JP2021019606A - 治療用分子を選択する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮出願番号62/112,058号(2015年2月4日出願)、米国仮出願番号62/156,684号(2015年5月4日出願)および米国仮出願番号62/279,610号(2016年1月15日出願)の利益を請求するPCT出願であり、これらの全ては、引用によりその全体をここに包含させる。
本出願において提供される電子的に提供した配列表(名称:3338.035PC03 SL.txt、サイズ:339,610バイト;および作成日:2016年2月4日)を、引用によりその全体をここに包含させる。
本発明は、毒性副作用が低減した治療用分子を選択する方法に関する。本方法は、インビトロまたはインシリコで、実験動物への投与前に分子をスクリーニングするために使用でき、または本方法は、インビボで実験動物に使用できる。
特異的に標的化された治療剤の分野で、ある治療用分子は、タンパク質との非特異的相互作用、望まない免疫応答刺激または組織への蓄積によるような、毒性副作用を引き起こす。対象への治療用分子の投与時の重要な懸念の一つは、分子の潜在的神経毒性である。神経毒性分子への暴露は、脳および末梢神経系の損傷をもたらし、長期的生理学的問題の原因となり得る。したがって、投与したとき、治療用分子が所望の疾患または障害の処置に有効であるだけでなく、許容される毒性、例えば神経毒性も有することが重要である。
本発明は、分子と接触している神経細胞におけるインビトロ細胞内遊離カルシウム濃度の振動(“カルシウム振動”)を測定することを含む、分子のインビボ急性神経毒性を試験または決定する方法を提供する。
E1. 分子と接触している神経細胞におけるインビトロカルシウム振動を測定することを含む、分子のインビボ急性神経毒性を試験または決定する方法。
I. 定義
単数表現で記載するものは、1以上のそのものを意味することを注意すべきである;例えば、“分子”は、1以上の分子を表すと理解される。したがって、単数表現、“1以上”および“少なくとも1”は、ここでは相互交換可能に使用できる。
本発明は、分子のある特徴の測定による、分子の毒性(例えば、インビボ急性神経毒性)を試験または決定する方法を提供する。本発明はまた、毒性副作用が低減した分子を選択する方法も提供する。このような方法は、分子の毒性試験中における不必要な動物の死亡を減少させ、そして/または、分子がインビボ投与において安全である可能性を向上させることに資する。本方法はまた、インビボ急性神経毒性を示さない分子の選択のためのスクリーニング時間を削減することによる、候補分子評価期間の効率改善(すなわち、短縮)もし得る。本方法は、毒性がより低いまたは低減された分子の同定を含む。例えば、分子が、低毒性(例えば、インビボ急性神経毒性)であるかどうかを決定するためにアッセイでき、そして低毒性であることが判明したなら、当該分子が、さらなる試験または哺乳動物のような対象への投与に使用するために選択される。ある態様において、分子が低毒性であることが判明したなら、それは、当該分子のさらなる試験のために実験動物に投与される。
ある態様において、分子の毒性、例えば、インビボ急性神経毒性を、分子と接触しているまたは接触していた神経細胞における、インビトロ細胞内遊離カルシウム振動(カルシウム振動)の測定により試験する。カルシウム振動を測定するアッセイの例を、下にさらに詳細に記載する。ある態様において、分子は、対照細胞におけるカルシウム振動と比較して、該分子に曝された細胞におけるカルシウム振動を有意に低減させないならば、分子は許容される毒性(例えば、インビボ急性神経毒性)を有すると考えられる。ある態様において、対照細胞は、試験分子に曝されていないが、他の点は、試験分子に曝されている細胞と同じ状態下にある、細胞である。ある態様において、カルシウム振動アッセイは、陽性対照細胞(すなわち、非耐容レベルまでカルシウム振動を低減することが知られている分子に曝された細胞)または陰性対照細胞(すなわち、細胞におけるカルシウム振動に影響しないことが知られる分子に曝された細胞)を含むことができる。他の態様において、対照細胞を、試験分子を伴わない、試験分子を神経細胞の培養物に運搬する媒体、例えば、水、緩衝液または食塩水(すなわち、媒体対照)に曝す。
本発明はまた、ヌクレオチド配列を含む分子(例えば、ポリヌクレオチド)のインビボ神経毒性を試験または決定する方法にも関する。ある態様において、方法は、式(I)
