KR100820292B1 - 까막전복의 액틴 유전자 프로모터를 포함하는 발현벡터 및이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 까막전복(disk abalone) 액틴 유전자의 프로모터를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터의 유용성에 관한 것으로, 보다 구체적으로 까막전복으로부터 분리한 액틴 유전자의 프로모터 부위인 액틴 유전자의 뉴클레오티드 1 내지 533 bp의 서열을 클로닝하여 발현벡터를 제조하였고, 이를 줄무니물고기(zebrafish) 및 포유동물 세포주에 도입하여 발현됨을 확인함으로써 무척추동물 및 전복 유래의 유용 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터에 관한 것이다.

까막전복(disk abalone), 액틴 유전자, 프로모터, 발현벡터, 유용 유전자

Description

까막전복의 액틴 유전자 프로모터를 포함하는 발현벡터 및 이의 용도{EXPRESSION VECTOR COMPRISING ACTIN GENE PROMOTER FROM DISK ABALONE AND USE THEREOF}

도 1은 까막전복 액틴 유전자 프로모터를 포함하는 발현벡터(pHDAP-EGFP)를 얼룩물고기 배간세포(zebrafish embryo)에 미세주입법으로 주입한 후 발현된 유전자를EGFP로 나타낸 사진으로, 도 3a 및 도 3b 는 각각 형질도입 48시간 후 광학현미경 및 형광현미경으로 EGFP를 측정한 사진이다.

도 2는 까막전복 액틴 유전자 프로모터를 포함하는 발현벡터를 포유류 세포주(Vero cell line)에 형질도입 후 발현된 유전자를EGFP로 나타낸 사진으로, 도 2a는 0.8 ug의 pHDAP-EGFP 발현벡터를, 도 2b는 1.6 ug의 pHDAP-EGFP 발현벡터를, 도 2c는 1 ug의 pEGFP-C1 발현벡터를 각각 형질도입한 후 측정한 EGFP 발현 사진이다.

도 3은 상기 발현벡터인 pHDAP-EGFP 벡터의 개열지도 및 제작과정을 나타낸 도면이다.

본 발명은 까막전복(disk abalone) 액틴 유전자의 프로모터를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터의 유용성에 관한 것으로, 보다 상세하게는 까막전복으로부터 분리한 액틴 유전자의 프로모터 부위인 액틴 유전자의 뉴클레오티드 1 내지 533 bp의 서열을 클로닝하여 발현벡터를 제조하였고, 이를 줄무니물고기(zebrafish) 및 포유동물 세포주에 도입하여 발현됨을 확인함으로써 무척추동물 및 전복 유래의 유용 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 발현벡터에 관한 것이다.

전복(Abalone)은 단백질이 풍부하며 지방산, 비타민 및 무기질과 같은 다량의 필수 영양성분이 함유되어 있어 예로부터 환자와 산모의 건강식품으로 이용되어져 온 경제적 가치가 높은 고가의 품종이다. 년간 1회의 산란 및 상품가치로의 성장기간이 최소 3-4년이 소요되기 때문에 빠른 성장률, 성장기간 단축, 년중 다회 산란, 다량 산란 및 산란시 수정율 향상은 전복의 생산성 향상에 중요 요인으로 여겨지고 있다. 이로 인해, 전복 치패의 성장속도 향상을 위한 인공배합사료 개발(Fleming, A. E., et al., Aquaculture, 140: 5-53, 1996; Bautista-Teruel, M. N. & O. M. Millamena., Aquaculture, 178: 117-26, 1999; Lee, S., et al., Journal of Korean Fisheries Society, 32: 391-4, 1999), 수온과 광주기(이정아, 진평 및 김경선, 2001년 춘계수산관련학회 공동학술대회 발표집, 325-6), 중간육성(박찬선, 1997년 남해수산연구소사업보고서, 319-24) 및 수용밀도( Kim, B., et al., Journal of Korean Fisheries Society, 31: 869-74, 1998)의 조절 및 정자농도에 따른 수정률 향상(김재우, 이영돈, 김봉래, 한석중 및 원승환, 2000년 춘계수산관련학회 공동학술발표집, 292-3) 등 다양한 연구들이 이루어지고 있다. 또한, 유전공학 기법에서 발달된 염색체 공학(chromosome engineering) 기법을 이용한 삼 배체 전복의 생산 시도(Jee, Y. J., et al., Journal of Korean Aquaculture, 8: 159-170, 1995 및 Jee, Y. J., et al., Journal of Korean Aquaculture, 10: 123-131, 1997), 어린 참전복내 척추동물 성장 호르몬의 물리적 처리(침지,주사)에 의한 성장 효과가 보고되었다(Morse, D. E., Aquaculture, 39: 263-82, 1984 및 Moriyama, S. & H. Kawauchi, Aquaculture, 229: 469-78, 2004). 또한, 전복을 포함한 다양한 해양 무척추동물의 유용 유전자 검색, 이 유전자를 도입할 수 있는 안정적인 발현벡터 및 이를 확인할 수 있는 세포주 개발에 대한 연구가 요구되고 있다.

