JP2974760B2

JP2974760B2 - 家畜類種からの白血病阻止因子並びに胎児細胞の移殖及び増殖を促進するためのその用途

Info

Publication number: JP2974760B2
Application number: JP2501678A
Authority: JP
Inventors: ゴフ、ニコラス・マーチン; ウイルソン、トレイシー・アン; シーマーク、ロバート・フレデリック
Original assignee: AMURATSUDO CORP Ltd
Current assignee: AMURATSUDO CORP Ltd
Priority date: 1989-01-10
Filing date: 1990-01-09
Publication date: 1999-11-10
Anticipated expiration: 2014-11-10
Also published as: EP0453453A4; NZ232072A; US5418159A; EP0453453B1; DE69028514T2; WO1990008188A1; JPH04502554A; ATE142695T1; CA2045126A1; DE69028514D1; US5962321A; US5641676A; EP0453453A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般に家畜類種からの白血病阻止因子（LI
F）に関する。より詳しくは、本発明は家畜類種からのL
IFをコード化する遺伝子の同定、クローニング及び構造
特性化に関する。本発明は、又、哺乳動物の胚（embry
o）の発育の増進、及びイン・ビトロES細胞系の維持に
おける家畜類種からのLIFの用途に関する。

LIFは、既にエセリシア・コリ及び酵母細胞の両方か
ら、大量に、精製組換え形でクローンし、生成し、そし
て精製された蛋白である（国際特許出願番号、PCT/AU88
/00093）。LIFは、次の性質を有する因子として定義さ
れている： 1.白血病細胞の関連分化を伴う、骨髄性白血病細胞、例
えばM1細胞の増殖を抑止する能力、及び 2.M1細胞或いはネズミ又はヒトマクロファージの特異的
細胞レセプターに結合するのに適したネズミLIF又はヒ
トLIFの明らかにされた配列（国際特許出願番号、PCT/A
U88/0093で明らかにされた）を有する分子と競合する能
力。

ネズミ及びヒトLIFに対して既に開示された生物学的
性質に加えて、LIFは以下の付加的性質を有することが
判った。

（ａ）それは、フィーダー細胞の不存在下、イン・ビト
ロで多能性表現型のネズミ胚幹（embryonic stem;ES）
細胞系：国際特許出願番号PCT/AU89/00330に記載されて
いるD3及びEK−cs4（129/sv胚盤胎株から誘導された）
並びにCBL63及びHD5（C57BL/6胎盤胞から誘導された）
を維持する。

（ｂ）それは、胚環境内に再導入されたとき、LIFの存
在下イン・ビトロ継代後、前記ES細胞系がキメラマウス
の組織に貢献するようにする。

（ｃ）それは、ネズミES（EK−cs1及びD3）及び胚性癌
（embryonic carcinoma;EC）（PCC3−3A,F9,PCl₃,P19及
びMG2）細胞の高親和性レセプターへの選択的結合を示
す。

（ｄ）¹²⁵I−LIFの高親和性レセプターへの特異的結合
は、インシュリン、IGF−Ｉ、IGF−II、酸性及び塩基性
FGF、TGFB、TNFα、TNFβ、NGF、PDGF、EGF、IL−１、I
L−２、IL−４、GM−CSF、Ｇ−CSF、マルチCSF又はエリ
スロポイエチンと競合しないが、ネズミ又はヒトLIFと
競合する。

従って、LIFは、イン・ビトロ胎生学の一般的領域
で、例えばES細胞系の維持や胚移殖効率の増進と云った
有用性を持つ有効なホルモンであり、家畜類産業におい
て重要な適用性を有する。これは遺伝子導入動物の発育
ルートを提供するES細胞の使用において、特に明らかで
ある。

特にヒトにおける現在のイン・ビトロ受精（in vitro
fertilisation;IVF）及び胚移殖（embryo transfer;E
T）計画に関連する主要な困難は、受精胚の移殖につい
て「達成される」成功率の低いことである。最近、ヒト
IVF計画において、移殖率が10％という低さであるた
め、各処置で４個までの受精胚を用いることが行われて
いるが、その結果としてしばしば多生児を生ずる。従っ
て、ヒトIVF計画で移殖率を改良する必要がある。同様
に、家畜、例えばヒツジ、ウシ、ブタ及びヤギでのIVF
及びET処置で、移殖率を出来るだけ高くして、失った受
精胚や実施した不成功処理の数を減らすことが、経済的
理由から非常に望ましい。

