JP2003009869A - ニワトリの白血病阻止因子（ｌｉｆ）、及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents
ニワトリの白血病阻止因子（ｌｉｆ）、及びそれをコードする遺伝子Info
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ニワトリＬＩＦの遺伝子を提供するものであ
る。この遺伝子情報を基に、ニワトリ由来ＬＩＦ蛋白質
を安定に供給することができ、これまで抱えていたトラ
ンスジェニックニワトリの作出の問題点を解決する。さ
らに、ニワトリＬＩＦ蛋白質をトランスジェニックニワ
トリの作出のためのニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細
胞の培養用試薬として供給することにより、実験用のト
ランスジェニックニワトリのみならず、畜産動物で最初
の実用レベルなトランスジェニック体を供給する。 【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するニワトリの白
血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、及び特定のＤＮＡ配列を
コードする遺伝子、並びにニワトリのＬＩＦの製造方法
に関する。また、本発明は、ニワトリＬＩＦからなるニ
ワトリの分化可能な細胞の分化防止剤、それを用いたニ
ワトリの分化防止方法、ニワトリの分化可能な細胞の培
養方法、及びそれを含有してなる培地などに関する。
る。この遺伝子情報を基に、ニワトリ由来ＬＩＦ蛋白質
を安定に供給することができ、これまで抱えていたトラ
ンスジェニックニワトリの作出の問題点を解決する。さ
らに、ニワトリＬＩＦ蛋白質をトランスジェニックニワ
トリの作出のためのニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細
胞の培養用試薬として供給することにより、実験用のト
ランスジェニックニワトリのみならず、畜産動物で最初
の実用レベルなトランスジェニック体を供給する。 【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するニワトリの白
血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、及び特定のＤＮＡ配列を
コードする遺伝子、並びにニワトリのＬＩＦの製造方法
に関する。また、本発明は、ニワトリＬＩＦからなるニ
ワトリの分化可能な細胞の分化防止剤、それを用いたニ
ワトリの分化防止方法、ニワトリの分化可能な細胞の培
養方法、及びそれを含有してなる培地などに関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ニワトリの白血病
阻止因子（ＬＩＦ）、及びそれをコードする遺伝子、並
びにその製造方法に関する。本発明のニワトリ白血病阻
止因子（ＬＩＦ）はニワトリ胚性幹細胞又は胚性生殖細
胞などのニワトリの分化可能な細胞の分化防止作用を有
し、ニワトリの分化可能な細胞を培養する際の分化防止
剤として有用である。また、本発明は、本発明のニワト
リ白血病阻止因子（ＬＩＦ）を用いたニワトリの分化可
能な細胞の培養方法、そのための培地、その方法による
トランスジェニックニワトリの作出方法、及びその方法
で作出されたトランスジェニックニワトリに関する。
阻止因子（ＬＩＦ）、及びそれをコードする遺伝子、並
びにその製造方法に関する。本発明のニワトリ白血病阻
止因子（ＬＩＦ）はニワトリ胚性幹細胞又は胚性生殖細
胞などのニワトリの分化可能な細胞の分化防止作用を有
し、ニワトリの分化可能な細胞を培養する際の分化防止
剤として有用である。また、本発明は、本発明のニワト
リ白血病阻止因子（ＬＩＦ）を用いたニワトリの分化可
能な細胞の培養方法、そのための培地、その方法による
トランスジェニックニワトリの作出方法、及びその方法
で作出されたトランスジェニックニワトリに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、トランスジェニック動物の作成
は、医学・生物学を始め広範な領域において大きな進歩
をもたらしてきている。特定の遺伝子が導入されたり、
また特定の遺伝子がノックアウトされた動物の作成は、
これらの遺伝子の機能を解析するための重要なツールと
なってきている。これらのトランスジェニック動物の作
成方法としては、受精卵に外来遺伝子を直接導入するト
ランスジェニック法と、胚性幹細胞（Embryonic Stem
細胞）を介した遺伝子導入法の２つの方法がある。胚性
幹細胞（以下、ＥＳ細胞という。）への遺伝子の導入
は、ジーンターゲッティング法により特定のゲノムの位
置に目的の遺伝子を導入したり、ノックアウトすること
ができることから、現在広く応用されている方法であ
る。
は、医学・生物学を始め広範な領域において大きな進歩
をもたらしてきている。特定の遺伝子が導入されたり、
また特定の遺伝子がノックアウトされた動物の作成は、
これらの遺伝子の機能を解析するための重要なツールと
なってきている。これらのトランスジェニック動物の作
成方法としては、受精卵に外来遺伝子を直接導入するト
ランスジェニック法と、胚性幹細胞（Embryonic Stem
細胞）を介した遺伝子導入法の２つの方法がある。胚性
幹細胞（以下、ＥＳ細胞という。）への遺伝子の導入
は、ジーンターゲッティング法により特定のゲノムの位
置に目的の遺伝子を導入したり、ノックアウトすること
ができることから、現在広く応用されている方法であ
る。
【０００３】このように、ジーンターゲッティング法に
よるＥＳ細胞を用いたトランスジェニック動物の作成が
広く利用されているが、この方法では遺伝子操作中にお
ける分化の抑制が重要な問題となる。ＥＳ細胞の培養を
行う際にはフィーダー（feeder）細胞を準備するか、分
化を抑制するための因子としてのＬＩＦの使用が必要で
ある。ＬＩＦ（白血病阻止因子（Leukemia Inhibitory
Factor））は、ＩＬ−６ファミリーに属するサイトカイ
ンの１種であり、細胞を未分化の状態で維持するために
は必須の物質である（Smith A., et al., Nature, 336,
688-690 (1988)）。ジーンターゲッティング法によるマ
ウストランスジェニック体の作出にマウスＬＩＦは必須
の因子であり、マウス由来のリコビナントＬＩＦが既に
製品化されている。この因子単独でマウス胚性幹細胞の