他の態様において、本発明はまた、インビボ耐容性試験の実施による、耐容性のインビボ神経毒性を有する分子を選択または同定する方法にも関する。候補分子の数が少ないとき、インビボ耐容性試験は、インビボ神経毒性の直接的指標を提供できる。他の態様において、インビボ耐容性試験をカルシウム振動アッセイおよび/または配列スコア法と組み合わせて使用できる。インビボ耐容性試験を、カルシウム振動アッセイ実施および/または配列スコア計算後、小数の候補分子選択後にも使用できる。ある態様において、インビボ耐容性スコアを、分子の、哺乳動物、例えば、哺乳動物の脳に、例えば、側脳室内(ICV)投与または髄腔内(IT)投与により投与することにより測定する。
ある態様において、本発明の方法は、さらに、分子の長期インビボ毒性の測定を含む。例えば、長期毒性は、細胞が分子と接触したときの、分子による細胞におけるチューブリン強度の変化の測定により決定できる。ある態様において、チューブリン強度の変化を、カルシウム振動、配列スコアおよび/またはインビボ耐容性アッセイにおける変化の一方または両方と共に測定する。細胞におけるチューブリン強度の変化を測定するアッセイの例を下に提供する。ある態様において、分子は、上に定義した、分子に曝されていない細胞、すなわち、対照細胞のチューブリン強度の99%以上、98%以上、97%以上、96%以上、95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上または70%以上の、細胞におけるチューブリン強度を示す。ある態様において、試験分子に曝されていない細胞におけるチューブリン強度を、対照細胞におけるチューブリン強度と称する。ある態様において、分子は、媒体対照細胞におけるチューブリン強度の約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満または約1%未満低減させる。
本方法は、さらに、分子による動物の行動遂行の測定を含み得る。ある態様において、方法は行動試験スコアを含み、これは、分子を哺乳動物に投与し、哺乳動物の行動遂行を段階分けすることにより測定できる。ある態様において、行動試験は、短期記憶試験、空間学習および記憶試験、歩行分析試験またはこれらの任意の組み合わせである。ある態様において、行動遂行を、分子を哺乳動物、例えば、哺乳動物の脳に、例えば、側脳室内(ICV)または髄腔内(IT)投与により注射し、哺乳動物の行動遂行を0〜4のスケールに段階分けすることにより測定する。ある態様において、神経行動学的スコアは、総スコア3、総スコア2、総スコア1または総スコア0以下である。ある態様において、神経行動学的スコアを、下の実施例5に記載のとおり決定する。
本方法により選択した分子は、例えば、診断、治療および予防のための研究薬として利用できる。ある態様において、本発明は、分子を選択し、次いで該分子を使用する両者のための方法を提供する。
本発明によりスクリーニングまたは選択する分子は、治療用分子を含む。ある態様において、治療用分子は、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド(例えば、オリゴマー)、サッカライド、脂質、リポソームおよび粒子、生体材料、医薬品、ビタミン、核酸、アミノ酸、ポリペプチド、酵素補因子、ステロイド、炭水化物、ヘパリン、金属含有薬剤、受容体アンタゴニスト、受容体アゴニスト、受容体または受容体の一部、細胞外マトリクスタンパク質、細胞表面分子、抗原、ハプテン、小分子またはこれらの任意の組み合わせを含む。
ある態様において、本発明に有用な分子は、結合部位、例えば、抗体の抗原結合部分である、少なくとも一つの治療用分子を含む。ある態様において、ここに開示する方法のための分子はポリペプチドである。
ある他の態様において、本発明の治療用分子は、非免疫グロブリン結合分子に由来する1以上の結合部位を含む。ここで使用する用語“非免疫グロブリン結合分子”は、結合部位が、免疫グロブリン以外のポリペプチドに由来するが、所望の結合特異性を与えるように操作(例えば、変異誘発)できる、一部(例えば、スキャフォールドまたはフレームワーク)を含む、結合分子である。
他の面において、本発明の分子は、受容体のリガンド結合部位および/またはリガンドの受容体結合部分を含む。本発明の分子に存在し得る受容体またはリガンドの結合部分の例を、下に示す。
