谷氨酸，从而保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性损伤。EAAC1主要表达于突触后神经元，特别是树突干和树突棘部位。EAAT4局限在小脑浦肯野细胞。EAAT5则局限于视网膜，表达于光感受器、双极细胞、无长突细胞和胶质细胞。
EAATs功能的异常和谷氨酸摄取的下降与帕金森病的发病密切相关，Ferrarese等[2]研究了34名PD患者和21名正常人的血小板谷氨酸摄取功能，发现与对照组相比，原发性PD患者谷氨酸摄取量减少了50％，且摄取减少量与PD的严重程度有关。在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)及其离子MPP+制造的PD鼠模型中，发现GLT-1、EAAC1表达的减少和谷氨酸摄取的下降[3-5]。这些研究提示，在PD的发病过程中，随着EAATs表达的下降，其摄取谷氨酸的能力降低，导致了细胞外谷氨酸水平的升高，胞外的谷氨酸持续作用于代谢性谷氨酸受体，激活多巴胺能神经元胞内第二信使三磷酸肌醇(inositoltriphosphate,IP3)与环腺苷二磷酸核糖，通过各自信号调控途径诱导胞内Ca2+浓度升高，引起对Ca2+敏感的K+通道开放，多巴胺能神经元胞膜超极化导致细胞死亡，同时导致能量消耗增多、自由基形成，最终引发兴奋性神经毒性效应[6]。
谷氨酸转运体在蛋白质水平的变化固然对其功能的正常发挥具有重要作用。然而，信使RNA(mRNA)翻译生成谷氨酸转运体蛋白质阶段的调控对谷氨酸转运体的表达以及功能的发挥也至关重要，microRNA(miRNA)是其中一个非常重要的调控因素。MicroRNA是一类内源性的大小在20-25nt的非编码RNAs，主要通过与靶基因的3’端非翻译区(3’untranslatedregions,3’UTR)完全互补或不完全匹配结合，降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译，发挥调控作用。MicroRNA表达具有高度保守性、时序性和组织特异性。目前已经发现人类的microRNA超过1400个，它们在生物体内既是代谢产物，也是机体的重要调控分子。一种microRNA可以定位于多个mRNA,并参与生物体的生长、发育、衰老、死亡的调控等生物学过程，人类有接近1/3的基因受到microRNA的调控。目前，发现很多microRNA与神经退行性疾病相关，其中陆续发现了一些参与帕金森病发病过程的microRNA。体内或体外细胞培养敲除miR-133b，可使酪氨酸羟化酶和多巴胺转运蛋白水平明显下降，该研究首次发现单个特异的microRNA对多巴胺生成的调节作用[7]。Wang等在研究成纤维细胞生长因子20(fibroblastgrowthfactor20,FGF20)与PD的关系中发现，FGF20可以被microRNA-433调节，在PD患者中microRNA-433表达降低，FGF20表达升高，而FGF20可以促进PD致病中最关键的蛋白α-Synuclein表达升高[8]。最近有报道以α-突触核蛋白(a-Synuclein)mRNA作为靶基因的miR-7与miR-153，二者都可以抑制α-突触核蛋白的表达，miR-7参与调节氧化应激介导的细胞死亡[9,10]。let-7与miR184以转录因子E2F1及DP作为靶基因，参与调节多巴胺能神经元的生存与活性[11]。从组织库中将帕金森病病人与对照组脑组织内microRNAs表达谱进行对比，可以为microRNAs在帕金森病发展过程中的作用提供一些线索。对帕金森病病人脑组织内microRNAs表达谱研究发现miR-34b及miR-34c在受损脑组织表达量显著降低，杏仁核、黑质、额皮质的表达量比对照组降低40-65％，小脑含量同样降低，但幅度较小；用维甲酸和12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)刺激成神经瘤细胞SH-SY5Y后，miR-34b及miR-34c表达量增加二倍；相反如果敲除miR-34b/miR-34c，细胞则因线粒体功能受损及氧化应激效应导致死亡；鉴定miR-34b及miR-34c的靶基因有助于发现其调节神经元存活的机制[12]。研究发现microRNA-124a在终末期肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)小鼠模型的脊髓组织中下调，通过外源性注射microRNA-124a能够抑制ALS中GLT-1的下调[13]。该项研究提示microRNA-124a将有可能成为治疗诸如ALS等神经变性疾病的一个新的靶标。新近的研究也表明，间充质干细胞能够释放外源性的microRNA-124，进而促进神经前体细胞和星形胶质细胞上GLT-1的表达[14]。最近有研究表明，在缺血性中风模型的脑组织和血液中存在高水平的miR-107，高表达的miR-107可以通过抑制GLT-1的表达，进而加速谷氨酸的兴奋性毒性对机体的损害。并且在缺血性中风患者的血液中也发现了高水平的miR-107和谷氨酸，提示miR-107有可能会成为检测缺血性中风患者体内兴奋性谷氨酸毒性损伤程度的一个生物指标[15]。由此可见，microRNAs对于谷氨酸转运体表达的调控在神经变性疾病中发挥重要的作用。但是对于帕金森病中那些针对谷氨酸转运体发挥调控作用的microRNAs目前尚未见报道，值得我们进一步进行探索。
上述涉及到的参考文献的具体信息为：
[1]AdrianGD,CharlesKM,MitchellB,GethinJM,CindyM,SusanT,AnnKS,GloriaEM.AstroglialplasticityandglutamatefunctioninachronicmousemodelofParkinson'sdisease.ExperimentalNeurology2004；190(1):145-156.