哺乳動物胚の発育において、受精卵は、桑実胚及び胚
盤胞の段階を含む多数の段階を通過する。胚盤胞段階で
は、細胞は、（胎盤のプレカーサーである）栄養外胚葉
として知られる外側細胞層及び（胚そのものの全体が誘
導される）内細胞塊を形成する。胚盤胞は、それが「孵
化する」場合、その後で失くなる透明帯により囲まれて
いる。栄養外胚葉の細胞は、次いで移殖段階で、子宮壁
にぴったりと接触することが可能となる。嚢胚形成によ
り、内細胞塊による胚そのものの形成前、全細胞塊は
「前胚（pre−embryo）」と称しうる。

一つの種からのLIFは、例えば異なる又は異型の（het
erologous）種からのES細胞系を維持する場合に効果的
でありうるが、同一種から誘導されるLIF及びES細胞系
を使用している同種（homologous）系を発育させるのに
好ましいこともある。本発明によれば、ネズミLIF DNA
が、広範囲の哺乳動物ゲノムからのLIF遺伝子を同定す
るのに、又、家畜種類、例えばブタ及びヒツジからのLI
Fをコード化する遺伝子をクローンするのに用いること
ができ、従って、種々のイン・ビトロ胚形成手段の開発
に、例えば家畜類種におけるES細胞系及び胚移殖に用い
るためのLIF源を提供することが判明した。

さらに、LIFがイン・ビトロ胚培養培地に含まれる場
合、孵化工程が増進して、移殖と関連した発育変化によ
り、発育段階を終了する胚の数が上昇することも判明し
た。結果として、IVF及びET計画に対する移殖率は、イ
ン・ビトロ胚培養培地にLIFを使用することにより、有
意に改良できる。

従って、本発明の一つの態様は、ネズミLIFに対する
ヌクレオチドプローブにより交叉ハイブリッド形成によ
り検出できる家畜類種からのLIF遺伝子に関する。即
ち、第一核酸分子は、家畜類種白血病阻止因子をコード
化し、ネズミ白血病阻止因子又はその部分をコード化す
る第二核酸分子へのハイブリッド形成が可能なヌクレオ
チド配列を含む。

本明細書で使用される「ヌクレオチドプローブ」と
は、ハイブリッド形成技術、例えば、限定されるもので
はないが、サザン又はノーザンブロッティング又はコロ
ニィハイブリッド形成により相補配列を検出することが
可能なDNA又はRNA配列或いはそれらの組合せを意味す
る。プローブは、少数のヌクレオチド（例えば６−20）
から成っていてもよく、また、全遺伝子或いは遺伝子の
部分又は部分群でありうる。プローブは、検出可能な信
号（例えば放射活性アイソトープ）で標識化しうる。

「核酸」は、一つのヌクレオチド糖の３′位が隣のヌ
クレオチドの５′位にホスボジエステル結合により結合
している４又はそれ以上のヌクレオチドのポリマーを意
味する。本明細書で考慮される核酸は、直鎖状又は環状
の、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNAでありうる。

本明細書においては、「家畜類種」は、限定されるも
のではないが、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ロバなどを
含む最も一般的意味で用いられる。さらにより好ましく
は、家畜類種はヒツジ又はブタである。

「ハイブリッド形成」は、厳密さの適当な条件下、第
一及び第二の核酸の一本鎖間の塩基対の形成による二本
鎖の第三核酸を形成する能力を意味する。使用される厳
密な条件は、第一及び第二核酸分子の関連鎖間の相対類
似性に依存する。厳密さに適した便利な条件は、マニア
ティス等（1982）において、又は本明細書の非限定的実
施例の引用により見ることができる。

従って、核酸が二本鎖分子である場合、本発明は、ネ
ズミLIFの部分又は部分群をコード化する第二核酸の鎖
によりハイブリッド形成されることができるヌクレオチ
ド配列を、その一本鎖上に含む家畜類種白血病阻止因子
の部分又は部分群をコード化する第一核酸に関する。

本発明は、ネズミLIF又はその部分群をコード化する
第二核酸により例証されるけれども、非ネズミLIFをコ
ード化する異なる核酸であるが、しかしそれはネズミLI
F核酸にハイブリッド形成できるものを用いることが可
能である。従って、非ネズミLIF−コード化第二核酸の
使用は、該非ネズミLIF−コード化核酸が、ネズミLIF又
はその部分をコード化する該第二核酸によってハイブリ
ッド形成されうるならば、依然として本発明に含まれ
る。

