WO2007043103A1 - シェーグレン症候群診断法及び診断キット - Google Patents

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WO2007043103A1
WO2007043103A1 PCT/JP2005/018114 JP2005018114W WO2007043103A1 WO 2007043103 A1 WO2007043103 A1 WO 2007043103A1 JP 2005018114 W JP2005018114 W JP 2005018114W WO 2007043103 A1 WO2007043103 A1 WO 2007043103A1
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syndrome
gene
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syfpeithi
bimas
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PCT/JP2005/018114
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Ken-Ichi Kozaki
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Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic method and diagnostic kit for siedalene syndrome, and more particularly, a diagnostic method based on detection of autoantibodies against a siedalene syndrome-related autoantigen and the autoantibodies related to the siedalene syndrome-related autoantigen present in a sample of a subject. It relates to a diagnostic kit.
  • Background art
  • Siedalen syndrome (hereinafter sometimes referred to as SjS) is an organ-specific autoimmune disease that targets exocrine glands such as salivary glands and lacrimal glands.
  • SjS is an organ-specific autoimmune disease that targets exocrine glands such as salivary glands and lacrimal glands.
  • the cause of the occurrence of Siedalen's syndrome is unknown, and at present, symptomatic treatment is mainly performed for dry symptoms such as dry eye (dry keratoconjunctivitis) and dry mouth.
  • some patients with Sigren's syndrome are not limited to glandular symptoms such as dry eye and xerostomia, and sometimes other autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, and even malignant lymphoma. It may be accompanied by a tumor.
  • Non-Patent Document 1 the risk of malignant lymphoma (non-Hodgikin lymphoma) in patients with Siedalen's syndrome is about 44 times that of humans, not Siedalen's syndrome (for example, Non-Patent Document 1). Therefore, it is considered possible to prevent these complications.
  • Non-patent literature l Blood Cells, Molecules, and Diseases, 274: 750-756, 2001.
  • Non-Patent Document 2 Ann. Rheum. Dis., 61: 554-558, 2002.
  • the main object of the present invention is to provide a diagnostic kit and diagnostic method for Siedalen syndrome, which enables reliable and simple diagnosis of Siedalen syndrome.
  • RNA obtained from human normal large salivary gland (parotid gland, submandibular gland, sublingual gland) tissue, human normal testis tissue, and human oral squamous cell carcinoma cell line A cDNA expression library was prepared, and an autoantigen gene that can be recognized by the autoantibody IgG contained in the serum of patients with schidaren syndrome was isolated by the expression cloning (SERE X) method using sera of patients with schidaren syndrome (SjS). These cDNA sequences were obtained.
  • Sarakuko is a self-anti-antibody specific to patients with sidalen syndrome by serologic screening using serum from healthy subjects, rheumatoid arthritis (RA) patients, or systemic lupus erythematosus (SLE) patients. An attempt was made to select the original gene. As a result, we succeeded in identifying the cDNA sequences of a total of 16 types of siedalen syndrome related autoantigen genes including new genes.
  • an autoantigen protein encoded by cDNA of a siedalene syndrome-related autoantigen gene in a body fluid or a body fluid component such as blood, serum, plasma, etc. of a subject !, an autoantigen protein encoded by cDNA of a siedalene syndrome-related autoantigen gene, Alternatively, the present inventors have found that the diagnosis of Siedalen syndrome can be made by confirming the presence of autoantibodies against polypeptides derived from such epitopes or epitopes-containing fragments.
  • the present invention relates to the following inventions.
  • Powerful group force Protein encoded by at least one selected gene or its epitope or epitope-containing fragment, and if necessary
  • a kit for diagnosing Siedalen syndrome comprising a protein encoded by at least one selected gene or an epitope or an epitope-containing fragment thereof.
  • kit according to Item 1 comprising at least a protein encoded by the IFI16 (NM 005531) gene or an epitope or an epitope-containing fragment thereof.
  • kit according to Item 1 comprising a protein encoded by the IFI16 (NM 005531) gene and the SS-B / La (NM 003142) gene, or its epitope or an epitope-containing fragment.
  • the protein according to Item 1 comprising a protein encoded by at least one of the above-mentioned genes or an epitope or an epitope-containing fragment thereof immobilized or bound to a carrier. Kit.
  • Powerful group force A protein encoded by at least one selected gene or its epitope or an epitope-containing fragment, as necessary
  • Powerful group power At least one protein encoded by these genes by reacting with a sample of a subject in combination with a protein encoded by at least one selected gene or an epitope or an epitope-containing fragment thereof
  • a method for diagnosing Siedalen syndrome comprising a step of detecting an autoantibody of a subject against.
  • At least a protein encoded by the IFI16 (NM 005531) gene or an epitope or a fragment containing the epitope is reacted with a sample of the subject to detect the subject's autoantibody against the protein encoded by the gene. Includes steps 6.
  • Item 6 A protein encoded by the IFI16 (NM 005531) gene and SS-B / La (NM 003142) gene or its epitope or an epitope-containing fragment is reacted with a sample of a subject and encoded by these genes.
  • Item 6 The method for diagnosing Sidadaren's syndrome according to Item 5, comprising the step of detecting a subject's autoantibody against the protein.
  • FIG. 1 shows an example of reaction findings in serological screening using sera of patients with sidalen syndrome.
  • N Negative clone
  • P Positive clone
  • FIG. 2 shows the results of serological screening of cedarene syndrome-related autoantigens using sera from patients with cedarene syndrome, healthy subjects, patients with rheumatoid arthritis, and patients with systemic lupus erythematosus. +: Positive, 1: Negative, DLE: Discoid lupus erythematosus, HD: Hashimoto's disease, RA: Rheumatoid arthritis, SLE: Systemic lupus erythematosus, SjS: Siedalen syndrome group, SSc: Systemic sclerosis (scleroderma)
  • FIG. 3 shows the positive frequency of autoantibodies against IFI16 antigen and SS-B / La antigen in the screening results using sera from patients with sidalen syndrome.
  • ⁇ Positive reaction
  • Country Negative reaction
  • Shaded area Positive case of serum autoantibodies against either IFI16 antigen or SS-B / La antigen or both antigens
  • the siedalene syndrome-related self-antigen gene is a SEREX method (serologi cal identification of antigens by recombinant cDNA expression cloning analysis). It refers to the gene that encodes the found autoantigen.
  • SEREX method is a method for searching tumor antigens using a cDNA expression library prepared by directly extracting mRNA from cancer tissue force extracted from cancer patients and the sera of cancer patients themselves.
  • a gene refers to DNA, a coding region (exon) translated into amino acids, an intron inside the region, and a portion transcribed into mRNA 5 'upstream and 3' downstream. Including the full range of Even outside this range, a part related to transfer or transfer efficiency of a certain area Minutes are part of the gene of the present invention.
  • cDNA sequences are partial sequences of each siedalene syndrome-related autoantigen gene. For the full length of each gene sequence, search for the corresponding accession number in a known database (NCBI). You can confirm by doing. Table I shows the name of each gene and the corresponding NCBI accession number.
  • an epitope or an epitope-containing fragment of the protein encoded by the gene includes at least one epitope and is recognized by an autoantibody. Large enough to be recognized.
  • the polypeptide encoded by the “part shown in the sequence listing” in Table I is surely recognized by autoantibodies in patients with Siedalen syndrome. As long as they are included in a protein epitope or epitope-containing fragment.
  • the gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is considered to be the IFI16 gene.
  • the IFI16 gene was discovered as a gene that induces HIN-200 (Hematopoietic Interferon-inducible Nuclear antigen) family IFN interferon-alpha and gamma.
  • the IFI16 gene is considered to be a transcription factor mainly related to cell growth inhibition and cell division.
  • the inventor of the present invention uses the SEREX method using serum of a patient with sidalen syndrome, and serum using sera of multiple samples obtained from healthy subjects or patients with autoimmune diseases other than sigren's syndrome (RA or SLE). Screening, we found that autoantibodies against IFI16 protein were frequently detected in sera of patients with sidalen syndrome (see Figure 2).
  • the anti-IFI16 antibody and the anti-SS-B / La antibody that has already been applied clinically as a diagnostic marker for siedalene syndrome have positive rates and specificities in multiple sera of patients with siedalen syndrome.
  • both autoantibodies showed a high positive rate, and both or one of the autoantibodies was always detected in the serum of patients with Siedalen syndrome (see Fig. 3).
  • KLHL12 When a gene containing the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 6 was subjected to a homologous search using a known database, it was identified as the KLHL12 gene.
  • KLHL12 has a BTB / POZ domain that is involved in protein intermolecular binding on the primary structure of its amino acid sequence. Therefore, it is considered to belong to the gene family called kelch-like protein.
  • KLHL7 is considered to belong to a gene family called kelch-like protein because it has a BTB / POZ domain that is considered to be involved in protein intermolecular binding in the primary structure of its amino acid sequence.
  • anti-KLHL12 antibody and anti-KLHL7 antibody were both specifically detected in sera of syndrome patients, and were healthy, patients with rheumatoid arthritis (RA), and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Was not detected at all in the serum, suggesting a strong specificity for Siedalen syndrome. Therefore, it can be said that a patient in whom anti-KLHL12 antibody and / or anti-KLHL7 antibody is detected in serum is very likely to have Sidalen syndrome.
  • RA rheumatoid arthritis
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • an epitope usually refers to a specific structural unit having an amino acid sequence of about 6 to 20 and capable of being recognized and bound by an antibody.
  • an epitope containing fragment refers to a protein fragment containing one or more of the epitopes.
  • HLA Human Leukocyte Antigen
  • Table II shows the results of analysis for IFI16.
  • amino acid sequences of the peptides listed in Table II are shown as SEQ ID NO: 3394 in the order of the strength of the table.
  • Table III shows the results of analysis for KLHL12.
  • the peptides listed in Table III The amino acid sequences of the sequences are shown as SEQ ID NOs: 95 to 190 in order from the top of the table.
  • Table IV shows the results of analysis for KLHL7.
  • amino acid sequences of the peptides described in Table IV are shown as SEQ ID NOS: 191 to 211 in the order of the top of the table.
  • the full length of the base sequence or a DNA fragment containing the base sequence is inserted downstream of the promoter of the expression vector, and the recombinant vector is inserted. Is made.
  • the recombinant vector is then introduced into a suitable host cell. Thereafter, the cell into which the recombinant vector has been introduced is cultured under appropriate conditions, and the peptide or recombinant protein produced by the cell is isolated and purified from the host cell to obtain the peptide or recombinant protein described above. This comes out.
  • the host cell may be any bacterial cell (such as E. coli), yeast, animal cell, plant cell, insect cell, etc., as long as it can express the target gene.
  • publicly known expression vectors can be used and are not particularly limited.
  • a method for gene transfer of the recombinant vector for example, a known method such as a method using calcium ions, an electopore method, a microinjection method, a competent cell method, a protoplast method, or the like can be used.