[2]FerrareseC,TremolizzoL,RigoldiM,SalaG,BegniB,BrighinaL,RicciG,AlbizzatiMG,PioltiR,CrostiF,DalpràL,FrattolaL.DecreasedplateletglutamateuptakeandgeneticriskfactorsinpatientswithParkinson’sdisease.NeurolSci2001；22(1):65-66.
[3]ChungEK,ChenLW,ChanYS,YungKK.Downregulationofglialglutamatetransportersafterdopaminedenervationinthestriatumof6-hydroxydopamine-lesionedrats.J.Comp.Neurol2008；511(4):421–437.
[4]KojiAoyama,NobukoMatsumura,MasahikoWatabeandToshioNakaki.OxidativestressonEAAC1isinvolvedinMPTP-inducedglutathionedepletionandmotordysfunction.EuropeanJournalofNeuroscience2008；27(1):20–30.
[5]WuJY,NiuFN,HuangR,XuY.Enhancementofglutamateuptakein1-methyl-4-phenylpyridinium-treatedastrocytesbytrichostatinA.Neuroreport2008,19(12):1209-1212.
[6]MehtaA,PrabhakarM,KumarP,DeshmukhR,SharmaPL.Excitotoxicity:Bridgetovarioustriggersinneurodegenerativedisorders.EurJPharmacol2013；698(1-3):6-18.
[7]WangG,vanderWaltJM,MayhewG,LiYJ,ZuchnerS,ScottWK,MartinER,VanceJM.VariationintheMicroRNA-433bindingsiteofFGF20confersriskforParkinsondiseasebyoverexpressionofalpha-synuclein.AmJHumGenet2008；82(2):283–289.
[8]DoxakisE.Post-transcriptionalregulationofα-synucleinexpressionbymir-7andmir-153.JBiolChem2010；285(17):12726–12734.
[9]JunnE,LeeKW,JeongBS,ChanTW,ImJY,MouradianMM.Repressionofα-synucleinexpressionandtoxicitybyMicroRNA-7.ProcNatlAcadSciUSA2009；106(31):13052–13057.
[10]GehrkeS,ImaiY,SokolN,LuB.PathogenicLRRK2negativelyregulatesMicroRNA-mediatedtranslationalrepression.Nature2010；466(7306):637–641.
[11]HebertSS,DeStrooperB.Molecularbiology.MicroRNAsinneurodegeneration.Science2007；317(5842):1179–1180.
[12]Minones-MoyanoE,PortaS,EscaramisG,RabionetR,IraolaS,KagerbauerB,Espinosa-ParrillaY,FerrerI,EstivillX,MartiE.MicroRNAprofilingofParkinson'sdiseasebrainsidentifiesearlydownregulationofmiR-34b/cwhichmodulatemitochondrialfunction.HumMolGenet2011；20(15):3067–3078.
[13]MorelL,ReganM,HigashimoriH,NgSK,EsauC,VidenskyS,RothsteinJ,YangY.NeuronalExosomalmiRNA-dependentTranslationalRegulationofAstroglialGlutamateTransporterGLT-1.JBiolChem2013；288(10):7105-7116.
[14]LeeHK,FinnissS,CazacuS,XiangC,BrodieC.MesenchymalstemcellsdeliverexogenousmiRNAstoneuralcellsandinducetheirdifferentiationandglutamatetransporterexpression.StemCellsDev2014(doi:10.1089/scd.2014.0146).
[15]YangZB,ZhangZ,LiTB,LouZ,LiSY,YangH,YangJ,LuoXJ,PengJ.Upregulationofbrain-enrichedmiR-107promotesexcitatoryneurotoxicitythroughdownregulationofglutamatetransporter1expressionfollowingischemicstroke.ClinSci(Lond)2014(doi:10.1042/CS20140084)。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本发明利用神经毒素MPTP制备帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)小鼠模型，然后在制模后检测大脑黑质microRNAs的表达谱，并且与正常对照组比较，筛选出差异表达的microRNAs，同时结合生物信息学预测以谷氨酸转运体GLT-1为靶基因的microRNAs，从中筛选出目标microRNA。进一步制备该microRNAinhibitors，研究其功能，为临床治疗帕金森病提供新靶标、新途径。