本発明は、全長LIF分子をコード化する核酸或いはLIF
分子の部分又は部分群に及ぶ。従って、核酸は、哺乳動
物LIFの完全コード付け配列を表わすか或いは単一、又
は多数のヌクレオチド付加、削除及び／又は置換をもた
らしうるか、或いはLIF分子の部分、例えばＮ−末端又
はＣ−末端の部分を正に表わしうる。従って、LIF分子
の「部分群」は、LIF分子内に含まれる全ての一又はそ
れ以上の隣接している一連のアミノ酸群を含み、そして
さらに天然、化学及び／又は組換え誘導体を含む。

本発明の他の様相は、家畜類種又は完全に又は一部
で、該ヌクレオチド配列が完全に又は一部で、該LIFの
合成及び生成に導く能力を有する形で実質的に同様のそ
の類似体からLIFをコード化するヌクレオチド配列を含
む組換えDNA分子に関する。本発明のこの様相は、又、
クローニングベクター、例えばプラスミド及び発現ベク
ター及びその中に挿入されたかかる組換えDNA分子を有
する宿主細胞に及ぶ。さらに、本発明は、又、かかる組
換えDNA分子の発現により生成される、完全又は一部の
合成家畜類LIF或いは実質的に同様のその類似体に及
ぶ。

従って、本発明のこの様相は、一又はそれ以上の調整
的に働く部位に使用可能に結合される、上で定義した第
一核酸を含む組換えDNA又はRNA分子に係り、そして、適
当な宿主細胞中、必要な条件下、第一核酸が組換えLIF
生成物又はその誘導体又は一部に転写され、翻訳され
る。組換え体分子は、さらに、意図した宿主に適した複
製部位を含み、或いは一以上の宿主が使用された場合、
一以上の複製部位を含みうる。ベクター及び適当な宿主
は、この分野の当業者に既知であり、本明細書中の非限
定的実施例中、PCT/AU88/00093に、及びマニアチス等
（1982）に報告されている。

それゆえ、本発明は、組換え家畜類LIF、そして好ま
しくは、しかしこれに限定されないが、ヒツジ及びブタ
LIF或いはその誘導体又はそれらの一部に及ぶ。かかる
誘導体又はその一部は上述されているが、天然又は合成
家畜類LIF分子に或いは中での、単一又は多数のアミノ
酸置換、削除及び／又は付加を含む。好ましい組換えLI
Fに適した条件は、PCT/AU88/00093に開示されている
が、もちろん、これらの条件の変更及び／又は修飾は用
いる宿主細胞によって変えうる。かかる変更及び／又は
修飾は全て本発明の範囲内にある。宿主細胞は、真核
（例えば酵母、哺乳動物、植物等）細胞又は原核（例え
ばエシエリシア・コリ、バチルス・スペシーズ、シュー
ドモナス・スペシーズ等）でありうる。

本発明のさらに他の様相は、イン・ビトロ胎生学での
使用に適した組換え家畜類LIF源を提供する。従って、
本発明は、イン・ビトロ培養でES細胞系を保持し、一
方、多可能性表現型を維持する方法を意図するものであ
り、その方法は、ES細胞系を有効量の家畜類LIFを保持
するES細胞系とを適当な条件下、充分な時間接触させる
ことよりなる。

本発明のさらに他の様相は、哺乳動物胚の移殖段階ま
でのイン・ビトロ発育を増強する方法に係るものであ
り、その方法は、有効量の哺乳動物LIFを含有する培養
培地中、胚をイン・ビトロで培養する工程を含む。

LIFが孵化工程を増強して発育段階を終了する胚の数
を増加させることが見出されたので、好ましくは、LIF
が培養培地中に含まれる前に、前胚を胚盤胞（孵化後の
胚）の形成の段階に増殖させる。しかしながら、以下に
示すように、胚盤胞の形成前、又は胚盤胞の形成前と形
成後に、培養培地にLIFが含有することも、移殖と関連
した発育変化を受けることにより、発育段階を終了する
前胚の数を増加させる。結果として、IVF及びET計画に
関する移殖速度は、イン・ビトロ培養培地にLIFを使用
することにより、有意に改良される。

「哺乳動物胚」は、ヒト、反芻動物及び他の家畜類動
物を含むその最も広い意味に用いられる。本明細書で
は、本発明はネズミ胚の発育により例示されるが、本発
明は、ヒト、反芻動物及び動物、例えばヒツジ、ウシ、
ウマ、ロバ、ヤギ等を含む他の種の胚の発育におけるLI
Fの使用にも及ぶことが理解されるべきである。

本発明は、又、胚を、移殖前に、有効量の哺乳動物LI
Fを含む培養培地中、イン・ビトロで培養することを特
徴とする、哺乳動物胚のイン・ビトロ受精及び続く移殖
方法に及ぶ。