  • the recombinant vector is capable of autonomous replication in prokaryotes, and has a promoter at a position where the DNA encoding the peptide or protein of the Siedalen syndrome-related autoantigen of the present invention can be transcribed! / If so!
  • isolation and purification methods commonly used by those skilled in the art can be used. For example, anion chromatography, cation chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, etc. Method, affinity chromatography method, isoelectric focusing method and the like. These isolation / purification methods can be used alone or in combination.
  • peptides can be synthesized by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Fmoc method fluorylmethyloxycarbonyl method
  • tBoc method t-butyloxycarbonyl method
  • the Advanced ChemTech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Technology, SyntheceU—Vega It can also be obtained by using a peptide synthesizer such as the company, PerS Inteive, Shimadzu Corporation.
  • a host cell such as an Escherichia coli component is used in advance. It is preferable to react the components with the serum of the subject and remove antibodies that can react with the host cell components.
  • the peptide or the recombinant protein obtained by the method described in (3) above can be used in the form of a diagnostic kit described below.
  • the diagnostic kit of the present invention can be used in a form in which the Siedalen syndrome-related self-antigen is contained in a suitable container, a carrier such as a resin, a membrane, or a film, or a form that is fixed to these carriers.
  • a carrier such as a resin, a membrane, or a film
  • the carrier include polyvinyl chloride, polystyrene, styrene-divinylbenzene copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, nylon, polybutyl alcohol, polyacrylamide, polyacrylonitrile, polypropylene, and polymethylene methacrylate.
  • Synthetic organic polymer compounds such as Sephadex
  • polysaccharides such as agarose gel (Sepharose, biogel, etc.)
  • cellulose filter paper, paper disks, etc.
  • inorganic polymer compounds such as glass, silica gel, and silicone .
  • the shape of the carrier is flat (microtiter plate, disk, etc.), particulate (beads, etc.), tubular (test tube), fibrous, membrane, particulate (latex particles, etc.), capsule, parcel
  • the body shape is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the measurement method.
  • a detection When a detection is performed, if a 96-well microtiter plate is used, it can be reacted with many kinds of antigens or multiple samples of serum at a time.
  • multiple types of Siddaren syndrome-related autoantigen peptides or recombinant proteins encoded by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 14 can be added to SS-A / Ro and as necessary.
  • a self-antigen (including a fragment capable of binding to an antigen) encoded by Z or SS-B / La and used as a diagnostic kit of the present invention.
  • a conventionally known method may be used, for example, a physical adsorption method, an ionic bond method, a covalent bond method, a comprehensive method, or the like. Blocking with a blocking agent such as gelatin or BSA is preferred to prevent non-specific binding to the immobilized antigen! /.
  • the sample of the subject includes, for example, body fluids such as blood, tears, saliva and the like and serum derived from the body fluids or body fluid components such as plasma.
  • body fluids such as blood, tears, saliva and the like
  • serum derived from the body fluids or body fluid components such as plasma.
  • it is preferable to use serum because blood tests by blood sampling are generally and simply performed.
  • reaction conditions Conditions known to those skilled in the art are applied as reaction conditions, detection conditions, and the like.
  • detection method include ELISA method, precipitation reaction method, agglutination reaction method, Western blotting method, RIA method and the like.
  • the substrate corresponding to the enzyme labeled with the secondary antibody (horse radish peroxidase: DAB, etc., alkaline phosphatase: p-NPP, etc., j8 galactosidase: X-gal, etc.) is developed and colored, and the microplate
  • the autoantibodies in the serum of the subject can be detected and quantified by a spectroscope such as a reader.
  • At least one of the antigen proteins encoded by the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14 is added to SS-A / Ro and Z or SS-B / L as necessary. combined with the antigenic protein encoded by a (including fragments capable of binding to the antigen)
  • SS-A / Ro SEQ ID NO: 31
  • SS-B / La SEQ ID NO: 32
  • Detection of autoantibodies in body fluids or components of body fluids such as serum of a subject may be performed using an antigen alone, but in order to improve the accuracy of diagnosis, a combination of multiple types of antigens may be used. preferable.
  • the antigen that binds to the carrier contained in the kit contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • IFI16 and SS-B / La show a positive reaction
  • the positive reaction means that autoantibodies to the respective self-antigens are present in the patient serum.
  • the positive reaction is indicated by the positive reaction in the color development of the labeled antibody.
  • antigens full length or fragments encoded by KLHL12 and KLHL7 genes may be used in combination. Since these antigens are highly specific for Siegren's syndrome and are a combination of antigens, both KLHL12 and KLH L7, or KLHL12 or KLHL7! Can be diagnosed.
  • biopsy eg, collection of lip small salivary gland tissue, lacrimal gland tissue, etc.
  • ophthalmic examination eg, Rose Bengal test, Shearer test, etc.
  • measurement of salivary secretion, salivary gland Diagnosis may be performed by combining conventional diagnostic methods such as scintigraphy.
  • An antagonist peptide can be prepared using a variant of each amino acid sequence shown in any of Tables II to IV (SEQ ID NOs: 33 to 211).
  • the antagonist peptide is TCR wild-type (poly) peptides that bind to MHC molecules and are expressed on the membrane surface of T cells at very low concentrations (e.g., polypeptides comprising amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 22, 23, etc.) Specifically) only the response to.
  • Known methods can be applied to the amino acid sequence modification, for example, Yael Katz-Levy et al., PNAS., 90: 7000-7004, 19 93 .; Yael Katz-Levy et al., PNAS.
  • the molecular synthesis method described in (2) above or a method using a peptide synthesizer may be used.
  • the modification of the amino acid sequence in Tables II to IV refers to any amino acid substitution, deletion, addition, combinations thereof, etc., among others, being substituted by any amino acid, I prefer something.
  • an antagonist peptide can be obtained.
  • an antago-steptide binds to an MHC molecule
  • T cells have the ability to recognize this antago-steptide peptide. It falls into (Ananaji).
  • Alaji As a result, no autoimmune reaction is induced, and it is possible to reduce or suppress the onset of autoimmune diseases. Therefore, the antagonist peptides obtained based on the amino acid sequences shown in Tables II to IV are considered useful as preventive or therapeutic agents for Siedalen syndrome.
  • the antagonist peptide may be used, it can be preferably used as a cocktail in which two or more kinds of antagonist peptides are combined. For example, if there are multiple antigenic proteins that are specific for Scherdalen syndrome and have many autologous antibody-positive Sigren's syndrome patients, it is possible to use a cocktail that combines each antagonist peptide against multiple antigenic proteins. preferable.
  • a preventive or therapeutic agent for schidaren syndrome comprising the above antagonist peptide as an active ingredient
  • at least one of the antagonist peptides is used as it is, or a pharmaceutically acceptable carrier and Z or diluent.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited as long as it does not impair the effect of the antagonist peptide, and examples thereof include human serum albumin, and the diluent includes, for example, Examples include physiological saline (PBS) and distilled water.
  • PBS physiological saline
  • the form of the preparation is not particularly limited, and it may be used as a freeze-dried product, granule, liquid or the like.
  • known excipients, stabilizers, preservatives and the like may be added.
  • the antagonist peptide may be administered in admixture with MHC molecules.
  • an MHC molecule to be mixed an existing one prepared by using the chemical synthesis method described in (2) above or a method using a peptide synthesizer may be used
  • the dose of the above-mentioned antagonist peptide as an active ingredient for the prevention or treatment of Sidalen syndrome is about 0.001 to 1000 mg, preferably about 1 to 100 mg per administration of the antagonist peptide of the present invention.
  • the force that can be administered so as to be about 0.01 to 100 mg is not limited to this range.
  • the sample used in this example was prepared as follows.
  • tissue-derived total RNA was obtained by obtaining informed consent from surgically resected tissues of oral cancer patients who had undergone cervical dissection. Dissolve the tissue with uanidine thiocyanate solution, collect it, and use guanidine-cesium chloride method (1st column, Molecular loning. A laboratory manual. Second edition. J. Sambrook, EF Frits ch, T. Maniatis. (See Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.) The total RNA was extracted.
  • Total RNA derived from normal human testis tissue is from BioChain Institute, Inc. (Hayward, CA, USA). Purchased c
  • the human oral squamous cell carcinoma cell line HSQ89 (BioResource Center, Tsukuba, Japan) uses DME M + 10% FBS as the medium and contains 5% CO.
  • RNA purification kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) was used. MRNA was obtained from 600 ⁇ g or 1200 g of total RNA. Purified. First-strand cDNA was synthesized from each 5 ⁇ g of mRNA using a linker primer containing the restriction enzyme Xho I site and a methylnucleotide mixture (10 mM dATP, lOmM dGTP, lOmM dTTP, 5 mM 5-methyl dCTP).
  • StrataScript RT (Stratagene, La Jolla, CA, USA) was used and reacted at 42 ° C for 1 hour to increase the elongation efficiency.
  • DNA polymerase I (Stratagene) was added and reacted at 16 ° C for 2.5 hours to synthesize second-strand cDNA (Stratagene) .
  • the synthesized cDNA is blunt-ended using Pfo DNA polymerase (Stratagene), and the adapter containing the Eco RI site is T4 DNA ligase (Stratagene) at 8 ° C and the adapter is ligated. It was.
  • the Eco RI site protrudes from the end of the connected adapter, but it is not phosphorylated. Therefore, T 4 polynucleotide kinase (Stratagene) was added and phosphorylated.
  • the resulting double-stranded cDNA was treated with Xho I (Promega, Heidelberg, Germany) and treated with CROMA SPIN-400 (Clontech) in order to remove short cDNA of about 400 bp or less and concentrate full-length cDNA. , Palo Alto, CA, USA).
  • the cDNA was fractionated by gel filtration. After quantification using fractionated c DNAf or Pico Green ds cDNA Quantitation reagents (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), 1 ⁇ g of ZOO express vector for each lOOng cDNA using T4 DNA ligase (Stratagene) (Stratagene) was subjected to ligation at 12 ° C.
  • phage 'library was amplified in NZY medium (Sigma, St. Louis, MO, USA), and after titration, Stored at 4 ° C.
  • XL1-Blue MRF ′ cells and XLOLR cells were streaked at 37 ° C. on LB-tetracycline agar plates (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) to obtain single colonies.
  • X Ll-Blue MRF 'cells contain 20 ml LB / MgSO / Maltose medium (Becton Dickinson), XLO
  • each membrane was washed with a TBS buffer solution containing 0.05% Tween20 and 5% NFDM.
  • the lysed positive clone-derived phage was plated at a concentration of 1 ⁇ 10 2 plaques / 100 mm plate, and the above operation was repeated to isolate a single positive clone (secondary and tertiary screening).
  • Each single positive clone was converted to pBK-CMV phagemid vector by in vivo excision using ExAssist interference-resistant helper phage and XLOLR cells.