本发明的目的在于提供miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
miRNA-543-3p的抑制物在制备诊断帕金森病的试剂中的应用。
进一步的，所述的miRNA-543-3p抑制物为miRNA-543-3pinhibitors或miRNA-543-3pantagomir。
进一步的，所述miRNA-543-3p为鼠的miRNA-543-3p，其核酸序列如SEQIDNO：1所示。
进一步的，所述miRNA-543-3pinhibitors的核酸序列如SEQIDNO：3所示。
miRNA-543-3p的抑制物在制备治疗帕金森病药剂中的应用。
进一步的，所述的miRNA-543-3p抑制物为miRNA-543-3pinhibitors或miRNA-543-3pantagomir。
进一步的，所述miRNA-543-3p为鼠的miRNA-543-3p，其核酸序列如SEQIDNO：1所示。
进一步的，所述miRNA-543-3pinhibitors的核酸序列如SEQIDNO：3所示。
本发明的有益效果是：
1)目前对于帕金森病中那些针对谷氨酸转运体发挥调控作用的microRNAs目前尚未见报道，而在本发明中，我们筛选并验证了miRNA-543-3p对谷氨酸转运体的表达与功能具有调节作用；并进一步验证了miRNA-543-5p直接作用于谷氨酸转运体。发现miRNA-543-5pinhibitors可以抑制miRNA-543-5p的功能，从而减弱miRNA-543-5p对谷氨酸转运体mRNA翻译的抑制效应，谷氨酸转运体蛋白的表达水平有所提高，从而降低谷氨酸的神经毒性效应，缓解帕金森病病情，为临床治疗帕金森病提供新靶标、新途径。
2)GLT-1是帕金森病病理因素其中的一个重要因素，本发明得出了在帕金森病(PD)的细胞模型中miRNA-543-3p直接作用于GLT-1。
3)miRNA-543-3p的抑制物(如miRNA-543-3pinhibitors或antagomir)通过抑制miRNA-543-3p而增加GLT-1的表达，降低兴奋性谷氨酸对神经元的毒性作用，可见直接作用于GLT-1mRNA的miRNA-543-3p能作为治疗帕金森病的靶标。
附图说明
图1为PD小鼠酪氨酸羟化酶表达降低并伴随有运动障碍；a为黑质酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色检测多巴胺能神经元的结果；b为对a图中TH阳性细胞的统计图；c为爬杆试验结果；d为悬挂实验结果；图中Con表示对照组；
图2为GLT-1蛋白的表达水平检测结果；其中a、b、c分别为小鼠中脑、纹状体、大脑皮层中GLT-1蛋白的表达水平；actin为内参；柱型图为蛋白凝胶电泳图的量化；
图3为GLT-1的mRNA水平检测结果；其中a、b、c、d分别为小鼠中脑、纹状体、大脑皮层、海马中GLT-1mRNA的表达水平；
图4为PD小鼠和对照小鼠大脑各部位突触体的活性检测；其中a、b、c、d分别为小鼠中脑、纹状体、大脑皮层、海马中突触体的活性；
图5为差异表达的miRNA的qRT-PCR验证；
图6为双荧光素酶报告基因实验，图中GLT-1-3’UTR即GLT-1的3’UTR序列，mimics即mmu-miR-543-3pmimics，mimicscontrol即用于阴性对归照的miRNA，mutGLT-1-3’UTR即GLT-1的3’UTRmut(突变)序列；
图7为星型胶质细胞中miR-543-3p对GLT-1mRNA水平的影响；
图8为小鼠星型胶质细胞中miR-543-3p对GLT-1总蛋白表达的影响；
图9为小鼠星型胶质细胞中miR-543-3p对GLT-1膜蛋白表达的影响；
图10为星型胶质细胞中miR-543-3p对GLT-1转运活性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1PD小鼠模型的制备及病理研究
一、PD小鼠模型的制备和鉴定
MPTP制备PD小鼠模型：
12周龄健康雄性C57/bl小鼠(体重约25-30g)，随机分为正常对照组和MPTP建造PD模型组。腹腔注射MPTP20mg/kg，每天注射1次，共计5天。在注射的第3天以及注射结束后的第3天和第5天通过动物行为学以及免疫组化染色等方法对造模进行检测。
检测内容包括：
(1)爬杆试验检测小鼠行为学的变化。
将一直径为2.5cm的泡沫塑料小球固定于一根长50cm、粗1cm的木杆顶端,木杆上缠2层纱布以防打滑。将小鼠放到球顶，记录以下3个时间：小鼠爬完杆长的上半部分所需时间；小鼠爬完杆长的下半部分所需的时间；小鼠爬完杆长的全长所需时间。整理总结最后的总时间，并作统计学分析。
(2)黑质酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)免疫组化染色检测多巴胺能神经元的变化。
组织经包埋机包埋后在恒冷冰冻切片机内切片，厚度为15μm，载玻片放入65℃烘烤2小时，放入-80℃保存备用。取出载玻片40℃孵育10min，PBS洗2次，每次5分钟，3％H2O2灭活内源性过氧化物酶，20分钟，再用用PBS洗2次，每次5分钟；滴加正常山羊或兔血清(与二抗体同源动物血清)处理，37℃，15分钟；滴加一抗(TH抗体)，置于4℃冰箱过夜。第二天取出载玻片用PBS洗2次，每次5分钟，滴加生物素化的二抗37℃孵育40分钟，再用PBS洗2次，每次5分钟；然后再滴加三抗(SAB复合物)，37℃孵育40分钟，PBS洗2次，每次5分钟。DAB显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止)；苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗15min；梯度酒精脱水：80％，2分钟→95％，2分钟→100％，2次，5分钟；二甲苯透明后用中性树胶封片，镜下观察。