「哺乳動物LIF」は、ヒト、ネズミ、反芻動物及び他
の、又は家畜類LIF、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ヤ
ギ、ロバ及びウマ等からのものを含む。

図面において、図１は、実施例１に関する。ネズミcDNAプローブを用
いる交叉ハイブリッド形成による種々の哺乳動物種から
のDNAにおけるLIF遺伝子同族体の同定。

図２は、ブタLIF遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
クローンλPGLIF−E2から誘導された2.07kbpの配列に相
当し、ブタLIF遺伝子の成熟蛋白をコード化する２つの
エキソンをスパンしている（spanning）ブタLIF遺伝子
のmRNA同義鎖の２つの部分は、標準的手段に従って単一
文字コードを用い５′ないし３′に表示され、ここで、
Ａはデオキシアデノシン−５′−リン酸を示し、Ｃはデ
オキシシチジン−５′−リン酸を示し、Ｇはデオキシグ
アノシン−５′−リン酸を示し、そしてＴはデオキシチ
ミジン−５′−リン酸を示す。ネズミ、ヒト及びヒツジ
cDNA並びに遺伝子配列（国際出願番号PCT/AU88/00093）
と類似することにより明らかにされるブタLIF遺伝子の
２つのエキソンによりコード化されるアミノ酸配は遺伝
子配列の上に表示され、ここで、ALAはアラニン、ARGは
アルギニン、Asnはアスパラギン、ASPはアスパラギン
酸、CYCはシステイン、GLNはグルタミン、GLUはグルタ
ミン酸、GLYはグリシン、HISはヒスチジン、ILEはイソ
ロイシン、PHEはフェニルアラニン、PROはプロリン、SE
Rはセリン、THRはスレオニン、TRPはトリプトファン、T
YRはチロシンそしてVALはバリンである。

図３は、ヒツジLIF遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。クローンλOGLIFR2から誘導された−1.5kbpの配列
に相当し、ヒツジLIF遺伝子の３つの蛋白コード化部位
をスパンしているブタLIF遺伝子のmRNA同義鎖の３つの
部分は、標準的手段に従って単一文字コードを用い５′
ないし３′に表示され、ここで、Ａはデオキシアデノシ
ン−５′−リン酸を示し、Ｃはデオキシシチジン−５′
−リン酸を示し、Ｇはデオキシグアノシン−５′−リン
酸を示し、そしてＴはデオキシチミジン−５′−リン酸
を示す。ネズミ及びヒトcDNA並びに遺伝子配列（国際出
願番号PCT/AU88/00093）と類似することにより明らかに
されるヒトLIF遺伝子の３つのエキソンによりコード化
されるアミノ酸配列は遺伝子配列の上に表示され、ここ
で、ALAはアラニン、ARGはアルギニン、ASNはアスパラ
ギン、ASPはアスパラギン酸、CYSはシステイン、GLNは
グルタミン、GLUはグルタミン酸、GLYはグリシン、HIS
はヒスチジン、ILEはイソロイシン、PHEはフェニルアラ
ニン、PROはプロリン、SERはセリン、THRはスレオニ
ン、TRPはトリプトファン、TYRはチロシン、そしてVAL
はバリンである。

図４はブタLIFのアミノ酸配列及びネズミ、ヒト及び
ヒツジLIFとの比較を示す。LIFコード化cDNA（PCT/AU88
/00093）の直接アミノ酸配列及びヌクレオチド配列分析
により測定されたネズミLIFのアミノ酸配列（Ｍ）は最
上ラインに、ヒト及びヒツジ遺伝子（PCT/AU88/00093）
のヌクレオチド配列分析により測定された、対応するヒ
ト及びヒツジアミノ酸配列（Ｈ及びＯ）は中央に、そし
てブタLIFの対応配列（Ｐ）は最下ラインに示される。
直接アミノ酸シーケシングにより測定された成熟ネズミ
LIFのＮ末端残基は＋１で示す。ネズミとヒトの間、ヒ
トとヒツジの間又はヒツジとブタの間のLIFの同一性は
星印により、又、保存置換（Arg/Lys;Glu/Asp:Ser/Thr:
Ile/Leu/Val）はダッシュにより示される。