  • the steps from mRNA purification using the mRNA purification kit (Amersnam Pharmacia Biotecn, Piscataway, NJ, UbA) to in vivo excision are as follows: ZAP Express cDNA synthesis kit and ZAP Express cDNA uigapack III Cold Cloning kit (Stratagene, La Jolla, CA , USA).
  • Plasmid DNA was purified using the QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), cleaved with restriction enzymes Eco RI and Xho I (Promega), and the insert cDNA contained in the plasmid was analyzed by agarose gel electrophoresis. The presence and size were confirmed.
  • Table V shows the Siedalen syndrome-related autoantigen genes isolated and identified from each cDNA library by the SEREX method, and Fig. 1 shows typical positive findings.
  • TMF1 1 NM 007114 1395-3282 3p21-pl2 TATA element modulatory factor
  • FIG. 2 shows the positive frequency of autoantibodies against each gene group in the serum of SjS, HC, RA, and SLE subjects.
  • FIG. 3 shows the positive frequencies of antibodies against IF 116 antigen and SS-B / La antigen in the results of screening using sera from patients with Siedalen syndrome.
  • HSQ89, testis, sublingual gland, parotid gland, and submandibular gland RNA were obtained by the method described in (2) above, and spleen, liver, kidney, spleen, lung, and muscle RNA were obtained from BioChain Institute. , Inc. (Hayward, CA, USA), respectively, using Molecular Cloning. A laboratory manual, second edition. J. bambrook, EF Frits ch, T. Maniatis. And old Spring Harbor Laboratory Press. 1989 Northern blot analysis was performed according to the method described in.
  • SEQ ID NOs: 33 to 211 are amino acid sequences of epitopes.

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Abstract

　本発明は、確実かつ簡便にシェーグレン症候群を診断することを可能とするシェーグレン症候群の診断キット及びこれを用いたシェーグレン症候群の診断方法、ならびにシェーグレン症候群の治療に有用なアンタゴニストペプチドを提供することを主な目的とする。本発明は、SEREX法を用いた発現クローニングと血清学的スクリーニング法により、複数のシェーグレン症候群関連自己抗原遺伝子を特定した。

Description

明 細 書
シエーグレン症候群診断法及び診断キット
技術分野
[0001] 本発明は、シエーダレン症候群診断法及び診断キットに関し、詳しくはシエーダレン 症候群関連自己抗原及び被検者のサンプル中に存在する該シエーダレン症候群関 連自己抗原に対する自己抗体の検出に基づく診断方法及び診断キットに関する。 背景技術
[0002] シエーダレン症候群 (以下 SjSと記載することがある)は、唾液腺、涙腺等の外分泌腺 を標的とする臓器特異的自己免疫疾患とされている。シエーダレン症候群の発症原 因は不明であり、現在のところ、主訴であるドライアイ (乾性角結膜炎)、口内乾燥症等 の乾燥症状に対する対症療法が主に行われている。しかしながら、一部のシ ーグ レン症候群患者では、ドライアイ、口腔乾燥症等の腺症状にとどまらず、時には、慢 性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス等の他の自己免疫疾患、さらには悪性リン パ腫等を合併することもある。特に、シエーダレン症候群の患者における悪性リンパ 腫 (非 Hodgikinリンパ腫)のリスクは、シエーダレン症候群でな!、人の約 44倍であり (例 えば非特許文献 1)、シエーダレン症候群を早期に発見することによって、これらの合 併症を予防することが可能であると考えられる。
[0003] 現在、シヱーダレン症候群の診断には、主に患者の唾液腺の生検、唾液分泌量の 測定、抗 SS-A/Ro及び抗 SS-B/La抗体の検出 (例えば非特許文献 2)等が用いられて いる。し力しながら、生検は侵襲を伴うため好ましくなぐ唾液分泌量の測定に関して も手間が力かるといった問題がある。また、抗 SS-A/Ro及び抗 SS-B/La抗体の検出に よる診断では、偽陰性を示す場合もあることから、確実で簡便な診断方法が望まれて いる。
非特許文献 l : Blood Cells, Molecules, and Diseases, 274: 750-756, 2001.
非特許文献 2 : Ann. Rheum. Dis., 61: 554-558, 2002.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0004] 本発明は、確実かつ簡便にシエーダレン症候群を診断することを可能とするシエー ダレン症候群の診断キット及び診断方法を提供することを主な目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者は、ヒト正常大唾液腺 (耳下腺、顎下線、舌下腺)組織、ヒト正常精巣組織 、及びヒト口腔扁平上皮癌細胞株カゝら得られた total RNAをもとに cDNA発現ライブラ リーを作製し、シヱーダレン症候群 (SjS)患者血清を用いた発現クローユング法 (SERE X)によって、シヱーダレン症候群患者の血清中に含まれる自己抗体 IgGが認識し得る 自己抗原遺伝子を単離し、これらの cDNA配列を得た。さら〖こ、本発明者は、健常者 、慢性関節リウマチ (RA)患者、又は全身性エリテマトーデス (SLE)患者の血清を用い た血清学的スクリーニング法によって、シ ーダレン症候群患者に特異的な自己抗 原遺伝子の選別を試みた。その結果、新規遺伝子を含む計 16種のシエーダレン症 候群関連自己抗原遺伝子の cDNA配列を特定することに成功した。
[0006] また、本発明者は、被検者の血液、血清、血漿等の体液又は体液成分中にお!、て 、シエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子の cDNAによりコードされる自己抗原タン パク質、或いはそのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントに由来するポリべプチ ドに対する自己抗体の存在を確認することで、シエーダレン症候群の診断が可能で あることを見出した。
[0007] すなわち、本発明は以下の発明に関する。
1. 以下の 14個の遺伝子
[0008] [表 1]
遺伝子 NCBI Access ion Number
DBT NM 001918
DKFZP564B1023 NM 031306
DR1 NM 001938
IFI 16 NM 005531
IAA0261 XM 290471
KLHL1 NM 021633
KLHL7 AF 111113
N4BP2 NM 018177
PMS1 NM 000534
SPIP1 NM 021144
SDCCAG1 NM 004713
SP100 匪 003113
TMF1 丽 007114
VCIP135 丽 025054
[0009] 力もなる群力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子によりコードされるタンパク質或いは そのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントと、必要に応じて
以下の 2種の遺伝子：
[0010] [表 2]
Figure imgf000005_0001
[0011] 力もなる群力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子によりコードされるタンパク質或いは そのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントを含む、シエーダレン症候群診断用キ ッ卜。
2. 少なくとも IFI16 (NM 005531)遺伝子によりコードされるタンパク質或いはそのェ ピトープ又はェピトープ含有フラグメントを含む、項 1に記載のキット。
3. IFI16 (NM 005531)遺伝子と SS- B/La (NM 003142)遺伝子によりコードされるタ ンパク質或 、はそのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントを含む、項 1に記載の やット。
4. 少なくとも 1種の前記遺伝子によりコードされるタンパク質或いはそのェピトープ 又はェピトープ含有フラグメントを担体に固定ィ匕または結合させて含む、項 1に記載 のキット。
5. 以下の 14個の遺伝子
[表 3]
Figure imgf000006_0001
[0013] 力もなる群力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子によりコードされるタンパク質或いは そのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントを、必要に応じて
以下の 2種の遺伝子：
[0014] [表 4]
Figure imgf000006_0002
[0015] 力もなる群力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子によりコードされるタンパク質或いは そのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントと組み合わせて被検者のサンプルと 反応させて、これら遺伝子によりコードされる少なくとも 1種のタンパク質に対する被検 者の自己抗体を検出する工程を包含する、シエーダレン症候群の診断方法。
6. 少なくとも IFI16 (NM 005531)遺伝子によりコードされるタンパク質或いはそのェ ピトープ又はェピトープ含有フラグメントを被検者のサンプルと反応させて、該遺伝子 によりコードされるタンパク質に対する被検者の自己抗体を検出する工程を包含する 、項 5に記載のシヱーダレン症候群の診断方法。
7. IFI16 (NM 005531)遺伝子と SS- B/La (NM 003142)遺伝子によりコードされるタ ンパク質或いはそのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントを被検者のサンプルと 反応させて、これら遺伝子によりコードされるタンパク質に対する被検者の自己抗体 を検出する工程を包含する、項 5に記載のシヱーダレン症候群の診断方法。
発明の効果
[0016] 本発明によれば、確実かつ簡便にシ ーダレン症候群の診断を可能にするシエー ダレン症候群の診断キット、及びシエーダレン症候群の診断方法を提供することがで きる。
[0017] 従来、シ ーダレン症候群の診断には、侵襲を伴う方法や偽陰性を示す可能性が ある方法が主に用いられてきた力 本発明者によって見出されたシ ーダレン症候群 関連自己抗原遺伝子にコードされるペプチド又はリコンビナントタンパク質を利用し て患者血清中の自己抗体を調べることで、シ ーグレン症候群の確実な診断が可能 である。さらに、本発明の診断キットを用いれば、少量の試料力 簡便な方法によつ てシ ーダレン症候群の診断ができる。
[0018] また、シ ーダレン症候群を確実に診断できることから、例えば、各患者における発 症時期、家族歴、予後等の病態データの蓄積が可能になる。各患者の病態データと シエーダレン症候群患者の遺伝子多型を組み合わせて利用すれば、シヱーダレン症 候群発症のリスクに関連する SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)を単離 '同定す ることも可能となる。単離 ·同定された新規 SNPに関する情報は、シエーダレン症候群 の発症予測、さらにはシ ーダレン症候群の予防方法、新規治療方法の開発に役立 つものと考えられる。
[0019] シヱーダレン症候群には、マクログロブリン血症や悪性リンパ腫等の重篤な症状へ と進展するものと、乾燥症状等の軽度な症状のまま経緯するものがあるが、前述の臨 床データと本発明による検査方法とを組み合わせることにより、シエーダレン症候群 の予後についての予測も可能になると考えられる。
[0020] さらに、臓器特異的な遺伝子治療が可能となれば、外分泌腺等の標的臓器におけ る配列番号 1〜14に記載のシエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子の発現を抑制 することによって、シエーダレン症候群の根本治療ができると考えられる。
[0021] 力！]えて、本発明によれば、 T細胞の活性を阻止し得る、シエーダレン症候群の治療 に有用な該ペプチドのアンタゴ-ストペプチドの提供も可能である。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]シ ーダレン症候群患者血清を用いた血清学的スクリーニングにおける反応所 見の一例を示す。 N:陰性クローン、 P:陽性クローン
[図 2]シ ーダレン症候群患者、健常者、慢性関節リウマチ患者、及び全身性エリテ マト一デス患者の血清を用いた、シエーダレン症候群関連自己抗原の血清学的スク リー-ングの結果を示す。 +：陽性、一 ：陰性、 DLE:円盤状エリテマトーデス、 HD :橋 本病、 RA:慢性関節リウマチ、 SLE:全身性エリテマトーデス、 SjS :シエーダレン症候 群、 SSc:全身性硬化症 (強皮症）