应用MPTP腹腔注射制造PD小鼠模型，在注射MPTP后的第3天(3d)，以及PD造模后的第1天(5+1d)和第3天(5+3d)，各取一定量小鼠，分离中脑，应用酪氨酸羟化酶进行免疫组化检测，检测结果如图1a所示，经过统计后发现随着时间的延长，TH阳性细胞逐渐减少(如图1b)。爬杆试验(如图1c)和悬挂实验(如图1d)证实注射MPTP后的不同时间点，和对照组相比，PD小鼠出现了运动行为障碍。上述结果证明PD造模成功。
二、PD小鼠的病理研究
(1)PD小鼠中GLT-1蛋白表达水平的检测
方法：分别在注射MPTP后的第3天(3d)，以及PD造模后的第1天(5+1d)和第3天(5+3d)，各取一定量小鼠，WesternBlotting(免疫印迹试验)检测GLT-1分别在中脑、纹状体、大脑皮层中的表达情况，并且正常小鼠(对照组Con)作对比。
结果：
检测结果如图2所示，图中a、b、c分别是PD小鼠中脑、纹状体、大脑皮层中GLT-1蛋白在3个时间点的变化情况，只有在5+3d(即注射MPTP5天结束后的第3天)时PD小鼠中脑和纹状体的GLT-1蛋白水平明显降低。
(2)PD小鼠中GLT-1mRNA表达水平的检测
方法：分别在注射MPTP后的第3天(3d)，以及PD造模后的第1天(5+1d)和第3天(5+3d)，各取一定量小鼠，QRT-PCR检测GLT-1mRNA分别在中脑、纹状体、大脑皮层、海马中的表达情况，并且正常小鼠(对照组Con)作对比。
结果：
检测结果如图3所示，图3中a、b、c、d分别为中脑、纹状体、大脑皮层、海马中GLT-1的mRNA变化水平，与对照组(Con)相比PD小鼠GLT-1mRNA水平总体是降低的，而在5+3d时间点的中脑组织GLT-1mRNA水平则是增高的。而5+3d的GLT-1蛋白水平是降低的，因此推测在GLT-1mRNA翻译成蛋白的阶段有一个因素抑制了mRNA的翻译，猜测这个调控因素很可能是miRNA。
(3)PD小鼠大脑突触体的活性检测
分别在注射MPTP后的第3天(3d)，以及PD造模后的第1天(5+1d)和第3天(5+3d)，各取一定量小鼠，分别提取PD模型组和正常小鼠(对照组Con)的中脑、纹状体、大脑皮层、海马中的突触体，并检测突触体活性。
断头处死小鼠后迅速将脑取出分离大脑皮层、黑质、海马组织，在冰盒上分离大脑各区，加入冰冷的蔗糖缓冲液充分匀浆，移入EP管中，4℃离心收集沉淀，加入蔗糖缓冲液制成突触体悬液，蛋白定量后进行谷氨酸摄取功能的测定。将突触体悬液加入到Krebs缓冲液(127mMNaCl,3.73mMKCl,1.8mMCaCl2,1.18mMKH2PO4,20mMNaHCO3,2mMATP,2g/lD-葡萄糖,pH7.4)中，突触体膜蛋白终浓度为0.5mg/ml，反应体系为500μl。25℃水浴预温10min后加入L-[3,4-3H]-GlutamicAcid3H-L-谷氨酸(1μCi/管)，混匀后25℃水浴温育10min，加入5ml4℃预冷的Krebs缓冲液终止反应，迅速将突触体加到0.22μm硝酸纤维素膜上抽滤，并用2ml反应缓冲液冲洗滤膜3次后将滤膜取出，干燥滤膜后放入闪烁瓶中，加入3ml闪烁液暗化过夜，用液闪计数仪检测样品的放射活性强度(cpm)。突触体对谷氨酸摄取能力以每毫克蛋白质每分钟摄取的谷氨酸表示。
结果：
检测结果如图4所示，图4中a、b、c、d分别为小鼠中脑、纹状体、大脑皮层、海马中突触体在3个时间点的活性检测结果；从中可以看出，除了海马组织以外，PD小鼠大脑其他组织的谷氨酸转运体的摄取活性均降低。
实施例2差异表达microRNAs的筛选及与生物信息学预测结果的比对
一、高通量测序筛选差异表达的microRNA及验证
(1)高通量测序筛选差异表达的microRNA
方法：
制模完成后的第3天处死小鼠后分离大脑中脑，提取各组RNA。各组小鼠差异表达的microRNA由高通量测序技术完成。该技术的原理是在待测样品microRNAs的片段进行末端修复并在其两端分别连接5’-adapter和3’-adapter，上机检测，数据处理，筛选出有显著表达差异的microRNAs。
1)高通量测序的选择：本发明选择的高通量测序技术可以在一次测序中测定样本细胞中所有小RNA的序列信息，从而分析不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下各组织中的小RNA表达水平，精确比较不同样本之间的小RNA表达差异，为研究小RNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。通过高通量测序技术可以发现新的小RNA。
2)提取RNA并进行质量和浓度鉴定；
3)高通量测序筛选：高通量测序筛选实验的主要步骤包括用电泳切胶法获取长度范围在18～30nt左右的RNA片段；片段进行末端修复并在其两端分别连接5’-adapter和3’-adapter；随后扩增，得到最终的cDNA文库；DNA文库上机测序。此部分实验由公司负责完成。高通量测序分析结束后，根据其提供的数据库进行统计分析，以P值<0.01定义显著差异性表达。
4)microRNAs实时定量PCR检测：根据microRNAs前体特异的茎环结构，设计出具有microRNAs特异性的逆转录引物和PCR引物。由公司合成后，采用以SYBRGreenI染料为基础的qPCR检测方法，检测各组microRNA的表达差异。
结果：
将PD组与Con组样品分别去重复，得到单一的序列，得到各组的特有序列及两组公共序列。聚类分析将表达模式相近的miRNA聚在一起，用红色表示该miRNA在样品中的表达量高的，用绿色表示miRNA在样品中的表达量低的。看颜色对比，能知道哪一组样品表达上调或者下调。然后对所有差异表达的miRNA进行作图，采用不同的色彩直观地展示不同miRNA之间的表达差异，绿色表示miRNA表达下调，蓝色代表miRNA表达没有变化，红色代表miRNA表达上调，阈值是log2(FoldChange)绝对值大于1，得到Con与PD差异。表1为初步筛选出的具有差异表达的miRNA。