実施例１ネズミLIFcDNAプロープを用いる交叉ハイブリッド形成による哺乳動物LIF遺伝子の同定サザンブロット上のヒトLIF遺伝子を検出するハイブ
リッド形成プローブとして、マウスLIFcDNAの放射活性
標識化断片を用いる方法は既に開示されている（PCT/AU
88/00093）。図１は、ヒツジ、ブタ、ウシ、モルモッ
ト、イヌ、サル、ヒト及びラットを含む種々の哺乳動物
の推定に基づくLIF遺伝子同族体を検出するのに、同様
の条件を用いることができることを示す。それぞれの種
において、このプローブを用いると、反復配列について
の何の徴候もなくユニークな遺伝子が検出されることに
注意されたい。又、推定に基づくLIF遺伝子同族体のハ
イブリッド形成の強度は、齧歯類DNAに対するネズミプ
ローブのそれよりも低く、類似の程度が低いことを暗示
していることにも注意されたい。

ゲル上の各トラックは、制限エンドヌクレアーゼBamH
Iで完全に消化された、各表示の種からの10μｇのゲノ
ムDNAを含む。0.8％w/vアガロースゲル通過電気泳動及
び標準的条件を用いるニトロセルロースへの移入後、固
定化DNAを、ニック翻訳による^-2−×10⁸cpm/μｇの特異
活性まで³²p標識化したクローンpLIF7−2b（PCT/AU88/0
0093）からのマウスLIFcDNAの断片とハイブリッド形成
した。フィルターを、0.97NaCl、0.09Mクエン酸ナトリ
ウム（６×SSC）、0.2％w/vフイコール、0.2％w/vポリ
ビニルピロリドン、0.2％w/vウシ血清アルブミン、50μ
g/mlエシエリシア・コリtRNA、0.1mMATP及び2mMピロリ
ン酸ナトリウム中、65℃でプレハイブリッド形成及びハ
イブリッド形成した。ハイブリッド形成中、0.1％w/vSD
Sを含有させ、又、プローブを^-2×10⁷cpm/mlで含有させ
た。65℃で16時間ハイブリッド形成後、フィルターを２
×SSC、0.1％w/vSDS中65℃でよく洗浄し、次いでコダッ
クXARSフィルム及び２スクリーンを用い−70℃でオート
ラジオグラフした。

実施例２ブタLIF遺伝子の分離特にSan3Aで消化した、ブタゲノムDNAのライブラリィ
を、プローブとしてネズミLIFcDNA及びヒトLIF遺伝子の
部分の両方を用いるハイブリッド形成によるLIF遺伝子
含有クローンのスクリーンをした。プローブとして用い
たネズミLIFcDNA断片はLIFコード化部位に対応し、クロ
ーンpLIFmutlから誘導した。プローブとして用いたヒト
遺伝子断片は、ヒトLIF遺伝子をスパンする3kbp BamH I
断片に対応し、クローンpHGLIFBmal（PCT/AU88/00093）
から誘導した。ハイブリッド形成の条件は、既に開示さ
れている（PCT/AU88/00093）。要するに、ゲノムライブ
ラリィに対応するファージプラクを10cmペトリ皿当り5
0,000プラグの密度で生育させて、マニアチス等（198
2）に記載されるようにニトロセルロースに移転した。
ハイブリッド形成前に、フィルターを６×ssc（ssc＝0.
15MNaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム）、0.2％w/vフィ
コール、0.2％w/vポリビニルピロリドン、0.2％w/vウシ
血清アルブミン、2mMピロリン酸ナトリウム、1mMATP、5
0μg/mlエシェリシア・コリtRNA0.1％w/vSDS65℃で16−
18時間、65℃で数時間インキュベートした。ネズミLIFc
DNA及びヒトLIFゲノムDNA断片を、［α−³²P］dATPを用
いる−２×10⁸cpm/μｇの特異活性までのニック翻訳に
より、又は−10⁹cpm/μｇの特異活性までランダムに初
回抗原刺激することにより、各放射活性標識化して、−
２×10⁶cpm/mlの濃度でハイブリッド形成中、インキュ
ベートした。各ペトリ皿につき、２つのニトロセルロー
スフィルターをネズミプローブでハイブリッド形成し、
２つをヒトプローブでハイブリッド形成した。ハイブリ
ッド形成後、フィルターを６×ssc、0.1％w/vSDS中、65
℃でよく洗浄し、次いでオートラジオグラフィーした。
４組のフィルター上のプラグ陽性を取り、先と同様に低
密度で再スクリーンした。二つの異なるプローブを使用
することにより、同時に、一又は他のプローブに対する
偶発性を示す短配列切片を含むクローンを確認する機会
が減じた。元から確認されるクローンの一つ（λPGLIF
−E2）を精製した。このλクローンからのDNAを一連の
制限エンドヌクレアーゼ（クローンしたゲノムDNAの全
切片を遊離させるSal Iを含む）により消化した。組換
えファージDNAの消化及びアガロースゲル上の電気泳動
による分解後、DNAをニトロセルロースに移転して、マ
ウスLIFcDNAプローブと（上で得られた条件下に）ハイ
ブリッド形成し、LIF遺伝子を含有する断片を明らかに
した。高厳密の洗浄（0.2×ssc.65℃）後でも、ブタDNA
はなお、ネズミプローブとの強いハイブリッド形成を示
した。ネズミcDNAプローブにハイブリッド形成し、大き
さでブタゲノムDNAのサザンブロットで確認されたもの
と対応する2.4kbpBcmH I断片を確認し、プラスミドベク
ターpUC12内にサブクローンしてpPLIFBamlをクローンし
た。