액틴(Actin) 유전자는 진핵생물에 존재하는 골격 및 근육 단백질의 구성원으로서 식물에서부터 고등 척추동물까지 가장 잘 보존된 단백질 중 하나이며, 종에 따라 다양한 이형(isoform)을 갖고 있다. 통상적으로, 사람과 초파리에서는 6개의 이형을, 어류에서는 최소한 6-9종의 이형을 갖고 있다. 액틴은 세포골격 유지, 세포이동, 세포분열과 세포내 운동 및 수축 과정과 같은 다양한 생물학적 기능에 관여하는 복합 단백질이다. 현재, 다양한 해양 무척추동물로부터 액틴 유전자가 분리되고 있으나, 그 특징에 대해서는 아직 완전하게 밝혀지지 않았다. 예를 들면, 대서양 굴(Crassostrea gigas)에서는 2가지의 액틴 유전자 및 프로모터 부위의 기능분석을 통해 무척추동물의 유전자를 이용한 발현벡터의 제작 가능성을 확인하였고(Cadoret, J. P., et al., FEBS Letters, 460: 81-5, 1999), 삿갓조개(Patella vulgata)의 경우 7개의 액틴이 존재하며 3'-비번역 부위(UTR) 다양성에 의해 4가지 형태의 서브타입 액틴으로 분류하였고(Van Loon, A. E., et al., Roux's Archives of Developmental Biology, 202: 77-84, 1993), 가리비(Placopecten magellanicus)의 경우 액틴 유전자군이 12-15개가 존재한다고 보고되었다(Patwary, M. U., et al., Journal of Shellfish Research, 15: 265-70, 1996).

특정 형질을 갖는 형질전환체를 생산하기 위해서는 특정 유전자를 숙주내로 안정적으로 전달하기 하는 것이 필수적이며, 이를 위해 초파리에서 어류에 이르는 다양한 척추동물에서 다양한 생물학적 기초 연구가 이루어져왔다. 예를 들면, 사람 사이토메갈로바이러스 IE(human cytomegalovirus immediate early) 유전자 프로모터 및 시미안바이러스(simian virus) 40 IE 유전자 프로모터는 진핵세포에서 강한 전사활성을 갖고 있어 강력하고 안정적인 이종 단백질 또는 형질을 유도하는데 사용되고 있다. 그러나, 이러한 강력한 유전자 프로모터 및 유용 유전자를 조합하여 특정 숙주내에 발현시킬 경우, 유전자는 발현되나 유전자의 생리학적 변화가 관찰되지 않는 경우가 종종 발생하게 된다. 이는 척추동물 또는 척추동물 바이러스 유전자 프로모터가 숙주세포 내에서 인지되지 않거나, 또는 유용 유전자가 발현이 되더라도 세포내에서 기질 특이적 단백질 작용이 이루어지지 않기 때문이다. 전세계적으로 전복의 유용 유전자 확보 및 이들 유전자의 발현을 조절하는 프로모터에 관한 연구는 아주 미미한 실정이다. 그 예로, dwarf surfclam내 vesicular stomatitis virus의 외피 단백질을 갖는 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달, 초파리의 베타-액틴 유전자 프로모터를 이용한 전복내 외래 유전자 전달을 통한 형질전환체 생산을 위한 기초 연구가 이루어졌다. 그러나, 이들 또한 주로 포유류 또는 이종생물체 유래의 유전자 프로모터 영역을 포함하고 있어 숙주세포내에 서 발현되나, 숙주 특이적 단백질 작용에 의한 발현의 한계성을 유발하였다. 따라서, 해양무척추 동물 특히 전복내에 있는 유용 유전자를 특이적으로 발현시키기 위해서는 포유류 유래 또는 이종 생물체 유래의 유전자 프로모터가 아닌 전복 자체에서 유래된 유전자의 프로모터 부위를 확보하는 것이 중요하며, 이를 이용한 발현벡터의 개발이 무엇보다도 필요하다.