表1初步筛选出的高通量测序检测结果中具有差异表达的miRNA
表1为对差异表达的miRNA的进一步统计分析，列出了P-value小于等于0.05，PD组与对照组差异倍数大于等于1.2倍的部分miRNA。
(2)qRT-PCR验证差异表达的microRNA
方法：
qRT-PCR验证的样品为上述用来高通量测序的样本。制模完成后的第3天处死小鼠(PD组和Con对照组)后分离大脑中脑，提取各组小鼠中脑的RNA，一部分用来进行高通量测序，剩下的RNA则用来进行qRT-PCR验证。
1.miRNA反转录
反转录步骤参考TaKaRaPrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit(D6210A)试剂盒说明进行：
1)配制下列混合液：
2)在37℃下孵育60分钟。
3)在95℃下孵育5分钟以灭活miScriptReverseTranscriptaseMix。
4)进行PCR，剩余cDNA于-20℃保存。
2.Real-TimePCR反应
反应体系的配制，反应参数参考TaKaRaPremixExTaqTMII(PerfectRealTime)试剂盒说明进行，RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线应用Bio-RadCFX96Real-TimePCRSystem的操作方法进行。
qRT-PCR反应体系(20μl)：
试剂 体积(μl)
qanti Tect SYBR green master mix(2×) 10.0
universal Primer(10μM) 0.8
miRNA Primer(10μM) 0.8
cDNA模板 2
dH2O 6.4
Total 20
PCR程序如下：预变性95℃，10min；95℃10s，60℃20s，72℃30s，40个循环。
结果：
运用高通量测序筛选出PD小鼠模型与正常小鼠的差异表达的miRNA，用qRT-PCR对部分差异表达的miRNA进行验证；验证结果如图5所示，其结果与高通量测序检测结果基本一致；*表示PD组与对照组相比有统计学差异，P<0.05。
二、生物信息学预测microRNAs与GLT-1的关系及验证
(1)生物信息学预测microRNAs与GLT-1的关系
通过理论方法预测microRNAs的作用靶标，利用TargetScan(http:// www.targetscan.org/)、miRanda(http://www.microrna.org)、miTarget(http:// cbit.snu.ac.kr/～miTarget/)等预测软件对GLT-1mRNA3’端非编码区(3’UTR)可能结合的microRNA进行生物信息学分析，得出以GLT-1mRNA为靶基因的microRNA。
表2生物信息学预测以GLT-1mRNA为靶基因的microRNA。
通过TargetScans、miRDB、miRanda、Clip-Seq四个数据库预测作用于GLT-1mRNA的miRNA，对预测结果进行筛选整理，以其中两个软件共同预测结果作为基因的候选上游miRNA。表2列出了其中的几个可能的候选miRNA，miR-543-3p为其中一个。
同理通过TargetScans、miRDB、miRanda、Clip-Seq四个数据库反过来预测差异表达miR-543-3p的靶基因，GLT-1(表3中SLC1A2是GLT-1的基因名称)也是miR-543-3p众多靶基因中的其中一个，见表3。
表3候选miRNAmiR-543-3p的靶基因预测
GeneSymbol TargetScan miRanda CLIP-Seq miRDB
SKP2 0 1 0 0
SLAIN1 1 1 0 0
SLAMF7 0 1 0 0
SLC1A2 0 1 0 1
SLITRK3 1 1 0 0
SLITRK4 1 1 0 0
SLK 0 1 0 0
(2)双荧光素酶报告基因实验验证miR-543-3p与GLT-1mRNA的作用关系
方法：
1)GLT-13’UTR双荧光报告载体的制备：通过PCR扩增GLT-13’UTR序列(SEQIDNO：4)，该序列包含有通过软件预测的可能与mmu-miR-543-3p(SEQIDNO：1)结合的位点，回收PCR产物，酶切鉴定阳性克隆，将GLT-13’UTR与线性化的载体相连接，同时设立结合位点突变的GLT-13’UTR荧光报告载体。
2)分别将GLT-13’UTR和GLT-1的3’UTRmut(SEQIDNO：5)双荧光报告载体与miRNA的模拟序列mmu-miR-543-3pmimics(SEQIDNO：2)共转染293T细胞系，转绕24h后检测荧光素酶的活性，如二者相互结合，则会影响荧光的表达进而降低荧光值，如将结合位点突变后共转染，则无影响。
上述涉及的序列分别为：
mmu-miR-543-3p序列：5’-AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU-3’(SEQIDNO：1)；
mmu-miR-543-3pmimics序列：5’-AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU-3’(SEQIDNO：2)；
mmu-miR-543-3pinhibitors序列：5’-UUUGUAAGCGCCACGUGAAGAA-3’(SEQIDNO：3)；
GLT-1的3’UTR序列：