培養が可能となっているが、他の動物にはＬＩＦが確立
されておらず、ジーンターゲッティング法によるトラン
スジェニック動物の作出が困難とされている。
よるＥＳ細胞を用いたトランスジェニック動物の作成が
広く利用されているが、この方法では遺伝子操作中にお
ける分化の抑制が重要な問題となる。ＥＳ細胞の培養を
行う際にはフィーダー（feeder）細胞を準備するか、分
化を抑制するための因子としてのＬＩＦの使用が必要で
ある。ＬＩＦ（白血病阻止因子（Leukemia Inhibitory
Factor））は、ＩＬ−６ファミリーに属するサイトカイ
ンの１種であり、細胞を未分化の状態で維持するために
は必須の物質である（Smith A., et al., Nature, 336,
688-690 (1988)）。ジーンターゲッティング法によるマ
ウストランスジェニック体の作出にマウスＬＩＦは必須
の因子であり、マウス由来のリコビナントＬＩＦが既に
製品化されている。この因子単独でマウス胚性幹細胞の
培養が可能となっているが、他の動物にはＬＩＦが確立
されておらず、ジーンターゲッティング法によるトラン
スジェニック動物の作出が困難とされている。
【０００４】ニワトリは、卵の高い蛋白質生産性が注目
され、トランスジェニック・ニワトリの作出が試みられ
ている。ニワトリの受精卵は比較的取り扱いが容易であ
り、遺伝子を導入することは問題は少ないが、特定の位
置に遺伝子を導入又はノックアウトするためにはジーン
ターゲッティング法によるトランスジェニック・ニワト
リの作出が必須である。ニワトリとマウスでは、発生様
式が異なることからにではＥＳ細胞をとることができな
い。しかし、ニワトリでも発生途中の胚からＥＳ細胞に
相当する細胞の分離および培養が可能である。マウスの
ＥＳ細胞に相当するニワトリの細胞としては、胚盤葉細
胞と始原生殖細胞があり、胚盤葉細胞はマウスのＥＳ細
胞に匹敵する細胞で、発生途中の胚細胞である。始原生
殖細胞は、将来生殖細胞（精子や卵子）へ分化する細胞
であり、体外培養が可能な株化細胞の開発が進められて
いる。この株化細胞はＥＧ（Embryonic Germ）細胞と呼
ばれている。いずれの細胞も、いかに未分化な状態を維
持したまま培養するかが問題であるが、現在のところニ
ワトリＬＩＦが発見されていないために、他の哺乳類Ｌ
ＩＦとその他のサイトカインを組み合わせた培地が使用
されている。例えば、マウス由来のリコビナントＬＩＦ
を用いたニワトリの胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養
系確立のための研究が進められているが、その効果が低
いため現在もなお培養系の確立にはいたっていない。
され、トランスジェニック・ニワトリの作出が試みられ
ている。ニワトリの受精卵は比較的取り扱いが容易であ
り、遺伝子を導入することは問題は少ないが、特定の位
置に遺伝子を導入又はノックアウトするためにはジーン
ターゲッティング法によるトランスジェニック・ニワト
リの作出が必須である。ニワトリとマウスでは、発生様
式が異なることからにではＥＳ細胞をとることができな
い。しかし、ニワトリでも発生途中の胚からＥＳ細胞に
相当する細胞の分離および培養が可能である。マウスの
ＥＳ細胞に相当するニワトリの細胞としては、胚盤葉細
胞と始原生殖細胞があり、胚盤葉細胞はマウスのＥＳ細
胞に匹敵する細胞で、発生途中の胚細胞である。始原生
殖細胞は、将来生殖細胞（精子や卵子）へ分化する細胞
であり、体外培養が可能な株化細胞の開発が進められて
いる。この株化細胞はＥＧ（Embryonic Germ）細胞と呼
ばれている。いずれの細胞も、いかに未分化な状態を維
持したまま培養するかが問題であるが、現在のところニ
ワトリＬＩＦが発見されていないために、他の哺乳類Ｌ
ＩＦとその他のサイトカインを組み合わせた培地が使用
されている。例えば、マウス由来のリコビナントＬＩＦ
を用いたニワトリの胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の培養
系確立のための研究が進められているが、その効果が低
いため現在もなお培養系の確立にはいたっていない。
【０００５】ニワトリは胚の入手が容易であり、胚の操
作も容易であることから発生学の研究材料として広く使
用されてきた。また、ニワトリは食肉用のみならず、卵
の蛋白質生産性が高く産業上も重要であることから、ト
ランスジェニックニワトリの作成技術の確立が求められ
ていた。しかし、ニワトリでは、ニワトリ胚性幹細胞及
び胚性生殖細胞の培養系が未確立のままで、人為的な遺
伝子改変が自由に行えるレベル（トランスジェニックマ
ウスのレベル）まで到達していなかった。そのための培
養系に必須の因子であるニワトリＬＩＦの遺伝子・タン
パククローニングが急がれていたが、哺乳類と種が大き
く異なるニワトリでは、ＬＩＦの存在さえ未解析であっ
た。このように、ニワトリのＬＩＦ蛋白質の製造がニワ
トリのトランスジェニックを作出するために求められて
いた。
作も容易であることから発生学の研究材料として広く使
用されてきた。また、ニワトリは食肉用のみならず、卵
の蛋白質生産性が高く産業上も重要であることから、ト
ランスジェニックニワトリの作成技術の確立が求められ
ていた。しかし、ニワトリでは、ニワトリ胚性幹細胞及
び胚性生殖細胞の培養系が未確立のままで、人為的な遺
伝子改変が自由に行えるレベル（トランスジェニックマ
ウスのレベル）まで到達していなかった。そのための培
養系に必須の因子であるニワトリＬＩＦの遺伝子・タン
パククローニングが急がれていたが、哺乳類と種が大き
く異なるニワトリでは、ＬＩＦの存在さえ未解析であっ
た。このように、ニワトリのＬＩＦ蛋白質の製造がニワ
トリのトランスジェニックを作出するために求められて
いた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、この問題点
を解決するために、最新の分子生物学的手法を駆使し、
ニワトリＬＩＦの遺伝子を提供するものである。この遺
伝子情報を基に、ニワトリ由来ＬＩＦ蛋白質を安定に供
給することができれば、これまで抱えていたトランスジ
ェニックニワトリの作出の問題点が解決されることにな
る。さらに、本発明は、本発明の遺伝子情報を基にリコ
ビナントＬＩＦ蛋白質を大量生産し、トランスジェニッ
クニワトリの作出のためのニワトリ胚性幹細胞及び胚性
生殖細胞の培養用試薬として供給することにより、実験
用のトランスジェニックニワトリのみならず、畜産動物
で最初の実用レベルなトランスジェニック体を供給する