[図 3]シ ーダレン症候群の各患者血清を用いたスクリーニング結果における IFI16抗 原及び SS-B/La抗原に対する自己抗体の陽性頻度について示す。□：陽性反応、 國：陰性反応、網掛け部分: IFI16抗原と SS-B/La抗原のどちらか一方の抗原、あるい は両方の抗原に対する血清中自己抗体の陽性症例
[図 4]ヒト臓器における IFI16、 KLHL12, KLHL7遺伝子の発現分布についてのノザン ブロット解析
発明を実施するための最良の形態
[0023] (1)シエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子
本発明においてシエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子とは、 SEREX法 (serologi cal identification of antigens by recombinant cDNA expression cloning analysis)【こよ つてクロー-ングされ、且つ血清学的スクリーニング法によってシエーダレン症候群と の強い関連性が見出された自己抗原をコードする遺伝子を指す。 SEREX法とは、癌 患者カゝら摘出した癌組織力ゝら直接 mRNAを抽出して作製した cDNA発現ライブラリー と癌患者自身の血清を用いて、腫瘍抗原を検索する方法である。
[0024] また、本発明にお ヽて遺伝子とは DNAを指し、アミノ酸に翻訳されるコード領域 (ェ クソン)と領域内部のイントロン、及び 5'上流及び 3'下流で mRNAに転写される部分 の全範囲を含む。また、この範囲外でも、ある領域の転写又は転写効率に関わる部 分は、本発明の遺伝子の一部とする。
[0025] 本発明者が行った SEREX法による発現クローユングにおいて、配列番号 1〜16に記 載される塩基配列を有する cDNAが単離された。このうち、配列番号 1〜14の塩基配 列によってコードされるタンパク質 (アミノ酸配列：配列番号 17〜30)は、本発明者によ つて初めてシエーダレン症候群に関連する自己抗原タンパク質であることが示された ものである。配列番号 1〜16にコードされるアミノ酸配列を、順に配列番号 17〜32に 示す。
[0026] これらの cDNA配列は、各シエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子の部分配列で あり、各遺伝子配列の全長については、公知のデータベース (NCBI)で、対応するァ クセッション番号 (Accession Number)を検索することによって確認できる。表 Iに、各遺 伝子の名称及び対応する NCBIのァクセッション番号を示す。
[0027] [表 5]
表 I
Figure imgf000009_0001
本明細書において、上記遺伝子によりコードされるタンパク質のェピトープ又はェピ トープ含有フラグメントは、少なくとも 1種のェピトープを含み、且つ自己抗体により認 識されるに十分な大きさを有する。例えば、表 Iの「配列表に示される部分」によりコー ドされるポリペプチドは、確実にシエーダレン症候群患者の自己抗体により認識され る力 これらより短い配列であっても、自己抗体により認識される限り、タンパク質のェ ピトープ又はェピトープ含有フラグメントに包含される。
[0029] 以下、シエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子 IFI16、 KLHL12及び KLHL7を例に とり、その機能を説明する。
(0配列番号 4に記載の配列を有する遺伝子 (IFI16)
配列番号 4に記載の塩基配列を含む遺伝子は、相同検索を行った結果、 IFI16遺 伝子であると考えられる。 IFI16遺伝子は、 HIN- 200 (Hematopoietic Interferon- induci ble Nuclear antigen)ファ^リ ~~【こ属し、 IFN interferonノ—alpha及び— gamma【こよつ飞 現が誘導される遺伝子として発見された。 IFI16遺伝子は、主に細胞の増殖抑制や細 胞分ィ匕等に関連する転写因子とされている。
[0030] 本発明者は、シ ーダレン症候群患者血清を用いた SEREX法、ならびに健常人も しくはシ ーグレン症候群以外の自己免疫疾患患者 (RA又は SLE)より得た多検体の 血清を用いた血清学的スクリーニングを行い、 IFI16タンパク質に対する自己抗体が シ ーダレン症候群患者血清中で高頻度に検出されることを見出した (図 2参照)。
[0031] さらに、抗 IFI16抗体、及び既にシエーダレン症候群の診断マーカーとして臨床応 用されて 、る抗 SS-B/La抗体にっ 、て、多検体のシエーダレン症候群患者血清にお ける陽性率と特異性について検索したところ、どちらの自己抗体も高い陽性率を示し 、且つシエーダレン症候群患者血清では双方、あるいはいずれか一方の自己抗体が 必ず検出された (図 3参照)。
[0032] 従って、従来の抗 SS-B/La抗体検査と抗 IFI16抗体検査を組み合わせて実施するこ とは、シエーダレン症候群の診断において疾患の見落としを防ぎ、診断の確実性を 格段に高めるものと考えられる。
(ii)配列番号 6に記載の配列を有する遺伝子 (KLHL12)
配列番号 6に記載の塩基配列を含む遺伝子について公知のデータベースにて相 同検索を行ったところ、 KLHL12遺伝子と同定された。 KLHL12は、そのアミノ酸配列 の一次構造上にタンパク質の分子間結合に関与するとされる BTB/POZ domainを有 することから、 kelch-like proteinと称される遺伝子ファミリーに属すると考えられる。 (iii)配列番号 7に記載の配列を有する遺伝子 (KLHL7)
配列番号 7に記載の塩基配列を含む遺伝子について公知のデータベースにて相 同検索を行ったところ、 KLHL7遺伝子と同定された。 KLHL7は、そのアミノ酸配列の 一次構造上にタンパク質の分子間結合に関与するとされる BTB/POZ domainを有す ることから、 kelch-like proteinと称される遺伝子ファミリーに属すると考えられる。
[0033] 図 2より、抗 KLHL12抗体と抗 KLHL7抗体はいずれもシ ーダレン症候群患者血清 で特異的に検出され、且つ健常者や慢性関節リウマチ患者 (RA)、全身性エリテマト 一デス (SLE)患者の血清中では全く検出されないことから、シエーダレン症候群に対 する強い特異性が示唆された。従って、血清中より抗 KLHL12抗体と抗 KLHL7抗体 の両方、あるいはいずれか一方が検出される患者は、シヱーダレン症候群である可 能性が極めて高いと言える。
[0034] (2)ェピトープ
本発明においてェピトープとは、通常 6〜20個程度のアミノ酸配列力 なり、抗体が 認識して結合することが可能な特定の構造単位を指す。また、本発明においてェピト ープ含有フラグメントとは、該ェピトープを 1又は複数個含むタンパク質の断片を指す
[0035] 既に公開されて 、る解析ソフト BIMAS (http://bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/) 及び SYFPEITHI (http://syipeithi.bmi-heidelberg.com/Scripts/MHCServer.dll/Epit ope Prediction.htm)を使用して、シエーダレン症候群における新規自己抗原と考えら れる IFI16、 KLHL12及び KLHL7のェピトープにつ!/、て解析した結果をそれぞれ表 II、 III及び IVに示す。各自己抗原遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列につい て、結合する HLAの種類ごとに推定される結合性の高さをスコア (Score)によって示し た。 HLA (Human Leukocyte Antigen)への結合性について高いスコアを有するぺプ チド配列は、 HLAに結合して抗原提示される可能性が高 、ェピトープと推定される。 なお、各表には、スコアの値力 ¾IMASを用いた解析で 100以上、 SYFPEITHIを用いた 解析で 25以上のアミノ酸配列のみを表す。
[0036] IFI16、 KLHL12及び KLHL7以外の 11種の新規なシ ーダレン症候群関連自己抗 原についても同様にェピトープを推定できる。
[0037] 表 IIには、 IFI16について解析を行った結果を示す。また、表 IIに記載のペプチドの アミノ酸配列は、表の上力 順に配列番号 33 94として示される。
[0038] [表 6]
表 H
η-ΜΓ$ ぺプチドの y ノ8^¾ 1 鬮 tttf位 スコ Accession No.
A2402 9 DYLEYDSLL 263 360.000 BIMAS NM.005531 33
NYVCRNGFL 578 300.000 B1 AS NM.005531 34
10 EYDKIQIADL 42 200.000 BIMAS NM— 005531 35
DYHFRMVKSL 19 200.000 BIMAS NM— 005531 36
A0201 9 KLQLFCFRL 361 1647.896 BIMAS NM_005531 37
VLNATESFV 526 650.311 BIMAS N .005531 38
KIFEDIPTL 67 358.702 BIMAS NM— 005531 39
KIIAIA YV 572 184.095 BIMAS NM— 005531 40
VLLKGLEVI 9 27 SYFPEITHI NM.005531 41
SLL5NDLKL 27 27 SYFPEITHI NM.005531 42
10 MVLNATESFV 525 210.538 BIMAS NM— 005531 43
KLISEMHSFI 377 200.831 BIMAS NM.005531 44
KMNDFMRMQI 451 108.124 BIMAS NM— 005531 45
YLEYDSLLEV 264 27 SYFPEITHI NM 005531 46
A26 9 DTISKMNDF 447 30 SYFPEITHI NM.005531 47
EDIPTLEDL 70 27 SYFPEITHI NM.005531 48
SVTPKINQL 614 27 SYFPEITHI NM.005531 49
EVPNKIINR 289 26 SYFPEITHI 一 005531 50
EVWHGRLN 659 25 Hi SYFPEITHI NM— 005531 51
B5101 8 TPK IIAI 569 26 SYFPEITHI NM_005531 52
DAGLGKLI 59 25 SYFPEITHI NM.005531 53
SASVTPKI 612 25 SYFPEITHI NM 005531 54
9 FPGPFMTSI 467 520.000 BIMAS NM— 005531 55
YPFTLVADV 589 520.000 BIMAS NM.005531 56
IPCEEGDKL 35 143.000 BIMAS NM— 005531 57
SAQSDLKEV 516 121.000 BIMAS NM— 005531 58
VGTGQCHNI 346 114.400 BIMAS NM— 005531 59
10 DAGLGKLIKI 59 440.000 BIMAS NM_005531 60
SPAPSTSSTV 106 242.000 BIMAS N _005531 61
NPKTVAKCQV 184 242.000 BIMAS NM— 005531 62
EAGPNQTFEV 281 200.000 BIMAS NM_005531 63
VATENEVFRV 548 143.000 BtMAS NM.005531 64
VATQTQFFHV 233 130.000 BIMAS NM.005531 65
HATVATENEV 545 121.000 BtMAS NM.005531 66
TPSSSFLTTL 491 12T.000 BIMAS NM一 005531 67
RAKETLKIDI 297 121.000 BIMAS NM.005531 6 &
QASGNIVYGV 310 121.000 BIMAS NM— 005531 69
APKSGNTGEL 685 100.000 BIMAS NM_005531 70
B5201 9 TQFFHVKVL 237 110.000 BIMAS NM— 005531 71
10 AGLGKLIKIF 60 110.000 BIMAS NM 005531 72
D RBI +0401 15 DYHFRMVKSLLSNDL 19 28 SYFPEITHI NM.005531 73
GLEVINDYHFRMVKS 13 26 SYFPEITHI NM.005531 74
FRMVKSLLSNDLKLN 22 26 SYFPEITHI NM— 005531 75
RPVIVKVLSTTKPFE 203 26 SYFPEITHI NM— 005531 76
FFHVKVLNTSLKEKF 239 26 SYFPEITHI NM.005531 77
MSKLISEMHSFIQIK 375 26 SYFPEITHI MM— 005531 78
ISEMHSFIQIKKKTN 379 26 SYFPEITHI NM-005531 79
ISKMNDFMRMQILKE 449 26 SYFPEITHI NM— 005531 80
PEEVSIEDSAQSDLK 508 26 SYFPEITHI NM— 005531 81
VADVNADRNMEIPKG 594 26 SYFPEITHI NM— 005531 82
TPKINQLCSQTKGSF 616 26 SYFPEITHI NM.005531 83
TGKMEVWHGRLNTI 655 26 SYFPEITHI NM— 005531 84
TGELRSVIHSHIKVI 691 26 SYFPEITHI NM— 005531 85
HSHIKVIKTRKNKKD 699 26 SYFPEITHI NM.005531 86
KDILNPDSSMETSPD 712 26 SYFPEITHI NM_005531 87
DRB1*1101 15 TLKIDILHKQASGNI 301 26 SYFPEITHI NM— 005531 ae
GKKYKNIVLLKGLEV 2 25 SYFPEITHI NM.005531 89
TGKMEVWHGRLNTI 655 25 SYFPEITHI NM.005531 90
DRB1* 15 GKLIKIFEDIPTLED 63 30 SYFPEITHI NM.005531 91
ISEMHSFIQIKKKTN 379 30 SYFPEITHI NM.005531 92
ISKMNDFMRMQILKE 449 30 SYFPEITHI NM— 005531 93
FLEVYPFTLVADVNA 585 26 SYFPEITHI NM.005531 94
[0039] 表 IIIには、 KLHL12について解析を行った結果を示す。また、表 IIIに記載のぺプチ ドのアミノ酸配列は、表の上から順に配列番号 95〜190として示される。
[0040] [表 7]
表 I I I
HLA^B n-wrs ペプチドのァ Sノ ¾Wi ス 3ァ データペース Accmlon No.