サイトカインは、リンパ球の増殖、分化および機能的活性化に多面的効果を有する。種々のサイトカインまたはその受容体結合部分を、治療用分子、結合部位および/またはドメインとして本発明の融合タンパク質に利用できる。例示的サイトカインは、インターロイキン(例えばIL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13およびIL−18)、コロニー刺激因子(CSF)(例えば顆粒球CSF(G−CSF)、顆粒球−マクロファージCSF(GM−CSF)および単球マクロファージCSF(M−CSF))、腫瘍壊死因子(TNF)アルファおよびベータ、細胞毒性Tリンパ球抗原4(CTLA−4)およびインターフェロン−α、βまたはγのようなインターフェロン(米国特許4,925,793号および4,929,554号)を含む。
接着分子は、細胞を互いに相互作用させる、膜結合タンパク質である。白血球ホーミング受容体および細胞接着分子またはその受容体結合部分を含む種々の接着タンパク質が、治療用分子、結合部位および/またはドメインとして、本発明の融合タンパク質に取り込まれ得る。白血球ホーミング受容体は、炎症中白血球細胞表面に発現され、細胞外マトリクス要素への結合に介在するβ−1インテグリン(例えばVLA−1、2、3、4、5および6)および血管内皮上の細胞接着分子(CAM)に結合するβ2−インテグリン(例えばLFA−1、LPAM−1、CR3およびCR4)を含む。例示的CAMは、ICAM−1、ICAM−2、VCAM−1およびMAdCAM−1を含む。他のCAMは、E−セレクチン、L−セレクチンおよびP−セレクチンを含むセレクチンファミリーのものを含む。
白血球の感染部位への遊走を刺激する走化性タンパク質であるケモカインも、本発明の融合タンパク質に取り込まれ得る。例示的ケモカインは、マクロファージ炎症性タンパク質(MIP−1−αおよびMIP−1−β)、好中球走化性因子およびRANTES(活性化正常T細胞における発現および分泌調節性)を含む。
本発明の融合タンパク質における治療部分として使用するための例示的成長ホルモンは、レニン、ヒト成長ホルモン(HGH;米国特許5,834,598)、N−メチオニルヒト成長ホルモン;ウシ成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン(PTH);甲状腺刺激ホルモン(TSH);チロキシン;プロインスリンおよびインスリン(米国特許5,157,021号および6,576,608号);濾胞刺激ホルモン(FSH);カルシトニン、黄体化ホルモン(LH)、レプチン、グルカゴン;ボンベシン;ソマトロピン;ミュラー管抑制物質;リラキシンおよびプロリラキシン;ゴナドトロピン関連ペプチド;プロラクチン;胎盤性ラクトゲン;OBタンパク質;またはミュラー管抑制物質を含む。
ある態様において、本発明のポリペプチドは、リガンドまたは受容体の結合部位(例えば受容体の細胞外ドメイン(ECD))と、少なくとも一つの遺伝子融合させたFc領域(すなわち、scFc領域)を組み合わせる。ある態様において、受容体のリガンド結合部分は、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの受容体(例えば、可溶性T細胞受容体、例えば、mTCR(登録商標)(Medigene AG, Munich, Germany)、上記TNF受容体スーパーファミリーの受容体(例えば、イムノアドヘシンの可溶性TNFα受容体)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)受容体ファミリーの受容体(例えば、GFRα3)、G−タンパク質共役受容体(GPCR)スーパーファミリーの受容体、チロシンキナーゼ(TK)受容体スーパーファミリーの受容体、リガンド開口型(LG)スーパーファミリーの受容体、ケモカイン受容体スーパーファミリーの受容体、IL−1/トール様受容体(TLR)スーパーファミリーおよびサイトカイン受容体スーパーファミリーから選択される受容体に由来する。
ある態様において、サイトカインと組み合わさったとき、第一βシグナル伝達要素と結合して、非機能的中間体を形成し、これが、次いで、第二βシグナル伝達要素と結合して、β受容体二量体化および結果としてのシグナル伝達を引き起こす、β特異性決定要素を利用するサイトカインに対するアンタゴニストを、本発明の方法を使用して製造できる。このような分子は文献に記載されている(例えば、米国特許6,927,044号参照)。一例において、受容体の可溶性特異性決定要素およびサイトカイン受容体の第一βシグナル伝達要素の細胞外ドメインを組み合わせて、非機能的複合体を形成するようにサイトカインに結合するヘテロ二量体を形成する。このようなヘテロ二量体受容体を使用して阻害できる例示的サイトカインは、IL1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−3、IL−4、IL−5、IL−11、IL−15、GMCSF、LIF、INFαおよびTGFβを含む。