ことを可能にするものである。
を解決するために、最新の分子生物学的手法を駆使し、
ニワトリＬＩＦの遺伝子を提供するものである。この遺
伝子情報を基に、ニワトリ由来ＬＩＦ蛋白質を安定に供
給することができれば、これまで抱えていたトランスジ
ェニックニワトリの作出の問題点が解決されることにな
る。さらに、本発明は、本発明の遺伝子情報を基にリコ
ビナントＬＩＦ蛋白質を大量生産し、トランスジェニッ
クニワトリの作出のためのニワトリ胚性幹細胞及び胚性
生殖細胞の培養用試薬として供給することにより、実験
用のトランスジェニックニワトリのみならず、畜産動物
で最初の実用レベルなトランスジェニック体を供給する
ことを可能にするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ニワトリの白
血病阻止因子（以下、ＬＩＦという。）、及びそれをコ
ードする遺伝子、並びにニワトリのＬＩＦの製造方法に
関する。また、本発明は、ニワトリＬＩＦからなるニワ
トリの分化可能な細胞の分化防止剤、それを用いたニワ
トリの分化防止方法、ニワトリの分化可能な細胞の培養
方法、及びそれを含有してなる培地に関する。更に本発
明は、ニワトリの分化可能な細胞に外来遺伝子を導入、
又は特定の遺伝子の発現を阻止するための改変をして、
当該分化可能な細胞をニワトリＬＩＦの存在下に培養し
てなるトランスジェニックニワトリの作出方法、及びそ
の方法で作出されたトランスジェニックニワトリに関す
る。
血病阻止因子（以下、ＬＩＦという。）、及びそれをコ
ードする遺伝子、並びにニワトリのＬＩＦの製造方法に
関する。また、本発明は、ニワトリＬＩＦからなるニワ
トリの分化可能な細胞の分化防止剤、それを用いたニワ
トリの分化防止方法、ニワトリの分化可能な細胞の培養
方法、及びそれを含有してなる培地に関する。更に本発
明は、ニワトリの分化可能な細胞に外来遺伝子を導入、
又は特定の遺伝子の発現を阻止するための改変をして、
当該分化可能な細胞をニワトリＬＩＦの存在下に培養し
てなるトランスジェニックニワトリの作出方法、及びそ
の方法で作出されたトランスジェニックニワトリに関す
る。
【０００８】本発明者らは、ニワトリ単球系白血病細胞
株（ＩＮ２４）をリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激して、サブ
トラクション法により、ＬＰＳ刺激で過剰に発現する遺
伝子をクローニングした。これらのクローンのひとつに
哺乳類由来ＬＩＦに相同性（約３０％）をもつクローン
を得た。得られたクローンのｃＤＮＡの塩基配列を配列
表の配列番号１に示す。この遺伝子は、７８９塩基から
なり、７５番目のａｔｇから７０８番目のｔｇａまでの
翻訳領域を有する２１１個のアミノ酸からなる蛋白質を
コードするものと推定された。推定される２１１個のア
ミノ酸からなるニワトリＬＩＦのアミノ酸配列を配列表
の配列番号２に示す。このアミノ酸配列をアミノ酸の１
文字表記により表したものを次ぎに示す。
株（ＩＮ２４）をリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激して、サブ
トラクション法により、ＬＰＳ刺激で過剰に発現する遺
伝子をクローニングした。これらのクローンのひとつに
哺乳類由来ＬＩＦに相同性（約３０％）をもつクローン
を得た。得られたクローンのｃＤＮＡの塩基配列を配列
表の配列番号１に示す。この遺伝子は、７８９塩基から
なり、７５番目のａｔｇから７０８番目のｔｇａまでの
翻訳領域を有する２１１個のアミノ酸からなる蛋白質を
コードするものと推定された。推定される２１１個のア
ミノ酸からなるニワトリＬＩＦのアミノ酸配列を配列表
の配列番号２に示す。このアミノ酸配列をアミノ酸の１
文字表記により表したものを次ぎに示す。
【０００９】
ＭＲＬＩＰＡＧＶＶＰ ＦＶＡＬＬＬＬＱＲＲ ＰＶＳＧＲＡＬＬＧＴ 30
ＳＳＡＣＰＴＮＧＬＣ ＲＡＮＶＬＥＱＴＲＲ ＱＶＡＬＬＮＡＴＡＱ 60
ＤＬＦＳＬＹＬＫＣＱ ＧＥＰＦＳＳＥＳＤＲ ＬＣＳＰＳＧＩＦＦＰ 90
ＰＦＨＶＮＲＴＴＥＲ ＫＥＶＭＶＡＭＹＫＬ ＦＡＦＬＮＡＳＬＧＮ 120
ＩＴＲＤＱＥＥＬＮＰ ＭＡＫＥＬＬＮＲＬＨ ＮＴＴＫＴＴＲＧＬＩ 150
ＳＮＬＴＣＬＬＣＫＨ ＹＮＩＦＱＶＤＶＳＹ ＧＥＳＳＫＤＫＳＡＦ 180
ＫＫＫＱＱＧＣＱＶＬ ＲＫＹＶＱＶＩＡＱＡ ＡＲＶＬＬＰＨＬＳＰ 210
Ａ 211
【００１０】また、得られたニワトリＬＩＦの遺伝子の
塩基配列及びアミノ酸（１文字表記）を図１に示す。本
発明のニワトリＬＩＦの塩基配列から予想されるアミノ
酸配列を、ヒトＬＩＦ及びマウスＬＩＦのアミノ酸配列
と比較したものを図２に示す。図２の黒三角印はシステ
インの位置を示し、白三角印は糖鎖の付加可能な位置を
示す。本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の予想されるアミ
ノ酸配列は、マウスＬＩＦとの相同性が４０％未満であ
った。リコビナントマウスＬＩＦを用いたニワトリ胚性
幹細胞及び胚性生殖細胞の培養系では、部分的な作用し
か認められておらず、これはマウスＬＩＦと本発明のニ
ワトリＬＩＦの相同性が低いことから裏付けられる。し
かし、蛋白質の構造を規定する重要なアミノ酸であるシ
ステインの位置はニワトリ、ヒト、及びマウスにおいて
完全に一致していた。
塩基配列及びアミノ酸（１文字表記）を図１に示す。本
発明のニワトリＬＩＦの塩基配列から予想されるアミノ
酸配列を、ヒトＬＩＦ及びマウスＬＩＦのアミノ酸配列
と比較したものを図２に示す。図２の黒三角印はシステ
インの位置を示し、白三角印は糖鎖の付加可能な位置を
示す。本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の予想されるアミ
ノ酸配列は、マウスＬＩＦとの相同性が４０％未満であ
った。リコビナントマウスＬＩＦを用いたニワトリ胚性
幹細胞及び胚性生殖細胞の培養系では、部分的な作用し
か認められておらず、これはマウスＬＩＦと本発明のニ
ワトリＬＩＦの相同性が低いことから裏付けられる。し
かし、蛋白質の構造を規定する重要なアミノ酸であるシ
ステインの位置はニワトリ、ヒト、及びマウスにおいて
完全に一致していた。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のニワトリＬＩＦは、配列
表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものに
限定されるものではなく、ニワトリに対してＬＩＦの活
性を有するものであるならば、配列番号２に示されるア
ミノ酸の一部が欠失し、他のアミノ酸で置換され、及び
／又は他のアミノ酸が付加したものであってもよい。こ
のような欠失、置換、付加におけるアミノ酸数にはニワ
トリに対するＬＩＦ活性を有する限り特に制限はない
が、好ましくは半数以下、１〜１００、又は１〜５０個
程度である。
表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものに
限定されるものではなく、ニワトリに対してＬＩＦの活
性を有するものであるならば、配列番号２に示されるア
ミノ酸の一部が欠失し、他のアミノ酸で置換され、及び
／又は他のアミノ酸が付加したものであってもよい。こ
のような欠失、置換、付加におけるアミノ酸数にはニワ
トリに対するＬＩＦ活性を有する限り特に制限はない
が、好ましくは半数以下、１〜１００、又は１〜５０個
程度である。
【００１２】本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子は、配列表
の配列番号１に示される塩基配列を有するものに限定さ
れるものではなく、前記したニワトリに対するＬＩＦ活
性を有する蛋白質をコードするものであるならば、配列
番号１に示される塩基の一部が欠失し、他の塩基で置換
され、及び／又は他の塩基が付加したものであってもよ
い。また、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子は、２本鎖の
ＤＮＡとしても、１本鎖のＤＮＡとしても、またＲＮＡ
であってもよく、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝
子に相補的な塩基を有するものも本発明のニワトリＬＩ
Ｆ遺伝子に包含されている。さらに、本発明のニワトリ
ＬＩＦ遺伝子はストリージェントな条件下でハイブリダ
イズし得る塩基配列を有するものも包含されている。
の配列番号１に示される塩基配列を有するものに限定さ
れるものではなく、前記したニワトリに対するＬＩＦ活
性を有する蛋白質をコードするものであるならば、配列
番号１に示される塩基の一部が欠失し、他の塩基で置換
され、及び／又は他の塩基が付加したものであってもよ
い。また、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子は、２本鎖の
ＤＮＡとしても、１本鎖のＤＮＡとしても、またＲＮＡ
であってもよく、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝
子に相補的な塩基を有するものも本発明のニワトリＬＩ
Ｆ遺伝子に包含されている。さらに、本発明のニワトリ
ＬＩＦ遺伝子はストリージェントな条件下でハイブリダ
イズし得る塩基配列を有するものも包含されている。
【００１３】また、本発明は、前記した本発明のニワト
リＬＩＦ遺伝子の断片を提供する。本発明のニワトリＬ
ＩＦ遺伝子の断片は、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を
検出、同定又は定量するためのプローブとして、また本
発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を得るためのプライマーと
して利用される。本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の断片
としては、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の中の５〜５
０塩基、５〜３０塩基、１０〜３０塩基程度の任意の位
置の配列を用いることができる。
リＬＩＦ遺伝子の断片を提供する。本発明のニワトリＬ
ＩＦ遺伝子の断片は、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を
検出、同定又は定量するためのプローブとして、また本
発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を得るためのプライマーと
して利用される。本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の断片
としては、本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子の中の５〜５
０塩基、５〜３０塩基、１０〜３０塩基程度の任意の位
置の配列を用いることができる。
【００１４】本発明のニワトリＬＩＦの製造方法として
は、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を用いて公
知の方法により行うことができる。例えば、配列番号１
に示される塩基配列を有する遺伝子を発現ベクターに組
み込んで、これを用いて宿主細胞を形質転換して、形質
転換された宿主細胞を培養することにより製造すること
ができる。宿主細胞としては大腸菌などの原核細胞や、
酵母やマウスの細胞などの真核細胞を使用することがで
きる。本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子をもとに、原核細
胞系もしくは真核細胞系を用いて、リコビナントニワト
リＬＩＦを作成することにより、トランスジェニックニ
ワトリを作出するために必要なニワトリＬＩＦを大量に
製造することができる。
は、前記した本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子を用いて公
知の方法により行うことができる。例えば、配列番号１
に示される塩基配列を有する遺伝子を発現ベクターに組
み込んで、これを用いて宿主細胞を形質転換して、形質
転換された宿主細胞を培養することにより製造すること
ができる。宿主細胞としては大腸菌などの原核細胞や、
酵母やマウスの細胞などの真核細胞を使用することがで
きる。本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子をもとに、原核細
胞系もしくは真核細胞系を用いて、リコビナントニワト
リＬＩＦを作成することにより、トランスジェニックニ
ワトリを作出するために必要なニワトリＬＩＦを大量に
製造することができる。
【００１５】本発明のニワトリの分化可能な細胞として
は、ニワトリ胚性幹細胞、胚性生殖細胞などが挙げられ
る。本発明のニワトリＬＩＦは、ニワトリの分化可能な
細胞を培養する際にその培養系に添加して当該細胞の分