A2402 10 IYCLGGYDGL 200. 000 BIMAS NM 021633
A0201 9 ALLNDHIYV 4B9 1415. 383 BIMAS NM 021633 96
SLPNLLQYV 214 879. 833 IMAS NM 021633
LLNDHIYW 470 457. 145 BIMAS NM 021633 98
TLCDVTLRV 31 285. 163 BIMAS NM 021633 99
SMTTPRCYV 505 276. 276 BI MAS NM 021633 100
VLRGRLYAI 517 27 SYFPEITHI NM 021633 101
SLHDRIYVI 326 26 SYFPEI THI NM 021633 102
10 ILLDFVYTET 86 288. 269 BIMAS NM 021633 103
LLTPRYITDV 226 271. 94 & BIMAS NM 021633 104
KLIKCDEIQV 181 243. 432 BIMAS NM 021633 105
ALLNDHIYW 469 242. 674 BIMAS NM 021633 106
RLGANEVLLV 276 1 59. 970 BIMAS NM 021633 107
ELSEKGKPYV 65 1 17. 630 B IMAS NM 021633 108
LLSQGEVEKL 173 28 SYFPEITHI NM 021633 109
LLPAACLLQL 106 27 SYFPEITHI NM 021633 n o
AIAGYDGNSL 524 27 SYFPEITHI NM 021633 i n
A26 9 EVLLWGGF 281 33 SYFPEITHI NM 021633 112
GVIYCLGGY 426 29 SYFPEITHI NM 021633 1 13
ESLPNLLQY 213 28 SYFPEITHI NM 021633 1 14
VTVENVQEL 98 27 SYFPEITHI NM 021633 115
DRIYVIGGY 329 27 SYFPEITHI NM 021633
STMEILLDF 82 26 SYFPEITHI NM 021633 117
EWTSMGTQ S48 26 SYFPE I THI NM 021633 118
EVFSQKHFP 】55 25 SYFPE ITHI NM 021633 119
EVEKLIKCD 178 25 SYFPE I THI NM 021633 120
DWEKYDPK 297 25 SYFPE ITHI NM 021633 121
LWASGVIY 421 25 SYFPE ITHI NM 021633 122
DHIYWGGF 473 25 SYFPE ITHI NM 021633 123
10 EWQHEEFIL 164 32 SYFPEITHI NM 021633 124
ETVHVTVENV 94 26 SYFPE ITHI NM 021633 125
EESLPNLLQY 212 26 SYFPEITHI NM 021633 126
EW SMGTQR 548 26 SYFPEITHI NM 021633 127
EVFSQKHFPE 155 25 SYFPEITHI NM 021633 128
DWEKYDPKT 297 25 SYFPEITHI NM 021633 129
Β5Ί01 8 DPSMCLGI 131 25 SYFPE ITHI NM 021633 130
9 MPLLTP YI 224 629.200 BIMAS NM 021633
TPRYITDVI 228 440.000 B IMAS NM 021633 132
DPIIDS EV 541 440.000 BIMAS NM 021633
GATTLGDMI 373 ZOO.000 BIMAS NM 021633 1 4
DGNSLLSSI 529 176.000 BIMAS NM 021633 135
LPAACLLQL 107 143.000 BI MAS NM 021633 136
GA EVLLW 278 133. 100 BIMAS NM 021633 137
KPYVDIQGL 71 133. 100 BIMAS NM 021633 138
APMNVRRGL 363 121. 000 BI MAS NM 021633 139
TAREGAGLV 414 121. 000 BIMAS NM 021633 140
LGGYDGLNI 431 104. 000 BIMAS NM 021633 141
GANEVLLW 278 27 SYFPE ITHI NM 021633 142
10 DPIIDSWEW 541 532. 400 BI MAS NM 021633 143
DPHTGHW NV 447 400. 000 BIMAS NM 021633 144
VASVSLHDRI 322 286. 000 BIMAS NM 021633 145
TPRCYVGATV 50& 242. 000 BI MAS NM 021633 146
DPNIDQWSML 4D0 220. 000 BI MAS NM 021633 147
DP TQEWSFL 303 200. 000 BI MAS NM 0Z1633 148 GGFGSQQSPI 287 193. 600 BI MAS NM 021633 1 9
MATKRSGAGV 459 157. 300 BIMAS NM 021633 150
MGGIMAPKDI 1 138. 424 BIMAS NM 021633 151
VALLNDHIYV 468 130.000 BIMAS NM 021633 152
AACLLQLKGV 109 121.000 BIMAS NM 021633 153
TAREGAGLW 414 121. 000 BIMAS NM 021633
GAGLWASGV 418 110. 000 BIMAS NM 021 G33 155
DAEPFIRCSL 237 110. 000 BIMAS NM 021 E33 156
[0041] [表 8] 表 III (つづき)
B5201 9 SQKHFPEW 158 165.000 BIMAS NM 021633 157
SQQSPIDW 291 100.000 BIMAS NM 021633 158
10 AGLWASGVI 419 198.000 BIMAS NM 021633 159
LGANEVLLW 277 165.000 BIMAS NM 021633 160
DPIIDSWEW 541 132.000 BIMAS NM 021633 161
DRB1*0401 15 HEEFILLSQGEVEKL 168 28 SYFPEITHI NM 021633 162
EPVFEAVINWVKHAK 194 28 SYFPEITHI NM 021633 163
TDS TTV SMTTPRC 497 28 SYFPEITHI NM 021633 164
IDSWEWTSMGTQRC 544 28 SYFPEITHI NM 021633 165
EILLDFVYTETVHVT 85 26 SYFPEITHI NM 021633 166
EAVIN VKHAKKERE 198 26 SYFPEITHI NM 021633 167
KFHLRPELRSQMQGP 257 26 SYFPEITHI NM 021633 168
LLWGGFGSQQSPID 283 26 SYFPEITHI NM 021633 169
YDGLNILNSVEKYDP 434 26 SYFPEITHI NM 021633 170
DRB1*1501 15 IYCLGGYDGLNILNS 428 34 SYFPEITHI NM 021633 171
LPNLLQYVRMPLLTP 215 30 SYFPEITHI NM 021633 172
LSSIECYDPIIDSWE 534 30 SYFPEITHI NM 0Z1633 173
DPIIDSWEWTSMGT 541 30 SYFPEITHI NM 021633 174
LLWGGFGSQQSPID 283 28 SYFPEITHI NM 021633 175
IDWEKYDPKTQEWS 296 28 SYFPEITHI NM 021633 176
IYVIGGYDGRSRLSS 331 28 SYFPEITHI NM 021633 177
LNSVEKYDPHTGH T 440 28 SYFPEITHI NM 021633 178
IYWGGFDGTAHLSS 475 28 SYFPEITHI NM 021633 179
LYAIAGYDGNSLLSS 522 28 SYFPEITHI NM 021633 180
DPNIDQWSMLGDMQT 400 26 SYFPEITHI NM 021633 181
DRBH1101 15 QSPIDWEKYDPKTQ 293 27 SYFPEITHI NM 021633 182
LNILNSVEKYDPHTG 437 26 SYFPEITHI NM 021633 183
DRB1翻 1 15 QWSMLGDMQTAREGA 405 29 SYFPEITHI NM 021633 184
CDEIQVDSEEPVFEA 185 27 SYFPEITHI NM 021633 185
FPEWQHEEFILLSQ 162 26 SYFPEITHI NM 021633 186
LPNLLQYVRMPLLTP 215 26 SYFPEITHI NM 021633 187
RDLVDEAKKFHLRPE 249 26 SYFPEITHI NM 021633 188
YAIAGYDGNSLLSSI 523 26 SYFPEITHI NM 021633 189
YVIGGYDGRSRLSSV 332 25 SYFPEITHI NM 021633 190
[0042] 表 IVには、 KLHL7につ 、て解析を行った結果を示す。また、表 IVに記載のぺプチ ドのアミノ酸配列は、表の上力 順に配列番号 191〜211として示される。
[0043] [表 9]
表 IV
HLA分平型 n-«ers ペプチドの 7¾ノ BSE列 開 位 スコ 7 "一夕ペース Accession No. s列
A0201 9 KLLAGFMGV 25 1711.327 BIMAS AF111113 191
TLCDVILMV 42 655.875 BIMAS AF11i113 192
10 MLESKSFEV 76 4419,713 BIMAS AF111113 193
SLPECGMLFT 156 386.498 BIMAS AF111113 194
KLAAREEAKL 17 27 SYFPEITHI AF111113 195
A26 9 DIIEQLVEF 93 30 SYFPEITHI AF111113 196
DVILMVQER 45 26 SYFPEITHI AF111113 197
B5101 91 532.400 BIMAS AF111113 198
101 286.000 BIMAS AF111113 199 149 133.100 BIMAS AF111113 200
10 LPECGMLFTV 157 314.600 BIMAS AF111113 201
DAEPDIIEQL 89 133.100 BIMAS AF111113 202
AANQYQIEPV 120 121.000 BIMAS AF111113 203
B5201 9 KQKTLCDVI 39 200.000 BIMAS AF111113 204
DRB 1*0401 15 RWLAAASHFFNLMF 59 26 SYFPEITHI AF111113 205
EQLVEFAYTARISVN 96 26 SYFPEITHI AF11in3 206
VQSLLDAANQYQIEP 114 26 SYFPEITHI AF111113 207
QSLLDAANQYQIEPV 115 26 SYFPEITHI AF111113 208
DRB1*1501 15 AKLLAGFMGVM NMR 24 34 SYFPEITHI AF111113 209
DRB 1*0301 15 EK LAAREEAKLLAG 15 27 SYFPEITHI AF111113 210
PDIIEQLVEFAYTAR 92 25 SYFPEITHI AF111113 211 [0044] (3)ペプチド及びリコンビナントタンパク質の作製
上記したシエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子によってコードされるタンパク質 、或いはそのタンパク質のアミノ酸配列に由来するペプチド配列に基づき、シヱーグ レン症候群関連自己抗原のペプチド又はリコンビナントタンパク質を作製することが 可能である。ペプチド又はリコンビナントタンパク質の作製方法としては、公知の方法 を適用することができる。