本発明の分子はまたポリヌクレオチド(例えば、オリゴマー)を含み得る。ある態様において、ヌクレオチド配列は、上のセクションIII.A、III.BおよびIII.C.1−III.C.5に記載のいずれかのポリペプチドをコードする。ある態様において、ヌクレオチド配列は、上のセクションIII.A.、III.B.およびIII.C.1−III.C.5に開示した1以上のポリペプチドをコードする核酸配列(DNAまたはRNA、例えば、前mRNAまたはmRNA)と結合するまたはハイブリダイズする。ここでの用語“ヌクレオチド配列”は、2を超えるヌクレオチドが、配列として互いに連結している分子を意味する。ある態様において、本発明のヌクレオチド配列はDNAである。他の態様において、本発明のヌクレオチド配列はRNAである。他の態様において、本発明のヌクレオチド配列は、DNAとRNAの組み合わせである。さらなる他の態様において、本発明のヌクレオチド配列は、1以上の化学修飾ヌクレオチドを含む。さらに他の態様において、ヌクレオチド配列は、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも7ヌクレオチド、少なくとも8ヌクレオチド、少なくとも9ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチドまたは少なくとも11ヌクレオチド長を含む。他の態様において、ヌクレオチド配列は、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも30ヌクレオチド、少なくとも35ヌクレオチド、少なくとも40ヌクレオチド、少なくとも45ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも55ヌクレオチド、少なくとも60ヌクレオチド、少なくとも65ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも80ヌクレオチド、少なくとも90ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも700ヌクレオチド、少なくとも800ヌクレオチド、少なくとも900ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチドまたは少なくとも4000ヌクレオチドを含む。この点について、本発明のヌクレオチド配列は、一般に、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、神経細胞における、mRNAレベルの減少を経て、タンパク質の間接的阻害に影響し得る。あらゆるタイプのヌクレオチド配列を、本発明の方法を使用して分析できる。ある態様において、タンパク質として神経細胞において主に発現される前mRNAまたはmRNAを標的とするヌクレオチド配列を、ここに記載した特徴の選択のために分析する。本発明の方法により選択されたヌクレオチド配列により標的化され得る遺伝子の例は、微小管関連タンパク質タウ(MAPT遺伝子によりコード)、脳酸可溶性タンパク質1(BASP1遺伝子によりコード)またはアミロイド前駆体タンパク質(APP遺伝子によりコード)を含むが、これらに限定されない。ある態様において、本方法のヌクレオチド配列はオリゴマーである。
ある態様において、治療本発明で有用な分子はオリゴマーである。オリゴマーは、10〜50ヌクレオチド配列、例えば、計10〜30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む10〜30ヌクレオチド長を有する。
本発明の治療用分子を、医薬製剤および組成物において使用できる。好適には、このような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。