化を防止することができる。したがって、本発明のニワ
トリＬＩＦは、ニワトリの分化可能な細胞の分化防止剤
として使用することができる。本発明の分化防止剤は、
精製された本発明のニワトリＬＩＦをそのまま使用する
こともできるが、適当な担体と混合して使用することも
できる。また、本発明のＬＩＦを予め培地に混合して、
ニワトリの分化可能な細胞を培養するための培地とする
こともできる。また、本発明は本発明のＬＩＦを用いた
ニワトリの分化可能な細胞の培養方法を提供する。前記
した本発明の分化防止剤を培養系に添加して、又は前記
した本発明の培地を用いて、ニワトリの分化可能な細胞
を培養する方法を提供する。
は、ニワトリ胚性幹細胞、胚性生殖細胞などが挙げられ
る。本発明のニワトリＬＩＦは、ニワトリの分化可能な
細胞を培養する際にその培養系に添加して当該細胞の分
化を防止することができる。したがって、本発明のニワ
トリＬＩＦは、ニワトリの分化可能な細胞の分化防止剤
として使用することができる。本発明の分化防止剤は、
精製された本発明のニワトリＬＩＦをそのまま使用する
こともできるが、適当な担体と混合して使用することも
できる。また、本発明のＬＩＦを予め培地に混合して、
ニワトリの分化可能な細胞を培養するための培地とする
こともできる。また、本発明は本発明のＬＩＦを用いた
ニワトリの分化可能な細胞の培養方法を提供する。前記
した本発明の分化防止剤を培養系に添加して、又は前記
した本発明の培地を用いて、ニワトリの分化可能な細胞
を培養する方法を提供する。
【００１６】さらに、本発明は、トランスジェニックニ
ワトリの作出方法、及びこの方法で作出されたトランス
ジェニックニワトリを提供する。本発明の好ましいトラ
ンスジェニックニワトリの作出方法としては、ニワトリ
胚性幹細胞、胚性生殖細胞などのニワトリの分化可能な
細胞を、好ましくはジーンターゲッティング法などによ
り特定のゲノムの位置に発現可能な外来遺伝子を導入し
たり、また特定のゲノムの位置に特定の遺伝子の発現を
阻止するための改変、例えばプロモーター領域などのエ
クソン領域を破壊するための外来遺伝子の導入又はコー
ドされるアミノ酸を変更若しくは付加するための遺伝子
の改変などを行うことにより、遺伝情報が改変された細
胞を培養して、生育させる方法が挙げられる。ニワトリ
胚性幹細胞や胚性生殖細胞を分化可能な細胞として使用
した場合には、通常はキメラニワトリが得られるので、
この次の世代のものが目的の遺伝子が導入又はノックア
ウトされたトランスジェニックニワトリとなる。
ワトリの作出方法、及びこの方法で作出されたトランス
ジェニックニワトリを提供する。本発明の好ましいトラ
ンスジェニックニワトリの作出方法としては、ニワトリ
胚性幹細胞、胚性生殖細胞などのニワトリの分化可能な
細胞を、好ましくはジーンターゲッティング法などによ
り特定のゲノムの位置に発現可能な外来遺伝子を導入し
たり、また特定のゲノムの位置に特定の遺伝子の発現を
阻止するための改変、例えばプロモーター領域などのエ
クソン領域を破壊するための外来遺伝子の導入又はコー
ドされるアミノ酸を変更若しくは付加するための遺伝子
の改変などを行うことにより、遺伝情報が改変された細
胞を培養して、生育させる方法が挙げられる。ニワトリ
胚性幹細胞や胚性生殖細胞を分化可能な細胞として使用
した場合には、通常はキメラニワトリが得られるので、
この次の世代のものが目的の遺伝子が導入又はノックア
ウトされたトランスジェニックニワトリとなる。
【００１７】本発明のニワトリＬＩＦ遺伝子をもとに作
出されるリコビナントニワトリＬＩＦは、トランスジェ
ニックニワトリを作出する確立した手法を提供するため
の待望の発見であり、これにより、これまで不可能であ
ったニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の未分化状態
での継代維持が可能となり、これまでニワトリでは困難
であった生体外での導入遺伝の選抜が可能となる。すな
わち、これまでトランスジェニックニワトリを作出する
上で問題であったすべての問題が本発明により解決され
ることになる。また、これらの細胞の培養系が確立され
れば、マウスレベル以上にニワトリでは、トランスジェ
ニック体の作出が容易になり、養鶏業界では品種改良へ
の利用、有用物質（医薬品、臨床検査試薬等）の生産
（卵で生産）が可能となる。
出されるリコビナントニワトリＬＩＦは、トランスジェ
ニックニワトリを作出する確立した手法を提供するため
の待望の発見であり、これにより、これまで不可能であ
ったニワトリ胚性幹細胞及び胚性生殖細胞の未分化状態
での継代維持が可能となり、これまでニワトリでは困難
であった生体外での導入遺伝の選抜が可能となる。すな
わち、これまでトランスジェニックニワトリを作出する
上で問題であったすべての問題が本発明により解決され
ることになる。また、これらの細胞の培養系が確立され
れば、マウスレベル以上にニワトリでは、トランスジェ
ニック体の作出が容易になり、養鶏業界では品種改良へ
の利用、有用物質（医薬品、臨床検査試薬等）の生産
（卵で生産）が可能となる。
【００１８】
【実施例】次に実施例により本発明をより詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００１９】実施例１ （ニワトリＬＩＦの遺伝子クロ
ーニング） ニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）をリポ多糖
（ＬＰＳ）で刺激したものと刺激していないものから別
々にｍＲＮＡを精製し、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。こ
の２種の細胞から得られたｃＤＮＡを用いてクロンテッ
クＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット（CLONTE
CH PCR-Select cDNA Subtraction kit）を用いてサブト
ラクション法を行った。得られたｃＤＮＡは、ｐＧＥＭ
−Ｔベクターにクローニングした。これらのクローンを
ＪＭ１０９大腸菌に形質転換し、寒天培地上で培養後、
出現したコロニーをＰＣＲ法により選抜した。選抜方法
はｐＧＥＭ−Ｔベクターの塩基配列中のｐＵＣ−Ｍ１３
フォーワードプライマーとリバースプライマー配列を用
いてＰＣＲを行い、ベクター内にｃＤＮＡが挿入されて
いるクローンのみを選択した。結果を図３に図面に代わ
る写真で示す。
ーニング） ニワトリ単球系白血病細胞株（ＩＮ２４）をリポ多糖