[0045] 例えば、配列表に表される任意の抗原遺伝子につ!ヽて、その塩基配列の全長、又 は該塩基配列を含む DNA断片を発現ベクターのプロモーター下流に挿入し、組み 換え体ベクターを作製する。次に、この組み換え体ベクターを適合する宿主細胞に 遺伝子導入する。その後、組み換え体ベクターを導入した細胞を適切な条件下で培 養し、該細胞によって産生されたペプチド又はリコンビナントタンパク質を宿主細胞か ら単離'精製することによって、上記のペプチド又はリコンビナントタンパク質を得るこ とがでさる。
[0046] 宿主細胞としては、細菌 (大腸菌等)、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等、 目 的の遺伝子を発現できるものであれば、いずれでもよい。また、発現ベクターには公 知のものを使用することができ、特に限定されない。組み換え体ベクターの遺伝子導 入の方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクト口ポレーシヨン法 、マイクロインジェクション法、コンビテント細胞法、プロトプラスト法等、公知の方法を 用いることができる。また、組み換え体ベクターは原核生物中で自立複製が可能であ り、本発明のシエーダレン症候群関連自己抗原のペプチド又はタンパク質をコードす る DNAを転写できる位置にプロモーターを有して!/、るものであればよ!、。
[0047] 単離'精製する方法としては、当業者によって通常使用される方法を用いることがで き、例えば、陰イオンクロマトグラフィー法、陽イオンクロマトグラフィー法、疎水性クロ マトグラフィ一法、ゲル濾過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、等電点電気泳動 法等が挙げられる。これらの単離 ·精製方法を単独又は組み合わせて用いることがで きる。
[0048] 上記の方法の他に、 Fmoc法 (フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法)、 tBoc法 (t ブチルォキシカルボニル法)等の化学合成法によってもペプチド合成することができ る。また、アドバンスト'ケムテック (Advanced ChemTech)社、パーキン 'エルマ一 (Perki n Elmer)社、フアルマシア (Pharmacia)社、プロテイン 'テクノロジ^ ~ ·インスツルメン KPr otein technology Instrument)社、シンセセノレ一ベガ (SyntheceU— Vega)社、ノ ーセプテ イブ (PerS印 teive)社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して得ることもできる。
[0049] 組換えペプチド又はリコンビナントタンパク質を用いて被検者の血清、血漿唾液等 の体液又は体液成分中のシエーダレン症候群関連自己抗原に対する抗体の有無を 確認する場合は、あらかじめ大腸菌成分等の宿主細胞成分を被検者の血清等と反 応させておき、宿主細胞成分と反応し得る抗体を除去しておくことが好ま 、。
[0050] (4)診断キット
前述の (3)に記載の方法で得られたペプチド又はリコンビナントタンパク質を、以下 に説明する診断キットの形態で利用することができる。
[0051] 本発明の診断キットは、シエーダレン症候群関連自己抗原を適切な容器、榭脂、膜 、フィルム等の担体に含まれる形態、又はこれらの担体に固定される形態で使用され 得る。担体としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン—ジビニルベン ゼン共重合体、スチレン 無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビュルアルコー ル、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタタリレート 等の合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体 (セフアデックス等)、ァガロースゲ ル (セファロース、バイオゲル等)、セルロース (濾紙、ペーパーディスク等)等の多糖類 、ガラス、シリカゲル、シリコーン等の無機高分子化合物が挙げられる。
[0052] 担体の形状は、平板状 (マイクロタイタープレート、ディスク等)、粒子状 (ビーズ等)、 管状 (試験管)、繊維状、膜状、微粒子状 (ラテックス粒子等)、カプセル状、小包体状 等、特に限定されず、測定方法に応じて適宜選択することができる。
[0053] 検出を行う際、 96穴マイクロタイタープレートを用いれば、一度に多種類の抗原或 いは多検体の血清と反応させることができる。また、 96穴マイクロタイタープレートを利 用して、配列番号 1〜14の塩基配列によってコードされる複数種のシヱーダレン症候 群関連自己抗原ペプチド又はリコンビナントタンパク質を、必要に応じて SS-A/Ro及 び Z又は SS-B/Laによりコードされる自己抗原 (抗原と結合可能なフラグメントを含む )とともにパネルイ匕し、本発明の診断キットとして用いることが可能である。 [0054] 担体と抗原を結合させる方法としては、従来公知の方法を利用すればよぐ例えば 、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法等が挙げられる。固定された 抗原との非特異的結合を防止するため、ゼラチン、 BSA等のブロッキング剤でブロッ キング処理することが好まし!/、。
[0055] (5)診断方法
本発明の診断キットを用いてシヱーダレン症候群の自己抗体を検出する方法には 、担体に含まれるか、又は固定された配列番号 1〜14のうち任意の塩基配列によって コードされるポリペプチド或いはその断片を、必要に応じて SS-A/Ro及び Z又は SS- B/Laによりコードされる自己抗原 (抗原と結合可能なフラグメントを含む）とともに、シ エーダレン症候群が疑われる患者 (被検者)のサンプルと反応させる工程が含まれる。 ここで、被検者のサンプルとは、例えば、血液、涙、唾液等の体液及び該体液に由来 する血清、或いは血漿等の体液成分が挙げられる。本発明の診断における自己抗 体の検出には、採血による血液検査が一般的且つ簡便であることから、血清を用い ることが好ましい。
[0056] 反応の条件及び検出の条件等は、当業者に公知の条件が適用される。検出方法と しては、 ELISA法、沈降反応法、凝集反応法、ウェスタンブロッテイング法、 RIA法等 が挙げられる。
[0057] 例えば、 ELISA法を用いた場合、適切に希釈した被検者の血清と抗原を 96穴マイク ロタイタ一プレートで反応させ、洗浄後、標識化した 2次抗体と反応させる。 2次抗体 の標識には、西洋ヮサビペルォキシダーゼ (horseradish peroxidase),アルカリフォス ファターゼ (alkaline phosphatase), βガラクトシダーゼ（ β - galactosidase)等の従来公 知の酵素を使用することができる。その後、 2次抗体を標識した酵素に対応する基質 ( 西洋ヮサビペルォキシダーゼ： DAB等、アルカリフォスファターゼ： p- NPP等、 j8ガラク トシダーゼ :X- gal等)をカ卩えて発色させ、マイクロプレートリーダー等の分光器によつ て被検者の血清中の自己抗体を検出し、定量することができる。
[0058] 配列番号 1〜14の塩基配列によってコードされる抗原タンパク質の少なくとも 1種（ 抗原と結合可能なフラグメントを含む）を、必要に応じて SS-A/Ro及び Z又は SS-B/L aによりコードされる抗原タンパク質 (抗原と結合可能なフラグメントを含む）とともに結 合させた担体を用いて被検者血清中の自己抗体の有無を調べることで、確度の高い シエーダレン症候群の診断が可能となる。また、抗原を複数種組み合わせて診断に 用いる場合は、既にシエーダレン症候群の診断に臨床応用されている SS-A/Ro (配 列番号 31)及び SS-B/La (配列番号 32)等の公知の抗原と組み合わせてもよい。被検 者の血清等の体液又は体液成分中の自己抗体の検出は、抗原を単独で用いて行つ ても良いが、診断の精度を高めるためには複数種の抗原を組み合わせて用いること が好ましい。
[0059] 本発明の好ましい実施態様の 1つとして、本発明の診断キットを用いてシエーダレン 症候群の診断を行う場合、該キットに含まれる担体に結合する抗原として、配列番号 4の塩基配列を含む遺伝子にコードされる抗原 (IFI16)及び SS-B/La抗原 (配列番号 3 2) (全長タンパク質或いは少なくとも 1つのェピトープを含む抗体により認識可能なそ のフラグメントを含む）を組み合わせて用いることができる。この抗原の組み合わせに おいて、 IFI16及び SS- B/Laの両方、或いはいずれか一方が陽性反応を示した場合 にシエーダレン症候群であると診断される。ここで、陽性反応とは、患者血清中に各 自己抗原に対する自己抗体が存在していることを意味し、 ELISA法においては標識 ィ匕 2次抗体の発色における陽性反応によって示される。
[0060] また、本発明の他の実施態様として、 KLHL12及び KLHL7の遺伝子にコードされる 抗原 (全長又は断片）を組み合わせて用いることもできる。これらの抗原は、シエーグ レン症候群に対する特異性が高 、抗原の組み合わせとなるため、 KLHL12及び KLH L7の両方、或いは KLHL12又は KLHL7の!、ずれかが陽性反応を示した場合にシェ 一ダレン症候群であると診断することができる。
[0061] また、本発明の診断キットに加えて、生検 (例えば口唇小唾液腺組織、涙腺組織等 の採取)、眼科検査 (例えばローズベンガル試験、シヤーマー試験等)、唾液分泌量の 測定、唾液腺シンチグラフィ一等の従来用いられて ヽる診断方法を組み合わせて診 断を行ってもよい。
[0062] (6)アンタゴニストペプチド
表 II〜IV (配列番号 33〜211)のいずれかに示される各アミノ酸配列の改変体を用い て、アンタゴニストペプチドを作製することが可能である。アンタゴニストペプチドは、 MHC分子に結合し、極めて低 、濃度で T細胞の膜表面上に発現する TCRの野生型 ( ポリ)ペプチド (例えば、配列番号 20、 22、 23等に記載されるアミノ酸配列を含むポリべ プチド等)に対する応答のみを特異的に抑制する。アミノ酸配列の改変には公知の方 法を適用することができ、例えば、 Yael Katz-Levy et al.， PNAS., 90: 7000-7004, 19 93. ; Yael Katz-Levy et al.， PNAS., 94: 3200-3205, 1997.等に記載の方法を参考に 得ることができる。また、上記 (2)に記載したィ匕学合成法やペプチド合成機を用いる方 法等を利用してもよい。ここで、表 II〜IV (配列番号 33〜211)のアミノ酸配列の改変と は、任意のアミノ酸の置換、欠失、付加及びそれらの組み合わせ等を指し、なかでも 任意のアミノ酸によって置換されて 、るものが好まし 、。配列番号 33〜211に表される アミノ酸配列に基づいて改変されたポリペプチドのなかから、 Chen Y.Z. et al.， J. Imm unol., 157: 3783-3790, 1996.等に記載の方法を参考に、アンタゴニストペプチドを得 ることがでさる。
[0063] アンタゴ-ストペプチドが MHC分子に結合すると、 T細胞はこのアンタゴ-ストぺプ チドを認識する力 野生型ペプチドとアミノ酸配列がわずかに異なるためにシグナル が伝達されず、活性化されない状態 (ァナジ一)に陥る。その結果、 自己免疫反応が 誘導されず、 自己免疫疾患の症状を軽減又は発症を抑制することが可能とされてい る。従って、表 II〜IVに示されるアミノ酸配列に基づいて得られるアンタゴニストぺプ チドは、シエーダレン症候群の予防又は治療剤として有用であると考えられる。
[0064] 該アンタゴニストペプチドは 1種のみを使用してもよいが、好ましくは 2種以上のアン タゴニストペプチドを組み合わせたカクテルとして使用することができる。例えば、シェ 一ダレン症候群に特異的であって、自己抗体陽性のシ グレン症候群患者が多い抗 原タンパク質が複数存在する場合、複数の抗原蛋白に対する各々のアンタゴニスト ペプチドを組み合わせたカクテルを使用するのが好ましい。
[0065] 上記のアンタゴニストペプチドを有効成分とするシヱーダレン症候群の予防又は治 療剤を使用する場合、該アンタゴ-ストペプチドの少なくとも 1種をそのまま、又は薬 学的に許容される担体及び Z又は希釈剤と共に投与することができる。薬学的に許 容される担体としては、該アンタゴニストペプチドの効果を損なわな 、ものであれば特 に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン等があげられ、希釈剤としては、例えば、 生理食塩水 (PBS)、蒸留水等が挙げられる。製剤の形態も特に限定されず、凍結乾 燥したもの、顆粒剤、液剤等にして用いてもよい。また、公知の賦形剤、安定化剤、 保存剤等を添加してもよい。さらに、該アンタゴニストペプチドを MHC分子と混和して 投与してもよい。混和される MHC分子としては、上記 (2)に記載したィ匕学合成法ゃぺ プチド合成機を用いる方法等を利用して作製した既存のものを用いてもょ 、。