多数の分子(例えば、オリゴマー)を、MAPT前mRNAの3’UTRを標的とするように設計する。例えば、オリゴマーを、配列番号2のヌクレオチド134,821〜138,940および72,802〜73,072を標的とするように構築した。オリゴマーの例示的配列を図4、5および6に記載する。ある態様において、オリゴマーを、ギャップマーまたはミックスマーであるように設計した。同じ方法を、個々に開示する任意の他の配列に適用できる。ギャップマーを、LNA(大文字)、例えば、ベータ−デオキシLNAを5’末端および3’末端に含み、ホスホロチオエート主鎖を含むように構築したが、LNAを任意の他のヌクレオチドアナログに置換してよく、主鎖は他のタイプの主鎖(例えば、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合またはこれらの組み合わせ)であってよい。
初代皮質ニューロン自発的カルシウム振動を測定するために、ラット初代皮質ニューロンを、Sprague-Dawleyラット胚(E19)から調製した。細胞を、25,000細胞/ウェルで、384ウェルポリ−D−リシン被覆FLIPRプレート(Greiner Bio-One)に、B27添加物および2mM グルタミン含有25μl/ウェル神経基本培地にプレーティングした(インビトロ1日目、DIV1)。細胞を、11日間、37℃、5%CO2で増殖させ、25μlのさらなる培地を、インビトロ11日目(“DIV11”)の使用のために、インビトロ4日目(“DIV04”)およびインビトロ8日目(“DIV08”)に供給した。実験の日、培地をプレートから除去し、細胞を、50μl/ウェルの37℃アッセイ緩衝液(2mM CaCl2および10mM Hopes添加ハンクス平衡塩類溶液pH7.4)で1回洗浄した。振動を、1mM MgCl2存在下および非存在下で試験した(図1)。細胞に、細胞持続性蛍光カルシウム色素、fluo−4 AM(Life Technologies)を充填した。fluo−4 AMを、20%プルロニックF−127含有DMSO中、2.5mmで調製し、次いでアッセイ緩衝液で1:1000希釈した。細胞を、1時間、20μlの2.5μM fluo−4 AMと、37℃で5%CO2中インキュベートした。1時間後、20μlの室温アッセイ緩衝液を添加し、細胞を室温でさらに10分平衡化させ、蛍光イメージングプレート読取装置(FLIPR)に入れた。ベースラインシグナル(細胞内カルシウムの測定)を、100秒(1読み取り/秒)で読み、その後アンチセンスオリゴマーを添加した。オリゴマーを、75μMで20μlのアッセイ緩衝液中、FLIPR内の384ウェルヘッドに添加して、最終濃度25μMとした。オリゴマー添加後、FLIPRシグナルをさらに200秒(1読み取り/秒)読んだ。FLIPRの1秒での5分添加後プレート読み取り(300の1秒点)を実施して、さらなるデータ捕捉を可能とした。5分読み取りからの生データをエクスポートし、Excelを使用して、スパイク振幅および頻度を計算した。計算を、対照(非処理)ウェルに対する300秒読み取りにわたる平均FLIPRシグナルの測定により実施した。処理ウェルについて、シグナルが平均対照値の50%を超えて増加するところである各1秒読み取りにスコア1を与える、スコアリング・システムを開発した(上で計算)。スコア0を、平均対照値の50%未満の増加である各1秒読み取りに与えた。各処理について、総スコアを計算し、グラフ化目的で対照%に変換した。アンチセンスオリゴマーが、非処理細胞より大きなカルシウム振動応答を産生するならば、対照のパーセントが、100%より大きいとして表される(図4)。
カルシウム振動に対する小分子の効果を、実施例2に提供したのと実質的に同じ方法を使用して測定する。初代皮質ニューロン自発的カルシウム振動を測定するために、ラット初代皮質ニューロンを調製する。細胞をプレーティングし、適当な日数、使用のために増殖させる。実施例2に記載するとおり、初代神経細胞自発的カルシウム振動に対する小分子の効果を、先に記載のとおり2条件、1mM MgCl2存在下および非存在下で測定する(Murphy et.al., 1992, J. Neurosci. 12:4834-4845)。細胞に細胞持続性蛍光カルシウム色素を充填する。細胞をインキュベートし、蛍光強度測定のために室温で平衡化させる。生データをエキスポートし、スパイク振幅および頻度を計算する。
カルシウム振動に対する、抗体またはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、サイトカイン、細胞表面受容体、ホルモンまたは増殖因子のような治療タンパク質の効果を、実施例2に提供したのと実質的に同じ方法を使用して測定する。初代皮質神経細胞自発的カルシウム振動を測定するために、ラット初代皮質神経細胞を調製する。細胞をプレーティングし、適当な日数、使用のために増殖させる。実施例2に記載するとおり、初代神経細胞自発的カルシウム振動に対する治療タンパク質の効果を、先に記載のとおり2条件、1mM MgCl2存在下および非存在下で測定する(Murphy et.al., 1992, J. Neurosci. 12:4834-4845)。細胞に細胞持続性蛍光カルシウム色素を充填する。細胞をインキュベートし、蛍光強度測定のために室温で平衡化させる。生データをエキスポートし、スパイク振幅および頻度を計算する。