（ＬＰＳ）で刺激したものと刺激していないものから別
々にｍＲＮＡを精製し、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。こ
の２種の細胞から得られたｃＤＮＡを用いてクロンテッ
クＰＣＲ選択ｃＤＮＡサブトラクションキット（CLONTE
CH PCR-Select cDNA Subtraction kit）を用いてサブト
ラクション法を行った。得られたｃＤＮＡは、ｐＧＥＭ
−Ｔベクターにクローニングした。これらのクローンを
ＪＭ１０９大腸菌に形質転換し、寒天培地上で培養後、
出現したコロニーをＰＣＲ法により選抜した。選抜方法
はｐＧＥＭ−Ｔベクターの塩基配列中のｐＵＣ−Ｍ１３
フォーワードプライマーとリバースプライマー配列を用
いてＰＣＲを行い、ベクター内にｃＤＮＡが挿入されて
いるクローンのみを選択した。結果を図３に図面に代わ
る写真で示す。
【００２０】最終的に１２２クローンを選抜し、これら
のクローンのプラスミドを精製した後、オートシークエ
ンサーを用いてそれぞれのクローンの塩基配列を決定し
た。決定された塩基配列をそれぞれデータベースで照合
した結果、１２２クローン中のひとつのクローンが、哺
乳類（ウシ、ブタなど）由来ＬＩＦに相同性（約３０
％）をもつクローンであることがわかった。以上のこと
から得られたクローンが、ニワトリＬＩＦをコードする
遺伝子の一部（２５９ｂｐ）であると判断した。このク
ローンの塩基配列をもとに、クローンテック社のスマー
トＲＡＣＥキット（CLONTECH Smart-RACE kit）を用い
たＲＡＣＥ法により、完全長のニワトリＬＩＦのクロー
ニングを行った。
のクローンのプラスミドを精製した後、オートシークエ
ンサーを用いてそれぞれのクローンの塩基配列を決定し
た。決定された塩基配列をそれぞれデータベースで照合
した結果、１２２クローン中のひとつのクローンが、哺
乳類（ウシ、ブタなど）由来ＬＩＦに相同性（約３０
％）をもつクローンであることがわかった。以上のこと
から得られたクローンが、ニワトリＬＩＦをコードする
遺伝子の一部（２５９ｂｐ）であると判断した。このク
ローンの塩基配列をもとに、クローンテック社のスマー
トＲＡＣＥキット（CLONTECH Smart-RACE kit）を用い
たＲＡＣＥ法により、完全長のニワトリＬＩＦのクロー
ニングを行った。
【００２１】得られたニワトリＬＩＦ遺伝子の塩基配列
に基づいて図４に示される位置に３’用及び５’用のプ
ライマーを用意して、アダプター配列間でＰＣＲを行っ
た。図４の上段は前記で得られた２５９ｂｐの配列を模
式的に示したものであり、下段はその具体的な配列を示
したものである。この結果、ニワトリＬＩＦの全翻訳領
域を含む７８９ｂｐを決定した。決定した塩基配列を図
５に示す新たなプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によ
り得られた断片から確認した。図５の四角の枠の部分は
翻訳領域を示し、斜線の網掛けの部分は前記のサブトラ
クション法により得られた２５９ｂｐの部分を示す。図
５の下段の矢印はＲＴ−ＰＣＲのプライマー部分を示
す。このＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅された５０２ｂｐ
の断片の電気泳動の結果を図６に図面に代わる写真で示
す。図６のレーンＭはマーカーを示し、黒三角印は５０
２ｂｐの断片の位置を示す。得られたニワトリＬＩＦの
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸（１文字表記）を図１に
示す。また、その塩基配列を配列表の配列番号１に、ア
ミノ酸配列を配列番号２に示す。
に基づいて図４に示される位置に３’用及び５’用のプ
ライマーを用意して、アダプター配列間でＰＣＲを行っ
た。図４の上段は前記で得られた２５９ｂｐの配列を模
式的に示したものであり、下段はその具体的な配列を示
したものである。この結果、ニワトリＬＩＦの全翻訳領
域を含む７８９ｂｐを決定した。決定した塩基配列を図
５に示す新たなプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によ
り得られた断片から確認した。図５の四角の枠の部分は
翻訳領域を示し、斜線の網掛けの部分は前記のサブトラ
クション法により得られた２５９ｂｐの部分を示す。図
５の下段の矢印はＲＴ−ＰＣＲのプライマー部分を示
す。このＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅された５０２ｂｐ
の断片の電気泳動の結果を図６に図面に代わる写真で示
す。図６のレーンＭはマーカーを示し、黒三角印は５０
２ｂｐの断片の位置を示す。得られたニワトリＬＩＦの
遺伝子の塩基配列及びアミノ酸（１文字表記）を図１に
示す。また、その塩基配列を配列表の配列番号１に、ア
ミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２２】
【発明の効果】本発明は、外来遺伝子を導入したニワト
リ（トランスジェニックニワトリ）の作成に必須とされ
ているニワトリＬＩＦ及びそれをコードする遺伝子を初
めて提供するものである。本発明は、外来遺伝子を導入
したニワトリ（トランスジェニックニワトリ）の作成に
道を拓くとともに、医薬品を始め有用物質の大量生産に
繋がることが期待される。これまで、トランスジェニッ
クニワトリの作成は、ニワトリＬＩＦが不明であったこ
とから研究の進展やその実用化が極端に遅れているが、
本発明のニワトリＬＩＦの提供により、マウスと同様な
程度の実用化が可能となる。ニワトリは、胚の入手が容
易で、その操作性もよいので、本発明のニワトリＬＩＦ
によりニワトリの胚性細胞の培養系を確立することがで
き、マウスレベル以上にニワトリのトランスジェニック
体の作出が容易になり、実験室レベルはもとより、養鶏
業界では品種改良への利用が可能となり、またニワトリ
の卵は蛋白質の生産性が高く有用物質（医薬品、臨床検
査試薬等）の生産などの実用化が可能となる。本発明
は、畜産動物で最初の実用レベルなトランスジェニック
体の供給に道を拓くものである。
リ（トランスジェニックニワトリ）の作成に必須とされ
ているニワトリＬＩＦ及びそれをコードする遺伝子を初
めて提供するものである。本発明は、外来遺伝子を導入
したニワトリ（トランスジェニックニワトリ）の作成に
道を拓くとともに、医薬品を始め有用物質の大量生産に
繋がることが期待される。これまで、トランスジェニッ