[0066] 上記したアンタゴニストペプチドを有効成分とするシヱーダレン症候群の予防又は 治療剤としての投与量は、本発明のアンタゴ-ストペプチドを成人 1人あたり 1回の投 与について 0.001〜1000mg程度、好ましくは 0.01〜100mg程度となるように投与するこ とができる力 この範囲に限定されるものではない。
実施例
[0067] 以下、本発明をさらに詳しく説明するために実施例を挙げるが、本発明は、これら の実施例に限定されない。
実施例 1
本実施例で用いた試料を、以下のように調製した。
[0068] (1)血清
平成 13年に文部科学省、厚生労働省、経済産業省の三省カゝら共同で告示された「 ヒトゲノム'遺伝子解析研究に関する倫理指針」を遵守し、試料提供者よりインフォ一 ムドコンセントを得て、シエーダレン症候群 (SjS)、慢性関節リウマチ (RA)、全身性エリ テマトーデス (SLE)と診断された患者、ならびに健常者 (HC)の血清を収集し、使用し た。
[0069] (2)細胞および組織由来 total RNA
ヒト正常大唾液腺 (耳下腺、顎下腺、舌下腺)組織由来 total RNAは、頸部郭清術を 受けた口腔癌患者の外科切除組織よりインフォームドコンセントを得て採取し、 4M G uanidine Thiocyanate溶液で組織を溶解して回収し、グァ-ジン—塩化セシウム超遠 、法 (1列 ば、 Molecularし loning. A laboratory manual. Second edition. J. Sambrook, E. F. Frits ch, T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.参照)にて t otal RNAを抽出した。
[0070] ヒト正常精巣組織由来 total RNAは BioChain Institute, Inc. (Hayward, CA, USA)よ り購入した c
[0071] ヒト口腔扁平上皮癌細胞株 HSQ89 (BioResource Center, Tsukuba, Japan)は DME M + 10% FBSを培地として、 5% CO
2、 37°C条件下にて培養した。増殖後、 4M Guanid ine Thiocyanate溶液で細胞を溶解して回収し、グァ-ジン—塩化セシウム超遠心法 にて total RNAを抽出した。
[0072] (3) cDNA発現ライブラリーの作製
それぞれの total RNAをァガロースゲル電気泳動にて質的に確認後、 mRNA purific ation kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)を用 ヽ飞各 600 μ gあ るいは 1200 gの total RNAより mRNAを精製した。制限酵素 Xho Iサイトを含むリンカ 一プライマーと methylnucleotide mixture (10mM dATP, lOmM dGTP, lOmM dTTP, 5 mM 5- methyl dCTP)を用いて、各 5 μ gの mRNAより first- strand cDNAを合成した。逆 転写酵素は StrataScript RT (Stratagene, La Jolla, CA, USA)を使用し、 42°Cで 1時間 反応させて伸長効率を高めた。次に、得られた反応産物の mRNAを Rnase H (Stratag ene)で破壊後、 DNA polymerase I(Stratagene)を加え、 16°Cで 2.5時間反応させて sec ond- strand cDNAを合成した（Stratagene)。合成した cDNAは Pfo DNA polymerase (S tratagene)を使用して末端平滑化後に、 Eco RIサイトを含むアダプターを T4 DNA lig ase (Stratagene)を用いて 8°Cでー晚、アダプタ一'ライゲーシヨンを行った。接続した アダプターの末端には Eco RIサイトが突出しているが、リン酸ィ匕されていないため、 T 4 polynucleotide kinase (Stratagene)をカ卩えリン酸化処理を行った。
[0073] 得られた二本鎖 cDNAを Xho I (Promega, Heidelberg, Germany)で酵素処理後、約 4 00bp以下の短い cDNAの除去と完全長 cDNAの濃縮のために、 CROMA SPIN-400 ( Clontech, Palo Alto, CA, USA)を用いたゲル濾過法で cDNAを分画した。分画した c DNAfま Pico Green ds cDNA Quantitation reagents (Molecular Probes, Eugene, Ore gon, USA)を用いて定量後、 T4 DNA ligase (Stratagene)を用いて各 lOOngの cDNAを 1 μ gの ZAP express vector (Stratagene)に 12°Cにてー晚、ライゲーシヨンを行った。さら に、ライゲーシヨン後、 Gigapack III Gold (Stratagene)を用いてファージへ in vitroパッ ケージンクし、ファージ 'ライブラリーを完成させた。得られたファージ 'ライブラリーを N ZY培地（Sigma, St. Louis, MO, USA)で増幅させ、力価を計測後、クロ口ホルムをカロ え 4°Cで保存した。
[0074] (4)大腸菌の調整
XL1- Blue MRF'細胞及び XLOLR細胞を LB—テトラサイクリンァガープレート (Becto n Dickinson, Sparks, MD, USA)に 37°Cでー晚、画線培養し、単一コロニーを得た。 X Ll-Blue MRF'細胞には 20ml LB/MgSO /マルトース培地 (Becton Dickinson)を、 XLO
4
LR細胞には 20ml NZY培地 (Sigma)を用いて 30°Cでー晚、培養した。培養後の懸濁液 を遠心して菌体を回収し、 10mlの 10mM MgSOにて溶解 (OD600値 = 1.0)して 4°Cで
4
保存した。
[0075] (5)血清中に含まれる抗大腸菌/ファージ抗体の吸収除去 (Adsorption) 0.22 μ m 滅菌フィルター (Millipore, Bedford, MA, USA)にて濾過した各血清 5mlを TBS緩衝溶 液 (10mM Tris-HCl pH 8.0, 150mM NaCl)で 5倍に希釈後、血清中に含まれている抗 バクテリア抗体及び抗ファージ抗体を除去するため、 Y1090/Y1089/XL-1 blue Lysat e及び Y1090/ λ gtl l Lysate (BioDynamics Laboratory Inc., Tokyo, Japan)を充 し た PD- 10カラム (Amersham Biosciences)を 5回通過させた。スクリーニング時には、該 希釈溶液を最終希釈率 100倍にて使用した。
[0076] (6) cDNA発現クローニング
上記 (3)で作成したファージ 'ライブラリーを XLl-Blue MRF'細胞に感染させ、 NZYト ップアガー (Sigma)および 1Mイソプロピル- β - D-チォガラタトピラノシド (IPTG; Sigma) と混合後、濃度 5 X 104プラーク/ 150mmプレートで NZYァガープレートに 6枚ずっプレ 一ティングした。 37°Cで 6〜8時間培養し、プラークの出現を確認した後、ニトロセル口 ースメンブレン (Protean BA85; Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)をゲル表面に 密着させ、さらに 37°Cで一晩、培養を続けた。
[0077] 培養終了後、各メンブレンを 0.05% Tween20含有 TBS緩衝溶液で洗浄し、 5% NFDM
(Non-fat dried milk; Snow Brand Milk Products Co., Ltd., Tokyo, Japan)を用 ヽて至 温にて 1時間ブロッキングした。次に、 100倍希釈したシエーダレン症候群患者血清を 5% BSA (Sigma)でプレ 'コーティングしたディッシュに入れ、メンブレンを 4°Cでー晚、 インキュベートした (一次抗体反応)。メンブレンを洗浄後、 Peroxidase- conjugated Affi niPure Goat Anti-Human Ig , vc y Fragment Specinc (Jackson immunoResearcn La boratory Inc., Baltimore Pike, PA, USA)を 1000倍希釈し、室温で 1時間反応させた（ 二次抗体反 J"心)。発色は DAB (3, 3'— diaminobenzidine, tetrahydrochloride； Dojindo, K umamoto, Japan)を使用し、超純水で発色反応を停止させた。
[0078] 陽性クローン (発色反応があったクローン)をパスツールピペットにて単離し、 500 μ 1 の SM緩衝溶液 (350mM Tris- HC1 pH 7.5, 1M NaCl, lOOmM MgSO , 0.01% gelatin)
4
内で溶解させ、 4°Cにて保存した (一次スクリーニング)。溶解させた陽性クローン由来 ファージを濃度 1 X 102プラーク/ 100mmプレートでプレーティングし、前述の操作を繰 り返して、単一の陽性クローンを単離した (二次及び三次スクリーニング)。
[0079] (7)陽性クローンの塩基配列の決定
各単一陽'性クローンについては、 ExAssist interference-resistant helper phage及び XLOLR細胞を用いた in vivo excisionによって pBK-CMVファージミドベクターに転換 せた。 mRNA purification kit (Amersnam Pharmacia Biotecn, Piscataway, NJ, UbA) による mRNAの精製後から in vivo excisionまでの工程は、 ZAP Express cDNA synthe sis kit and ZAP Express cDNA uigapack III Cold Cloning kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA)の説明書に従った。
[0080] プラスミド DNAを QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いて 精製後、制限酵素 Eco RI及び Xho I (Promega)で切断し、ァガロースゲル電気泳動 にてプラスミド内のインサート cDNAの有無やサイズなどを確認した。異なるインサート cDNAを含むプラスミドクローンについては、 DYEnamic ET Terminator Cycle Sequen cing Kitを用いた cycle sequence reaction (30サイクル； Amersham Biosciences)後、 A utoSeq G-50 (Amersham Biosciences)にてスピンカラム精製し、 ABI PRISM 310 Gene tic Analyzer Automated Sequencer (Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA)で塩基酉己列を 決定した。決定された各配列は、 DNASISソフトウェアプログラム（Hitachi, Yokohama, Japan)及び NCBI BLASTデータベース（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/)を 使って遺伝子解析した。
[0081] 各 cDNAライブラリーより SEREX法によって単離 ·同定されたシエーダレン症候群関 連自己抗原遺伝子群を表 Vに、また、その代表的な陽性所見を図 1に示す。
[0082] [表 10] 表 V
遣伝子名 ク Iコーン数 Accession No. cDNAの位置 遺伝子座位 機能 参考文献
Human tr or salivary gland Ubrarf
SS-B La 6 NM_003142 31 - 1635 2q31.1 RNA-binding protein SturgessA. D.， et al.， Immunol., 140: 3212-3218, 1988.