5'-AATACAGCCCCGAGGAGGAATGGGGGTGAATGTGTTTCCTGTTACTCAGTGAAATATCAGCCTACGCCTGCATCATTCCCACTCAGTGCACCAGTGGAACTTGTGGTTACCAAGTCTGAGGGAGGTTTAGAATGAAGACACTCGTCTCTCCTCCCTCACTGGTGGACTGGGCTTAAAGAGACAGAAAAAAAAATCAAAAAGTCCATCTCCTCTTCATACTCAAATCATGTCTTCTGGGGGAAGGGTCAACCTCTCTGGTTGTCAGATCTTCACTTGATGGTGACCTTCATCATGGCCTAAACATCATGGCCTGAAGAACCTTGTTACCTTTGACTTCCCGAGTTGGAGTACAAGAATGTTTTTATTGATTAGTAGTCATGCAGGTGAGCCTGAGCCTCCCCCGAAAGCACAGTTCTGGCAGCAAATTGCACACCTGTGAGAGAACAACAGAGTACTAGAAGCACACGAAGGCTCAGGGCCAGCAACAGCCAGGGGCCAGCAATGGTTGAGGACCAGCAAAGGCCAGTGGTCAACCTTGGCATTGGCAGAGGACCAACCTTTGATGGACTGATCTTGAGTATGTGACAGGAGGCTGATCTCCTCTACTC-3'(SEQIDNO：4)；
GLT-1的3’UTRmut(突变)序列(即GLT-1与miR-543-3p结合位点突变)：
5'-AATACAGCCCCGAGGAGGAATGGGGGTGAATGTGTTTCCTGTTACTCAGTGAAATATCAGCCTACGCCTGCATCATTCCCACTCAGTGCACCAGTGGAACTTGTGGTTACCAAGTCTGAGGGAGGTTTAGAATGAAGACACTCGTCTCTCCTCCCTCACTGGTGGACTGGGCTTAAAGAGACAGAAAAAAAAATCAAAAAGTCCATCTCCTCTTCATACTCAAATCATGTCTTCTGGGGGAAGGGTCAACCTCTCTGGTTGTCAGATCTTCACTTGATGGTGACCTTCATCATGGCCTAAACATCATGGCCTGAAGAACCTTGTTACCTTTGACTTCCCGAGTTCGTGATCTGCTATGGCTTTATTGATTAGTAGTCATGCAGGTGAGCCTGAGCCTCCCCCGAAAGCACAGTTCTGGCAGCAAATTGCACACCTGTGAGAGAACAACAGAGTACTAGAAGCACACGAAGGCTCAGGGCCAGCAACAGCCAGGGGCCAGCAATGGTTGAGGACCAGCAAAGGCCAGTGGTCAACCTTGGCATTGGCAGAGGACCAACCTTTGATGGACTGATCTTGAGTATGTGACAGGAGGCTGATCTCCTCTACTC-3'(SEQIDNO：5)。
结果：
构建分别包含野生型GLT-1的3’UTR序列和突变型GLT-1的3’UTR序列的双荧光素酶标记的表达载体，分别与miRNA的mimics共同转染入293T细胞系，24h后检测荧光值。检测结果如图6所示，从中可以看出，只有当mmu-miR-543-3pmimics存在时，含野生型GLT-1的3’UTR序列的双荧光报告载体的荧光比值明显降低，说明miR-543-3p对GLT-1有调控作用，GLT-1的miRNA为miR-543-3p真实的直接作用靶点。
实施例3mmu-miR-543-3p的功能分析
一、细胞实验检测mmu-miR-543-3p对GLT-1调节作用
通过microRNA过表达mmu-miR-543-3pmimics(SEQIDNO：2)和特异性抑制mmu-miR-543-3pinhibitors(SEQIDNO：3)分析microRNA对于MPP+染毒星形胶质细胞上GLT-1表达和功能的调控作用。其中，mmu-miR-543-3pinhibitors为mmu-miR-543-3p的反义寡核苷酸序列，即抑制物。
方法：
1)小鼠原代星形胶质细胞的培养：取出生后1～3d的新生C57/bl小鼠，制备星形胶质细胞并进一步纯化、鉴定。
2)分别将mmu-miR-543-3pinhibitors和mmu-miR-543-3pmimics转染正常小鼠星形胶质细胞和MPP+染毒组的小鼠星形胶质细胞，培养48h后检测下述指标：
①运用qPCR检测各组谷氨酸转运体的mRNA表达；
我们运用qPCR检测处理后各组细胞中谷氨酸转运体的mRNA表达水平，研究microRNA水平的变化对谷氨酸转运体在转录水平的影响。
原代星形胶质细胞加miR-543-3p的inhibitors，mimics处理24小时后加入MPP处理24小时，提取细胞的总RNA，q-PCR检测GLT-1的mRNA表达水平。结果如图7所示，从中可以看出miR-543-3pinhibitors与MPP共同处理组跟MPP组单独处理组相比GLT-1的mRNA水平显著增加，说明抑制了miR-543-3p后增加了GLT-1的mRNA表达水平；mimics与MPP共同处理组跟MPP组单独处理组相比GLT-1的mRNA水平显著降低，说明miR-543-3p会影响GLT-1的mRNA水平。
②WesternBlot检测各组谷氨酸转运体总蛋白和膜蛋白的表达；
细胞裂解后，分别提取总蛋白和膜蛋白、测定浓度。经SDS-PAGE蛋白电泳后进行半干免疫印迹杂交，检测GLT-1蛋白表达情况，用目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值之比进行半定量分析。
总蛋白的WesternBlot检测结果如图8所示，其中图8a为小鼠原代星形胶质细胞分别在mmu-miR-543-3pmimics、mmu-miR-543-3pinhibitors处理24小时后，加入MPP再处理24小时，提取细胞的总蛋白，Westernblot检测GLT-1的蛋白表达水平；b图为a图的量化；从中可以看出，在MPP的细胞模型(即模拟帕金森的细胞模型)中在加入miR-543-3p的inhibitors后明显增加了GLT-1的总蛋白表达量。
膜蛋白的WesternBlot检测结果如图9所示，从中可以看出，其中图9a为小鼠原代星形胶质细胞分别在mmu-miR-543-3pmimics、mmu-miR-543-3pinhibitors处理24小时后，加入MPP再处理24小时，提取细胞膜蛋白，Westernblot检测GLT-1的蛋白表达水平；b图为a图的量化；从中可以看出，在MPP的细胞模型(即模拟帕金森的细胞模型)中在加入miR-543-3p的inhibitors后明显增加了GLT-1的膜蛋白表达量；而加入miR-543-3p的mimics后明显降低了GLT-1的膜蛋白表达量。