実施例３ヒツジLIF遺伝子の分離特にsau3Aで消化し、そしてラムダファージクローニ
ングベクターEMBL3Aで連結したヒツジゲノムDNAのライ
ブラリィを、プローブとしてネズミLIFcDNA及びヒトLIF
遺伝子の部分の両方によるハイブリッド形成によるLIF
遺伝子含有クローンについてスクリーンした。ブローブ
として用いたネズミLIFcDNA断片は、ヒトLIF遺伝子をス
パンする3kbpBAMH I断片に対応し、クローンpHGLIFBaml
（PCT/AU88/00093）から誘導された。ハイブリッド形成
の条件は、PCT/AU88/00093及び実施例２に開示された通
りであった。

元から確認された８つのクローンの一つ（λOGLIFR
2）を精製した。このλクローンからのDNAを一連の制限
エンドヌクレアーゼ（クローンしたゲノムDNAの全断片
を遊離させるSal Iを含む）で消化した。組換えファー
ジDNAの消化及びアガロースゲル上の電気泳動による分
解後、DNAをニトロセルロースに移転してマウスLIFcDNA
プローブと（上で概略述べた条件下）ハイブリッド形成
し、LIF遺伝子を含む断片を明らかにした。高厳密の洗
浄（0.2×ssc、65℃）後でさえ、ブタDNAは依然として
ネズミプローブとの強いハイブリッド形成を示した。ネ
ズミcDNAプローブにハイブリッド形成する−3kbpBamH I
断片を確認し、プラスミドベクターpEMBL8＋内にサブク
ローンしてpOGLIFBamlをクローンした。

実施例４ブタ及びヒツジLIFのヌクレオチド及びアミノ酸配列
の測定ヌクレオチドシーケシングを、シーケナーゼ（登
録商標）成分及びプロトコール（ユナイテッド・ステー
ツ・バイオケミカルズ）を用いるジデオキシ鎖終結方法
（サンガー等、1977）により実施した。ブタ及びヒツジ
LIFDNAのヌクレオチド配列は図２及び３に示す。鋳型
は、pPLIFBamlの2.4kbpBamH I断片又はM13ファージベク
ター（メッシング及びヴィーイラ、1982）内にサブクロ
ーンされたpOGLIFBam Iの3kbpBamH I断片から誘導され
た種々の断片の一本鎖DNAであった。用いたプライマー
は、M13配列中の外側プライマー及び遺伝子内の配列に
相補の種々のオリゴヌクレオチドの両方であった。

こうして測定したブタ及びヒツジLIF配列をそれぞれ
図２及び３に示す。これらの配列はヒト及びマウス配列
と並べることにより、これらがネズミ及びヒトLIFに高
類似性の蛋白を特定するコードづけ部分を含むことを明
らかにする。これらのコードづけ部分によりコード化さ
れる蛋白配列は、ヌクレオチド配列の上に表示される。

ブタ及びヒツジLIFの完全アミノ酸配列は、星印によ
り示される同一性及びダッシュによる保存置換とともに
図４中、ネズミ及びヒトLIF配列と共に整列する。多く
のアミノ酸配列の大ブロックが４つの全ての種の間で全
体として依然保存されている。しかしながらブタ配列は
ヒト及びネズミ配列よりもヒツジにより近く関連してい
ることが明らかである。これら４つのLIF配列の比較は
表１に示され、ここで、LIF分子の成熟部分のみが疎水
性指導体を排除していると考えられる。同一性のみがこ
の比較で評価される。

PCT/AU88/00093に開示される方法は、家畜類（例えば
ヒツジ又はブタ）LIF遺伝子を運ぶ種々の発現ベクター
の構造に用いることができる。このようなベクターは酵
母（例えばYEsecl、バルダリ等、1987）及びエシェリシ
ア・コリ（例えばベクターpGEX−2T、スミス及びジョン
ソン、1988、ゲーリング等、1989）を含む。発現条件は
PCT/AU88/00093に開示される通りである。