各オリゴマーの配列スコアを、オリゴマーの適性を予測するために計算した。配列スコアは、全オリゴマーについて決定された数学的計算であり、あるオリゴマー配列内のGおよびCヌクレオチドまたはそのアナログの%に基づく。次の式を、配列スコアの計算のために全オリゴマーに適用した。
オリゴマーのインビボ耐容性を、オリゴマーが動物に注射されたときどの程度態様されるかを見ることにより試験した。
オリゴマーのインビボ耐容性を、マウスおよびラットで試験した。タウqPCRおよび行動試験用の動物は、成熟C57Bl/6J雌マウス(20〜30g;Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)であり、ケージあたり3〜4匹で飼育した。動物を、一定温度(21±2℃)および湿度(50±10%)に維持し、1日12時間明るい(0600時に点灯)飼育室に維持した。いくつかの例で、タウプロモーターにより駆動されるH1ハプロタイプ(Polydoro et. al., J. Neurosci. (2009) 29(34): 10741-9)であるヒトPAC由来タウ導入遺伝子を発現し、天然マウスタウ遺伝子が欠失された、雄および雌トランスジェニックマウス(30〜40g)を、薬力学的エンドポイントおよび組織薬物濃度評価に使用した。髄腔内点滴試験について、雌Sprague-Dawleyラット(試験時180〜225g;Harlan)を、一定温度(21±2℃)および湿度(50±10%)に維持し、1日12時間明るい(0600時に点灯)飼育室に一匹ずつ飼育した。全ての動物は、試験中餌および水を自由に摂取していた。行動試験を、0700時〜1500時の間に実施した。動物を、ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー動物実験委員会のガイドラインおよびアメリカ国立衛生研究所発行の“Guide for Care and Use of Laboratory Animals”に従い扱った。実験プロトコールは、ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー動物実験委員会により承認された。
オリゴマーを、側脳室内(i.c.v.)注射または髄腔内注射によりマウスに投与した。側脳室内注射は、HaleyおよびMcCormickの方法に従い、27ゲージまたは30ゲージ針を付けたHamiltonマイクロシリンジを使用して実施した。針に、脳への穿通を制限するために、先端から2.5mmの所にポリエチレンガードを付けた。マウスをイソフルラン麻酔剤(1.5〜4%)を使用して麻酔した。20〜30g体重の注射するマウスを、首の後のたるんだ皮膚を、片手の親指と人差し指で持った。その後、穏やかな、しかし、確かな圧をかけて、動物の頭を堅い平らな表面に押しつけることにより固定した。次いで、針先端を頭皮および頭蓋を通して、前頂から約1mm外側かつ1mm尾側に挿入した。針を設置したら、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、食塩水媒体中5μl体積で与え、右(または左)側脳室に20〜30秒かけて注射した。針を、抜く前10秒その場に置いた。この手技は、外科手術または切開を必要としなかった。動物を、この手技から回復するまで、加温パッドの上で温めた。投薬後、例えば、投薬後1週間〜16週間の複数の時点で、それぞれ薬物濃度分析およびタウqPCRのために、脳組織(右、前頭野領域)をドライアイス上にまたはRNAlaterに集めた。
アンチセンスオリゴヌクレオチドICVまたはITの1回注射後1時間について、動物の行動的副作用を観察し、0(副作用無し)〜20(屠殺せざるを得ない痙攣)のスケールで副作用の重症度を採点した。耐容性スケールを5神経神経行動学的カテゴリーに分けた:1)活動亢進、2)活動低下および覚醒、3)運動機能障害/失調、4)体位および呼吸異常および5)振戦/痙攣。各カテゴリーを0〜4のスケールで採点し、可能性のある最悪の総スコア20であった。動物を飼育ケージでの行動の変化について観察し、その後飼育ケージから握力および正向反射の測定を含むより詳細な観察のために移した。