クニワトリの作成は、ニワトリＬＩＦが不明であったこ
とから研究の進展やその実用化が極端に遅れているが、
本発明のニワトリＬＩＦの提供により、マウスと同様な
程度の実用化が可能となる。ニワトリは、胚の入手が容
易で、その操作性もよいので、本発明のニワトリＬＩＦ
によりニワトリの胚性細胞の培養系を確立することがで
き、マウスレベル以上にニワトリのトランスジェニック
体の作出が容易になり、実験室レベルはもとより、養鶏
業界では品種改良への利用が可能となり、またニワトリ
の卵は蛋白質の生産性が高く有用物質（医薬品、臨床検
査試薬等）の生産などの実用化が可能となる。本発明
は、畜産動物で最初の実用レベルなトランスジェニック
体の供給に道を拓くものである。
【００２３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Hiroshima University
<120> Chicken leukemia inhibitory factor (LIF) and the gene
thereof
<130> PA907204
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 789
<212> DNA
<213> Chicken
<400> 1
gcgggggaac atgaatttct gaaaaccctc acacgccgcc cgtctgcgct cggctctccg 60
ggacggcgct caccatgagg ctcatccccg caggtgtcgt gcccttcgtg gccctgctgc 120
tgctgcagag gaggccggtg tccgggcggg cgctgctggg gacgagctct gcgtgtccca 180
ccaacgggct gtgccgggcc aatgtcctgg agcagacccg caggcaggtc gcactgctca 240
acgccaccgc gcaggacctc ttcagcctct atctgaagtg ccagggagag ccgttcagca 300
gcgagagcga ccgcctctgc agccccagtg gcatcttctt cccccccttc cacgtcaacc 360
ggaccaccga gaggaaggag gtgatggtgg ccatgtacaa gctcttcgcc ttcctcaacg 420
cctcactggg gaacatcacc cgcgaccagg aggagctcaa ccccatggcc aaggagctcc 480
tcaaccgcct ccacaacacc accaaaacca cgcggggcct catctccaac ctcacctgcc 540
tgctctgcaa gcactacaac atcttccagg tggacgtgag ctacggggag agcagcaagg 600
acaagagcgc cttcaagaag aagcagcagg gctgccaggt gctcaggaag tacgtgcagg 660
tcatcgccca ggctgctcgt gtcctcctac ctcacctcag ccccgcgtga gccccggccc 720
ccgcgccacg ctaccaccgg gacagcggac atctccttgc acccgtctca gagatgggca 780
cggcgaggc 789
<210> 2
<211> 211
<212> PRT
<213> Chicken
<400> 2
Met Arg Leu Ile Pro Ala Gly Val Val Pro Phe Val Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Gln Arg Arg Pro Val Ser Gly Arg Ala Leu Leu Gly Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Cys Pro Thr Asn Gly Leu Cys Arg Ala Asn Val Leu Glu Gln Thr
35 40 45
Arg Arg Gln Val Ala Leu Leu Asn Ala Thr Ala Gln Asp Leu Phe Ser
50 55 60
Leu Tyr Leu Lys Cys Gln Gly Glu Pro Phe Ser Ser Glu Ser Asp Arg
65 70 75 80
Leu Cys Ser Pro Ser Gly Ile Phe Phe Pro Pro Phe His Val Asn Arg
85 90 95
Thr Thr Glu Arg Lys Glu Val Met Val Ala Met Tyr Lys Leu Phe Ala
100 105 110
Phe Leu Asn Ala Ser Leu Gly Asn Ile Thr Arg Asp Gln Glu Glu Leu
115 120 125
Asn Pro Met Ala Lys Glu Leu Leu Asn Arg Leu His Asn Thr Thr Lys
130 135 140
Thr Thr Arg Gly Leu Ile Ser Asn Leu Thr Cys Leu Leu Cys Lys His
145 150 155 160
Tyr Asn Ile Phe Gln Val Asp Val Ser Tyr Gly Glu Ser Ser Lys Asp
165 170 175
Lys Ser Ala Phe Lys Lys Lys Gln Gln Gly Cys Gln Val Leu Arg Lys
180 185 190
Tyr Val Gln Val Ile Ala Gln Ala Ala Arg Val Leu Leu Pro His Leu
195 200 205
Ser Pro Ala
210
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<223> Description of Artificial Sequence:forward primer
<400> 3
agagccgttc agcagcgaga gc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<223> Description of Artificial Sequence: reverse primer
<400> 4
gcctcgccgt gcccatctct ga 22