③检测谷氨酸转运体的转运活性
将处理后的各组小鼠原代星形胶质细胞种植于24孔板，培养24小时后进行谷氨酸转运体活性检测。首先用氯化胆碱(ChCl)溶液洗涤二次，然后每孔加入200μl3H标记的底物(0.4μCi/孔)室温孵育10分钟后吸去标记底物，冰浴NaCl溶液洗涤二次后加入1％SDS溶液裂解细胞，加入闪烁液用液体闪烁计数仪检测转运至细胞内3H标记底物的放射性活性大小。
图10为小鼠原代星形胶质细胞分别在mmu-miR-543-3pmimics、mmu-miR-543-3pinhibitors处理24小时后，加入MPP再处理24小时后，加入GLT-1特异性的底物D-[3H]aspartate检测GLT-1的转运活性；从中可明显看出在MPP的细胞模型(即模拟帕金森的细胞模型)中在加入miR-543-3p的inhibitors后明显增加了GLT-1的转运活性。**P<0.01，***P<0.001。
综上所述，在帕金森病(PD)的细胞模型中miRNA-543-3p直接作用于GLT-1，降低GLT-1的表达；在加入了miRNA-543-3p的抑制物(如miRNA-543-3pinhibitors或antagomir)后增加了GLT-1的表达，在加入了miRNA-543-3p的mimics(miRNA的模拟序列)后加剧了GLT-1降低的水平。因此，说明miRNA-543-3p的抑制物(如miRNA-543-3pinhibitors或antagomir)可以抑制miRNA-543-3p的功能，从而减弱miRNA-543-3p对谷氨酸转运体(GLT-1)mRNA翻译的抑制效应，谷氨酸转运体蛋白的表达水平提高，从而降低谷氨酸的神经毒性效应，缓解帕金森病病情，为临床治疗帕金森病提供新靶标、新途径。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>南方医科大学
<120>miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用
<130>
<160>5
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>1
aaacauucgcggugcacuucuu22
<210>2
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
aaacauucgcggugcacuucuu22
<210>3
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
<400>3
uuuguaagcgccacgugaagaa22
<210>4
<211>608
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
aatacagccccgaggaggaatgggggtgaatgtgtttcctgttactcagtgaaatatcag60
cctacgcctgcatcattcccactcagtgcaccagtggaacttgtggttaccaagtctgag120
ggaggtttagaatgaagacactcgtctctcctccctcactggtggactgggcttaaagag180
acagaaaaaaaaatcaaaaagtccatctcctcttcatactcaaatcatgtcttctggggg240
aagggtcaacctctctggttgtcagatcttcacttgatggtgaccttcatcatggcctaa300
acatcatggcctgaagaaccttgttacctttgacttcccgagttggagtacaagaatgtt360
tttattgattagtagtcatgcaggtgagcctgagcctcccccgaaagcacagttctggca420
gcaaattgcacacctgtgagagaacaacagagtactagaagcacacgaaggctcagggcc480
agcaacagccaggggccagcaatggttgaggaccagcaaaggccagtggtcaaccttggc540
attggcagaggaccaacctttgatggactgatcttgagtatgtgacaggaggctgatctc600
ctctactc608
<210>5
<211>608
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aatacagccccgaggaggaatgggggtgaatgtgtttcctgttactcagtgaaatatcag60
cctacgcctgcatcattcccactcagtgcaccagtggaacttgtggttaccaagtctgag120
ggaggtttagaatgaagacactcgtctctcctccctcactggtggactgggcttaaagag180
acagaaaaaaaaatcaaaaagtccatctcctcttcatactcaaatcatgtcttctggggg240
aagggtcaacctctctggttgtcagatcttcacttgatggtgaccttcatcatggcctaa300
acatcatggcctgaagaaccttgttacctttgacttcccgagttcgtgatctgctatggc360
tttattgattagtagtcatgcaggtgagcctgagcctcccccgaaagcacagttctggca420
gcaaattgcacacctgtgagagaacaacagagtactagaagcacacgaaggctcagggcc480
agcaacagccaggggccagcaatggttgaggaccagcaaaggccagtggtcaaccttggc540
attggcagaggaccaacctttgatggactgatcttgagtatgtgacaggaggctgatctc600
ctctactc608