短期認識記憶を、新奇物体認識(NOR)課題を使用して測定した。NOR試験は、齧歯類が、馴染みのあるものよりも、新奇物体を探索する自発的行動に基づく(Dodart et. al., Neuroreport (1997) 8(5): 1173-8; Ennaceur and Delacour, Behav. Brain Res. (1988) 31 (1):47-59)。訓練(T1)と試験(T2)セッションの間の1時間保持間隔後、訓練セッションで物体を覚えていたマウスは、試験セッションでの新奇物体への優先性を示す。これらの実験について、動物を3日間扱い、試験セッション前日にチャンバー(48cm×38cm×20cm)に慣らした。チャンバーはポリエチレン製であり、ビニールの床張りで内張りされていた。試験日、動物を四角形試験チャンバーに入れ、2つの同一物質(7.6cm高×5.1cm幅)を15分訓練期間に探索させた。1時間後、マウスを10分試験セッションのために試験チャンバーに戻し、この間は、訓練中に探索していた1物体および1新奇物体を用いた。訓練セッションと試験セッション間および被験間に物体を25%エタノールで徹底的に洗浄し、1日の終わりに弱い洗剤で再び洗浄した。物体探索は、動物の鼻がその物体を指したときのみ考慮した。探索を、ObjectScanトラッキングソフトウェア(Cleversys, Reston, VA)を使用して記録した。データを、物体の探索に費やした時間の%として記録する(すなわち、新奇時間/新奇+馴染み時間×100)。
空間学習および記憶を、モリス水迷路アッセイに基づき評価した(Morris J. Neurosci. (1984) 11(1):47-60)。水迷路は、120cm直径のプールを指す。水を白色、非毒性テンペラ絵の具を使用して不透明にした(20℃±1)。プールを、異なる迷路外手がかりで囲んだ。
キャットウォーク(Noldus, Netherlands)は、複数の静的および動的歩行パラメータの客観的定量化を可能にする自動化およびコンピューター化歩行分析技術である。マウスをキャットウォークの一端に置き、3分または5回の遵守試験を受けるかのいずれか早いほうまで、自由に探索させた。データをエクスポートし、キャットウォークソフトウェアを使用して分類した。分類した試験の平均をデータ分析に使用した。目的の尺度は、プリント位置後または足の位置と、先の同側前足の設置の間の距離、初期および終点の2つのスタンス、足揺れ速度および足形または一歩の間に足がガラスプレートに接する時間を含むが、これらに限定されない。
全行動試験の統計的分析を、GraphPad Prism(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)を使用して実施した。NORについて、データを、群内分析のための対応のあるt検定を使用して、または、群間分析のためのANOVAと続くダネット事後検定により分析。MWMについて、反復MWM ANOVAを、取得段階の分析に使用し、一元配置分散分析と続くダネット事後を、プローブテスト分析に使用した。
上記アッセイに基づき決定したオリゴマーのインビボ急性耐容性を図5に示す。100μgのオリゴマーICV注射後のインビボ累積的耐容性閾値を4と設定する。
MAPTトランスクリプトの3’UTRを標的とするオリゴマーを、導入遺伝子含有バクミドとしてヒトMAPT遺伝子全体を発現するマウス初代神経細胞におけるタウ・タンパク質(C57-bl6 BAC-Tg hTau;Polydoro et. al., J. Neurosci. (2009) 29 (34): 10747-9)を減少させる能力について試験した。初代hTauマウス胚性前脳神経細胞培養物は、マウスタウをノックアウトしたため、内在性マウスタウを発現しない。初代神経細胞を、製造業者のプロトコルに従うパパイン消化により産生した(Worthington Biochemical Corporation, LK0031050)。簡潔に言うと、前脳を、マウスMAPTヌルバックグラウンドで全ヒト微小管関連タンパク質タウ(MAPT)遺伝子を発現するhTauマウスE18 BAC−Tg胚から切断し、37℃で30〜45分、パパイン/DNase/アール平衡塩類溶液(EBSS)中でインキュベートした。細胞ペレットの粉砕および遠心分離後、プロテアーゼ阻害剤、ウシ血清アルブミン(BSA)およびDNase含有EBSSで反応wお停止させた。細胞を粉砕し、2%B−27、100μg/ml ペニシリン、85μg/ml ストレプトマイシンおよび0.5mM グルタミン添加Neurobasal(NB、Invitrogen)で洗浄した。細胞を、添加NB媒体中、15,000細胞/ウェルでポリ−D−リシン被覆96ウェル光学造影プレート(BD Biosciences)に播種した。