実施例５ LIFの付加による８つの細胞ネズミ胚の増殖の促進を
以下の実施例に記載する。これは本発明を例示する手段
であって、本発明を限定するものでない。

1.材料及び方法動物 Balb−Ｃ×C57 ３−４週令F1雌マウスを7.5iuMGSG
（ホリゴン；インターベット、オーストラリア）で、次
いで48時間後7.5iu hCG（チョルロン；インターベッ
ト、オーストラリア）を与えて過剰排卵を実施した。次
いで直ちにhCG（ヒト絨毛性ゴナドトロピン）を注射
し、処置した雌を繁殖力のある雄と一緒に置いた（CBA
C57ストレイン、ケージ当り１匹の雌プラス１匹の
雄）。翌朝、各雌は交配の証拠としての膣栓の存在を調
査した。そしてこれを妊娠の１日目と考えた。

培地培養培地は、ミリーＱ水に溶解した粉末最少必須培地
（MEM:イーグル塩類を含み、Ｌ−グルタミンを含み、重
炭酸ナトリウムを含まないイーグル，フロー・ラボラト
リーズ、英国）から調製し、そして、１μg/mlグルコー
ス、25mM重炭酸ナトリウム及び10％（v/v）加熱水活性
化ウシ胎児血清（FCS:CSL、オーストラリア）を添加し
た。抗生物質／抗真菌溶液も100mlの溶液当り、10,000
単位ペニシリン、10,000μｇストレプトマイシン及び25
μｇフンギゾン（CSL、オーストラリア）となるように
加えた。培地のpH及び浸透圧モル濃度は、7.40及び280m
Dsmにそれぞれ調整した。この時点で培地を濾過により
（アクロディクスク0.2μｍフィルター、ゲルマン・サ
イエンスズ、米国）滅菌した。

胚妊娠３日目に雌を1300〜1500時間の間で、即ち、hCG
注射後71−73時間で、頸部転位により殺した。全生殖路
を取り出してカルシウム及びマグネシウムのないイーグ
ル均衡塩類溶液（EBS9）中に、37℃で置いた。続いて８
−細胞胚を卵管−子宮接合部から引き出し／摘出し、一
度培養培地中で洗浄後、対照又は実験群（以下参照）中
に置き、空気中５％CO₂、37℃の湿潤ガス雰囲気中で保
持した。

胚の培養実験のために、８−細胞胚をランダムに対照群又は実
験群とした。各群は、レプリケート（replicate）当り
に用いた４−６匹のマウスからの胚を持った８レプリケ
ートから構成された。胚を子宮から回収後約15−20分で
ウエル当り10−20加え、培養培地のみ（1ml/ウエル）又
は示したようなLIF（1000μ/ml）添加の培養培地を含む
ウエルに５日間イン・ビトロで保持した。このLIFの用
量は、ES細胞の分化の阻止に最適であるように選んだ
（国際特許出願番号、PCT/AU89/00330）。

形態学的発育の評価胚発育の観察は、倒立顕微鏡を用いて毎日行ない、桑
実胚、胚盤胞または孵化胚盤胞の段階に達した胚の数を
記録した（フス、1979）。培養４−５日で、多くの胚は
移殖と関連した発育変化を受けた（シャーマン、197
8）。この研究に関し、後孵化胚（post hatching embry
os）が増殖栄養外胚葉細胞を示したとき、段階１に達し
たと記録し、栄養外胚葉細胞の成長を示したとき、段階
２に達したと記録した。

2.結果培地中LIF（10³単位/ml）を含むイン・ビトロでの、
胚盤胞形成前（RRE）又は形成後（POST）のマウス８−
細胞胚の発育に対する効果を表２に示す。結果は、発育
段階を終了している胚の％当初数（ｎ＝35）として表わ
す。

LIF（10³単位/ml）を培養培地に添加した全ての実験
のデータを組合せることにより、以下に示すようにLIF
の添加が８−細胞マウス胚の移殖段階２への発育を向上
させることが判る（材料及び方法−形態学的増殖の評価
参照）：対照 LIF 移殖段階２に達した胚＝ 226 156 培養した８−細胞胚の総数 349 195 （64％）（80％）（X²＝27.0 ｐ0.001）この分野の当業者にとって、本明細書に記載した本発
明はこれら特異的に記載した以外に変更及び修飾しうる
ことが理解される。本発明はそのような変更及び修飾を
含むことが認められるべきである。本発明は又、本明細
書中に、個別に又は集合的に引用し又は、示した全ての
段階、特徴、組成物及び化合物並びに全ての２又はそれ
以上の該段階又は特徴のいかなる全ての組合せをも含
む。