Human testis library
SS-B La 4 NM_003142 16 - 1633 2q31.1 RNA-binding protein SturgessA. D.， et al., Immunol., 140: 3212-3218, 1988.
DR1 3 NM_021979 743 - 3222 1ρ22.1 TATA box-binding protein Inostroza J. A.， et al., Ceil, 70: 477-489, 1992.
KLHL7 3 AF111113 7pl5.3 unknown -
EFI16 2 NM— 005531 963 - 2709 lq22 member of the HIN-200 family Trapani J.ん, et ?\.,Immunogenetics, 36: 369-3763 1992.
RANBP2L1 2 NM— 005054 2ql2.3 RAN-binding protein Nothwang H. G， et al., Genomics, 47: 383-392, 1998.
EIF4G2 1 NM— 001418 2484 - 3820 llpl5 translation initiation factor Imataka H„ et al, Embo J„ 16: 817-825, 1997.
SDCCAG1 1 NM一 004713 2673 - 4121 14q22 cancer antigen Scanlan M. J., et a]., Int. J. Cancer., 76: 652-658, 1998.
SP100 1 NM—003113 679 - 1461 2q37.1 nuclear antigen Szostecki C" et al.， J. Immunol, 145: 4338-4347, 1990.
Human oral squamous cell carcinoma line HSQ89 library
SS-B/La 20 NM— 003142 251 - 1653 2q31.1 RNA-binding protein SturgessA. D., et al., Immunol., 140: 3212-321S, 1988.
PSIP1 8 NM— 02U44 14 - 1677 9p22.2 transcription co-activator Ge H.， et A,，EmboJ.， 17: 6723-6729， 1998.
DR1 6 NM一 021979 707 - 3222 lp22.1 TATA box-binding protein Inostroza J. A., et al, Cell, 70: 477-489, 1992.
PMS1 6 NM—000534 516 - 2879 2q31.1 DNA mismatch repair protein Papadopoulos N.， et alr Science, 263: 1625-1629, 1 94.
EIF4G2 4 NM— 001418 2484 - 3820 llpl5 translation initiation factor Imataka H.， et al., Embo J" 16: 817-825, 1997.
SS-A/Ro 3 NM一 004600 188 - 2366 lq31 RNA-binding prolein Deutschcr S. L.， ct al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 85: 9479-9483, 198£
DBT 2 NM一 001918 17 - 3368 lp31 dihydroiipoamide branched chain transacylase Lau, K. S" et
Figure imgf000024_0001
Biophys.Acta., 1132: 319-321, 1992.
RANBP2L1 2 NM— 005054 3320- 7163 2ql2.3 RAN-binding protein Nothwang H. G, et al., Genomics, 47: 383-392, 1998.
KLHL7 2 AF111113 180 - 923 7pl5.3 unknown -
TFG 2 NM一 006070 20 - 1966 3qll-ql2 TRK-fiised gene Mencinger M„ et a]., Genomics, 41: 327-331, 1997.
KLHL12 1 NM— 021633 221 - 3323 lq31.3 unknown -
D FZP564B1023 1 NM— 031306 223 - 1752 lq31.3 unknown -
KIAA0261 1 XM一 290471 211 - 2693 10q23.3l unknown -
N4BP2 1 N _018177 3040 - 5475 4pl4 BC1^3 binding protein, Nedd4 binding protein MuriUas R.， et al., Biol. Chem" 277: 2897-2907, 2002.
RUFY1 i NM 02515S 903 - 2620 5q35.3 Eik binding protein Yang J., et a . Biol. Chem., 277: 30219-30226, 2002.
SDCCAG1 1 NM— 004713 14q22 cancer antigen Scanlan M. J., et al.f Ini, J. Cancer., 76： 652-658, L998.
SLK 1 NM— 014720 2734 - 5625 10q25.1 serine/threonine kinase Sabourin L A., et al., Mot. Cell Biol., 20: 684-696, 2000.
TMF1 1 NM一 007114 1395 - 3282 3p21-pl2 TATA element modulatory factor Garcia J. A.， et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA,, 89: 9372-9376, 1992.
VCIP135 1 丽 025054 1910 - 4500 8ql3 essential factor for p97/947-mediated membrane fusion Uchiyama, K.， et al.， Cell Biol., 159: 855-866， 2002.
[0083] (8)多検体の被検者血清を用 、た血清学的スクリ一ユング
得られた抗原遺伝子については、シエーダレン症候群 (SjS) 30例、健常者 (HC) 12 例、慢性関節リウマチ (RA) 15例、及び全身性エリテマトーデス (SLE) 15例の患者血 清を用いた血清学的スクリーニングによる絞り込みと選別を進め、既知 ·未知を含め 最終的に有用と考えられる計 16種のシエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子の cD NA配列を特定することに成功した。
[0084] 図 2は、 SjS、 HC、 RA、 SLEの被検者血清中における各遺伝子群に対する自己抗体 の陽性頻度を示す。
[0085] 図 3は、シエーダレン症候群の各患者血清を用いたスクリーニング結果における、 IF 116抗原及び SS-B/La抗原に対する抗体の陽性頻度につ 、て示したものである。
[0086] 図 3に示されるように、血清中における IFI16抗原及び SS-B/La抗原に対する自己 抗体の有無にっ 、て検査することで、シ ーダレン症候群の患者を 100%の確率で 診断することが可能である。
[0087] (9)単離 ·同定されたシ ーダレン症候群関連自己抗原遺伝子の発現分布
HSQ89、精巣、舌下腺、耳下腺、及び顎下腺の RNAは上記 (2)に記載の方法で得 られたもの、脾臓、肝臓、腎臓、脾臓、肺、及び筋肉の RNAは BioChain Institute, Inc. (Hayward, CA, USA)から購入したものをそれぞれ使用し、 Molecular Cloning. A labo ratory manual, second edition. J. bambrook, E. F. Frits ch, T. Maniatis. し old Spring Harbor Laboratory Press. 1989.に記載の方法に従って、ノザンブロット解析を行った
[0088] 得られたシエーダレン症候群関連自己抗原遺伝子の多くは、シエーダレン症候群 にお ヽて臓器特異的な炎症ならびに組織破壊の好発部位となる唾液腺 (舌下腺、耳 下腺及び顎下腺)にお 、て発現が増大して 、ることから、これらシエーダレン症候群 関連自己抗原遺伝子によって産生されるタンパク質が臓器特異的な自己抗原である ことが示された。ノザンブロット解析の結果を、図 4に示す。
配列表フリーテキスト
[0089] 配列番号 33〜211は、ェピトープのアミノ酸配列である。

Claims

請求の範囲
以下の 14個の遺伝子
[表 1]
Figure imgf000026_0001
からなる群力も選ばれる少なくとも 1種の遺伝子によりコードされるタンパク質或いは そのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントと、必要に応じて
以下の 2種の遺伝子：
[表 2]
Figure imgf000026_0002
力もなる群力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子によりコードされるタンパク質或いは そのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントを含む、シエーダレン症候群診断用キ ッ卜。
[2] 少なくとも IFI16 (NM 005531)遺伝子によりコードされるタンパク質或いはそのェピトー プ又はェピトープ含有フラグメントを含む、請求項 1に記載のキット。
[3] IFI16 (NM 005531)遺伝子と SS- B/La(NM 003142)遺伝子によりコードされるタンパ ク質或 、はそのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントを含む、請求項 1に記載の キット。
少なくとも 1種の前記遺伝子によりコードされるタンパク質或いはそのェピトープ又は ェピトープ含有フラグメントを担体に固定ィ匕または結合させて含む、請求項 1に記載 のキット。
以下の 14個の遺伝子
[表 3]
Figure imgf000027_0001
からなる群力も選ばれる少なくとも 1種の遺伝子によりコードされるタンパク質或いは そのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントを、必要に応じて
以下の 2種の遺伝子：
[表 4]
Figure imgf000027_0002
力もなる群力 選ばれる少なくとも 1種の遺伝子によりコードされるタンパク質或いは そのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントと組み合わせて被検者のサンプルと 反応させて、これら遺伝子によりコードされる少なくとも 1種のタンパク質に対する被検 者の自己抗体を検出する工程を包含する、シエーダレン症候群の診断方法。 [6] 少なくとも IFI16 (NM 005531)遺伝子によりコードされるタンパク質或いはそのェピトー プ又はェピトープ含有フラグメントを被検者のサンプルと反応させて、該遺伝子により コードされるタンパク質に対する被検者の自己抗体を検出する工程を包含する、請 求項 5に記載のシエーダレン症候群の診断方法。
[7] IFI16 (NM 005531)遺伝子と SS- B/La(NM 003142)遺伝子によりコードされるタンパ ク質或いはそのェピトープ又はェピトープ含有フラグメントを被検者のサンプルと反 応させて、これら遺伝子によりコードされるタンパク質に対する被検者の自己抗体を 検出する工程を包含する、請求項 5に記載のシ ーダレン症候群の診断方法。
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