選択したオリゴマーの性質を表1に示す。これらの基準を基に、あるオリゴマーをさらなるインビトロおよびインビボ用量応答試験に選択した。
Claims (20)
- 分子と接触している神経細胞におけるインビトロカルシウム振動を測定することを含む、該分子のインビボ急性神経毒性を試験または決定する方法。
- 分子と接触している神経細胞におけるカルシウム振動が媒体対照細胞におけるカルシウム振動と比較して約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上、約100%以上、約120%以上、約140%以上、約160%以上、約180%以上、約200%以上、約220%以上、約240%以上または約250%以上である、請求項1に記載の方法。
- 分子と接触している神経細胞におけるインビトロカルシウム振動の測定を含む、耐容性のインビボ急性神経毒性を有する分子を選択または同定する方法であって、該分子と接触している神経細胞が媒体対照細胞と同等またはそれより高いレベルのカルシウム振動を示す、方法。
- 分子と接触している神経細胞におけるカルシウム振動が媒体対照細胞におけるカルシウム振動と比較して約70%以上、約75%以上、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、約99%以上、約100%以上、約120%以上、約140%以上、約160%以上、約180%以上、約200%以上、約220%以上、約240%以上または約250%以上である、請求項3に記載の方法。
- 分子が小分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチドまたはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- カルシウム振動がAMPA受容体依存性カルシウム振動である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- カルシウム振動がMg2+イオンの存在下測定される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 分子がポリヌクレオチドを含み、配列スコアの計算をさらに含み、ここで、配列スコアを式(I)
- ポリヌクレオチドを含む分子のインビボ急性神経毒性を決定する方法であって、配列スコアの計算を含み、ここで、配列スコアを式(I)
- 式(I)
- 分子のインビボ耐容性の測定をさらに含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 耐容性カテゴリーが1)活動亢進;2)活動低下および覚醒;3)運動機能障害および/または失調;4)体位および呼吸異常;5)振戦および/または痙攣およびこれらの2以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 分子が0〜8の合計インビボ耐容性スコアを示す、請求項12に記載の方法。
- 分子の行動試験スコアの測定をさらに含む、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 行動試験が短期記憶試験、空間学習および記憶試験、歩行分析試験またはこれらの任意の組み合わせである、請求項14に記載の方法。
- 神経細胞の培養における分子のチューブリン強度の測定をさらに含む、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 分子が神経細胞の培養におけるチューブリン強度を約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満または約1%未満低減させる、請求項16に記載の方法。
- 分子を実験動物に投与したとき、20%を超える動物が生存する、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜18のいずれかに記載の方法により選択された分子。
- 請求項19に記載の分子を投与することを含む、疾患または状態を処置する方法。
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