実施例６ヒツジLIFの発現ヒツジLIFに関する隣接するコーディング部位はイン
トロン除去により構成され、部位は既に記載したように
ヒトLIF遺伝子と類似の手段で変異誘発させる。

こうして構成されるヒツジLIFコーディング部位は、
酵母発現ベクターYEpsec−１に、正しい（クローン３お
よぴ15）及び誤った（クローン５）定位にクローンされ
た。LIF活性を測定し結果を表３に示す。LIF活性は、前
に記載したようにM1細胞分化バイオアッセーを用いて測
定される単位/mlで表現する。マウス陽性対照（マウス
＋ve）は、正しい定位に挿入されたネズミLIF遺伝子を
伴うYEpsec−１を含む酵母クローンである。

表３酵母クローン LIF 活性（単位）（単位/ml）クローン３ 10,700 クローン15 829,000 クローン５ 0 マウス＋ve 61,400 実施例７レセプター結合競合アッセーレセプター結合競合アッセーを既に記載したように実
施した。アッセーは、マウス肝細胞の特異的細胞レセプ
ターに結合するに適したヨウ素化ネズミLIFと競合する
ヒツジLIFを誘導する酵母の能力を示す。

引用文献バルダリ等エムボ・ジャーナル６、229−234、1987 フスＹ−Ｃ、デベロップメンタル・バイオロジィ68、
4530616、1979 マニアティス等、モレキュラー・クローニング．ア・ラ
ボラトリィ・マニュアル．コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリィ，コールド・スプリング・ハーバー
・ユーエスエイ 1982 メッシング及びヴィーイラ，ジーン19、269−276、1982 サンガー等、プロシーディングス・ナショナル・アカデ
ミィ・オブ・サイエンス・ユーエスエイ、74、5463−54
62、1977 シャーマン、メソーズ・イン・ママリアン・レプロダク
ション、ニューヨーク、アカデミック・プレス、31−12
5、1978 スミスおよびジョンソン、ジーン、67、31040、1988 ギアリング、ニコラ、メトカーフ、フート、ウィルソ
ン、ガウフ及びウィリアムス、バイオテクノロジィ、
７、1157−1161、1989

フロントページの続き (31)優先権主張番号ＰＪ４８６０ (32)優先日 1989年６月23日 (33)優先権主張国オーストラリア（ＡＵ） (72)発明者シーマーク、ロバート・フレデリックオーストラリア連邦5067 サウス・オーストラリア、ビューラ・パーク、ユニオン・ストリート 34番 (56)参考文献国際公開88／7548（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ 85（1988）ｐ．2623−2627 Ｎａｔｕｒｅ 336（1988）ｐ．684− 687 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】非ヒト哺乳動物の胚を、哺乳動物白血病阻
止因子（LIF）を含む培地中で培養して、当該胚の移殖
段階までの発育を増進させることを特徴とする、非ヒト
哺乳動物のイン・ビトロ発育増進方法。
【請求項２】非ヒト哺乳動物が齧歯類動物または家畜類
動物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】哺乳動物LIFがヒト、齧歯類動物または家
畜類動物由来のものである、請求項１または２記載の方
法。
【請求項４】哺乳動物LIFが家畜類動物由来のものであ
る、請求項３記載の方法。
【請求項５】家畜類動物がヒツジまたはブタである、請
求項４記載の方法。
【請求項６】非ヒト哺乳動物の胚を、移殖前に、哺乳動
物LIFを含む培地中で培養することを特徴とする、非ヒ
ト哺乳動物のイン・ビトロ受精および移殖方法。
【請求項７】哺乳動物LIFがヒト、齧歯類動物または家
畜類動物由来のものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】家畜類動物がヒツジまたはブタである、請
求項７記載の方法。
【請求項９】哺乳動物白血病阻止因子（LIF）を有効成
分とする、非ヒト哺乳動物の胚の移殖段階までのイン・
ビトロ発育増進剤。
【請求項１０】胚を培養する培地に配合される、請求項
９記載の増進剤。
【請求項１１】哺乳動物LIFがヒト、齧歯類動物または
家畜類動物由来のものである、請求項９または10記載の
増進剤。
【請求項１２】哺乳動物LIFが家畜類動物由来のもので
ある、請求項11記載の増進剤。
【請求項１３】家畜類動物がヒツジまたはブタである、
請求項12記載の増進剤。