Claims (8)

1.miRNA-543-3p的抑制物在制备诊断帕金森病的试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的miRNA-543-3p抑制物为miRNA-543-3pinhibitors或miRNA-543-3pantagomir。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述miRNA-543-3p为鼠的miRNA-543-3p，其核酸序列如SEQIDNO：1所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述miRNA-543-3pinhibitors的核酸序列如SEQIDNO：3所示。
5.miRNA-543-3p的抑制物在制备治疗帕金森病药剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的miRNA-543-3p抑制物为miRNA-543-3pinhibitors或miRNA-543-3pantagomir。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述miRNA-543-3p为鼠的miRNA-543-3p，其核酸序列如SEQIDNO：1所示。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述miRNA-543-3pinhibitors的核酸序列如SEQIDNO：3所示。
CN201511029276.3A 2015-12-30 2015-12-30 miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用 Pending CN105617382A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511029276.3A CN105617382A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511029276.3A CN105617382A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105617382A true CN105617382A (zh) 2016-06-01

Family

ID=56032978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511029276.3A Pending CN105617382A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105617382A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106913876A (zh) * 2017-02-24 2017-07-04 南方医科大学 miRNA‑30a‑5p在帕金森病检测、治疗、预后靶点的应用
WO2019016252A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Hummingbird Diagnostics Gmbh MIARN USED AS BIOMARKERS OF PARKINSON'S DISEASE
CN113383090A (zh) * 2018-12-04 2021-09-10 拉筹伯大学 诊断疾病状态的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103028119A (zh) * 2011-11-22 2013-04-10 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用
WO2014018650A1 (en) * 2012-07-25 2014-01-30 Rush University Medical Center Mirnas as novel therapeutic targets and diagnostic biomarkers for parkinson's disease
WO2015073972A1 (en) * 2013-11-18 2015-05-21 Diamir, Llc METHODS OF USING mIRNAs FROM BODILY FLUIDS FOR DETECTION AND MONITORING OF PARKINSON'S DISEASE (PD)
CN104903468A (zh) * 2012-11-16 2015-09-09 西门子公司 用于帕金森氏病的新诊断MiRNA标志物
CN105063194A (zh) * 2015-07-31 2015-11-18 北京泱深生物信息技术有限公司 一种帕金森的诊断标志物及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103028119A (zh) * 2011-11-22 2013-04-10 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种miR-132在制备治疗帕金森病药物中的应用
WO2014018650A1 (en) * 2012-07-25 2014-01-30 Rush University Medical Center Mirnas as novel therapeutic targets and diagnostic biomarkers for parkinson's disease
CN104903468A (zh) * 2012-11-16 2015-09-09 西门子公司 用于帕金森氏病的新诊断MiRNA标志物
WO2015073972A1 (en) * 2013-11-18 2015-05-21 Diamir, Llc METHODS OF USING mIRNAs FROM BODILY FLUIDS FOR DETECTION AND MONITORING OF PARKINSON'S DISEASE (PD)
CN105063194A (zh) * 2015-07-31 2015-11-18 北京泱深生物信息技术有限公司 一种帕金森的诊断标志物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YI-BING OUYANG ET AL.: "Role of Astrocytes in Delayed Neuronal Death：GLT-1 and its Novel Regulation by MicroRNAs", 《ADV NEUROBIOL》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106913876A (zh) * 2017-02-24 2017-07-04 南方医科大学 miRNA‑30a‑5p在帕金森病检测、治疗、预后靶点的应用
CN106913876B (zh) * 2017-02-24 2020-01-21 南方医科大学 miRNA-30a-5p在帕金森病检测、治疗、预后靶点的应用
WO2019016252A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Hummingbird Diagnostics Gmbh MIARN USED AS BIOMARKERS OF PARKINSON'S DISEASE
EP4269621A3 (en) * 2017-07-20 2024-04-10 Hummingbird Diagnostics GmbH Mirnas as biomarkers for parkinson's disease
CN113383090A (zh) * 2018-12-04 2021-09-10 拉筹伯大学 诊断疾病状态的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ataman et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain
Mai et al. Intranasal administration of miR-146a agomir rescued the pathological process and cognitive impairment in an AD mouse model
Singh et al. MicroRNAs in Parkinson’s disease
Song et al. CSF miR-16 is decreased in major depression patients and its neutralization in rats induces depression-like behaviors via a serotonin transmitter system
Mushtaq et al. miRNAs as circulating biomarkers for Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease
Jayaram et al. MicroRNA expression in the glaucomatous retina
Antontseva et al. The effects of chronic stress on brain myelination in humans and in various rodent models
KR102626614B1 (ko) Ad로 인한 mci 진단 마커 및 그 응용
CN105617382A (zh) miRNA-543-3p在帕金森病的诊断和治疗中的应用
Gan et al. Circular RNAs in depression: biogenesis, function, expression, and therapeutic potential
CN106480037A (zh) 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用
Bai et al. Identification of circular RNAs regulating islet β-cell autophagy in type 2 diabetes mellitus
CN106913876B (zh) miRNA-30a-5p在帕金森病检测、治疗、预后靶点的应用
Kyzar et al. Current and future perspectives of noncoding RNAs in brain function and neuropsychiatric disease
Chen et al. Comprehensive transcriptional profiling of porcine brain aging
Chu-Tan et al. Functional microRNA targetome undergoes degeneration-induced shift in the retina
Wang et al. CircSYNDIG1 ameliorates stress-induced abnormal behaviors by suppressing miR-344-5p in mice
Zhang et al. Analysis of differential gene expression profiles uncovers mechanisms of Xuesaitong injection against cerebral ischemia-reperfusion injury
Majer et al. Microdissection and transcriptional profiling: a window into the pathobiology of preclinical prion disease
Ke et al. miR-34b-3p Inhibition of eIF4E Causes Post-stroke Depression in Adult Mice
Li et al. Pathogenic Effects and Potential Regulatory Mechanisms of Tea Polyphenols on Obesity
Aydemir et al. BDNF Measurement in Stress-Related Mood Disorders: A Review of Clinical Studies.
YN et al. Treating atrial fibrillation with radiofrequency ablation to reverse changes in microRNAs regulating the ion-channel proteins.
CN105535977A (zh) Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用
Ferro et al. The cytokine receptor Fn14 regulates neuronal transcription during development and brain function in the adult

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Ji Shaogang

Inventor after: Wu Xiaojuan

Inventor after: Zhang Xiuping

Inventor after: He Xiaoliang

Inventor after: Tong Huichun

Inventor after: Zhang Yunlong

Inventor after: Meng Xingjun

Inventor after: Zhang Wenlong

Inventor before: Ji Shaogang

Inventor before: Zhang Yunlong

Inventor before: He Xiaoliang

Inventor before: Zhang Xiuping

Inventor before: Wu Xiaojuan

Inventor before: Tong Huichun

Inventor before: Lu Lingli

Inventor before: Qin Sheng

CB03 Change of inventor or designer information
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160601

RJ01 Rejection of invention patent application after publication