【図１】図１は、本発明のニワトリＬＩＦのアミノ酸配
列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
列及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【図２】図２は、本発明のニワトリＬＩＦのアミノ酸配
列を、ヒトＬＩＦ及びマウスＬＩＦのアミノ酸配列と比
較したものである。
列を、ヒトＬＩＦ及びマウスＬＩＦのアミノ酸配列と比
較したものである。
【図３】図３は、サブトラクション法により得られたク
ローンの中から選抜されたクローンの結果を示す図面に
代わる写真である。
ローンの中から選抜されたクローンの結果を示す図面に
代わる写真である。
【図４】図４は、サブトラクション法で得られたクロー
ンからＲＡＣＥ法を行ったときのプライマーの位置及び
その配列を示す。
ンからＲＡＣＥ法を行ったときのプライマーの位置及び
その配列を示す。
【図５】図５は、本発明のニワトリＬＩＦのｃＤＮＡの
塩基配列の構造を模式的に示したもので、矢印は配列を
確認するために行ったＲＴ−ＰＣＲ法のプライマーの位
置を示す。
塩基配列の構造を模式的に示したもので、矢印は配列を
確認するために行ったＲＴ−ＰＣＲ法のプライマーの位
置を示す。
【図６】図６は、ＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた５０
２ｂｐ断片の結果を示す図面に代わる写真である。
２ｂｐ断片の結果を示す図面に代わる写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 14/465 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５
Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
5/10 5/00 Ｂ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｅ
Ｆターム(参考） 4B024 AA10 BA80 CA01 DA02 GA11
GA18 HA20
4B064 AG01 CA19 CC24 DA04 DA11
4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14
BA02 BB40 CA24 CA43
4C084 AA06 AA07 AA13 CA53 NA14
ZB271 ZC611
4C087 AA01 AA03 BB65 BC34 NA14
ZB27 ZC61
4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 EA05
FA74
Claims (19)
- 【請求項１】 ニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）。
- 【請求項２】 ニワトリのＬＩＦが、配列表の配列番号
２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２に示される
アミノ酸の一部が欠失し、他のアミノ酸で置換され、及
び／又は他のアミノ酸が付加したものであってニワトリ
のＬＩＦ活性を有するものである請求項１に記載のニワ
トリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載されるニワトリの
白血病阻止因子（ＬＩＦ）をコードする遺伝子。 - 【請求項４】 ニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）を
コードする遺伝子が、配列表の配列番号１に示される塩
基配列、又は配列番号１に示される塩基配列とストリジ
ェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からな
る請求項３に記載の遺伝子。 - 【請求項５】 請求項３又は４に記載されるニワトリの
白血病阻止因子（ＬＩＦ）をコードする遺伝子の任意の
位置の５〜５０塩基からなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項６】 塩基が１０〜３０塩基である請求項５に
記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項７】 請求項３又は４に記載の遺伝子を用いて
ニワトリの白血病阻止因子（ＬＩＦ）を製造する方法。 - 【請求項８】 請求項３又は４に記載の遺伝子を含有し
てなるベクター。 - 【請求項９】 ベクターが発現ベクターである請求項８
に記載のベクター。 - 【請求項１０】 請求項１又は２に記載のニワトリ白血
病阻止因子（ＬＩＦ）からなるニワトリの分化可能な細
胞の分化防止剤。 - 【請求項１１】 ニワトリの分化可能な細胞が、ニワト
リ胚性幹細胞又は胚性生殖細胞である請求項１０に記載
の分化防止剤。 - 【請求項１２】 請求項１又は２に記載のニワトリ白血
病阻止因子（ＬＩＦ）を分化可能な細胞の培地に添加す
ることからなるニワトリの分化可能な細胞の分化を防止
する方法。 - 【請求項１３】 請求項１又は２に記載のニワトリ白血
病阻止因子（ＬＩＦ）をニワトリの分化可能な細胞を培
養する培地に添加することからなるニワトリの分化可能
な細胞の培養方法。 - 【請求項１４】 ニワトリの分化可能な細胞が、ニワト
リ胚性幹細胞又は胚性生殖細胞である請求項１２又は１
３に記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１又は２に記載のニワトリ白血
病阻止因子（ＬＩＦ）を含有してなるニワトリの分化可
能な細胞を培養するための培地。 - 【請求項１６】 ニワトリの分化可能な細胞が、ニワト
リ胚性幹細胞又は胚性生殖細胞である請求項１５に記載
の培地。 - 【請求項１７】 ニワトリの分化可能な細胞に外来遺伝
子を導入、又は特定の遺伝子の発現を阻止するための改
変をして、当該分化可能な細胞をニワトリ白血病阻止因
子（ＬＩＦ）の存在下に培養してなるトランスジェニッ
クニワトリの作出方法。 - 【請求項１８】 ニワトリの分化可能な細胞が、ニワト
リ胚性幹細胞又は胚性生殖細胞である請求項１７に記載
のトランスジェニックニワトリの作出方法。 - 【請求項１９】 請求項１７又は１８に記載の方法で作
出されたトランスジェニックニワトリ。
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