이에, 본 발명자들은 까막전복으로부터 근육 단백질의 구성요소 중 하나인 액틴 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위를 발현벡터에 클로닝하였고, 이를 얼룩물고기 수정난 및 포유동물 세포주에 형질도입하여 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 무척추동물, 바람직하게는 까막전복 유래의 액틴 유전자를 특이적으로 발현하는 프로모터를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 까막전복 유래의 액틴 유전자 프로모터를 포함하는 까막전복 액틴 발현용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 형질전환체를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 까막전복 유래의 액틴 유전자 프로모터를 포함하는 까막전복 액틴 발현용 벡터를 제공한다.

염기서열분석 결과, 까막전복으로부터 분리한 액틴 유전자는 뉴클레오티드 1 내지 533 bp의 액틴 프로모터 서열, 뉴클레오티드 535 내지 540 bp 및 뉴클레오티드 1117 내지 1556 bp의 액틴 단백질 코딩서열, 및 뉴클레오티드 657 내지 877 bp의 인트론 서열을 포함하고 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조). 이때, 사용된 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 서열번호 5인 정방향 프라이머(HactR1: 5'-GGAGTGTTGAAGGTCTCGAACATGATCTTGGTCAT-3') 및 서열번호 6인 역방향 프라이머(HactR2: 5'- GCCACATACATAGCTGGAGTGTTGAAGGTCTCGAA-3')를 이용하는 것이 바람직하다. 그 결과, 표 2에서와 같이 1863 bp의 크기를 가진 전장 액틴 유전자 서열(서열번호 1)을 확인할 수 있었다. 상기 서열을 바탕으로, 무척추동물, 바람직하게는 전복 엑틴 유전자를 특이적으로 발현하는 발현벡터를 제조하기 위하여, 상기 서열 중 액틴 유전자의 프로모터 서열을 클로닝하였으며, 이때, 사용된 프라이머는 정방향 프라이머(5′-GAGAGAATTCGGATTTAGCACTACAATGTTC-3′, 서열번호 7) 및 역방향 프라이머(5′-GAGAGGATCCGGTTGTAGGTAGTTGTGTGAG-3′, 서열번호 8)를 이용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니며, 상기 프로모터 부위 서열을 포함하며 상기 액틴 유전자의 발현을 증가시킬 수 있는 액틴 유전자의 5' 일부 서열을 증폭할 수 있는 어떤 프라이머도 사용가능하다. 또한, 상기 발현벡터는 상기 프로모터 부위의 서열 외에 추가적으로 리포터 유전자를 포함하는 것이 바람직하며, 이때 사용가능한 리포터 유전자는 특별히 제한되는 것은 아니나, 녹색형광단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP), 루시퍼라제(luciferase), 알카라인 포스파타 제(alkaline phosphatase), CAT(chloramphenicol acetyl transferase) 및 갈락토시다제(galactosidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이는, 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입되었을 때 얼마나 발현되는지 측정할 수 있기 때문이다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 도입하여 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

상기 발현벡터가 생체내에서 실질적으로 액틴 유전자를 특이적으로 발현시키는지 알아보기 위하여, 상기 발현벡터를 얼룩물고기(Zebrafish) 및 포유동물 세포주에 형질도입하여 발현양상을 조사한 결과, 발현상 차이는 보였으나 리포터 유전자인 EGFP가 얼룩물고기의 수정난 및 포유동물 세포주인 Vero(African green monkey kidney 에서 유래된 세포주)에서 모두 발현됨을 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조). 이때, 상기 Vero세포주와는 달리, 얼룩물고기 수정난에서는 EGFP가 불규칙하게 발현되었는데, 이는 상기 얼룩물고기의 수정난 배간세포에 외래유전자가 주입된 경우, 배간세포의 세포분열 과정에서 상기 외래유전자가 모든 세포에 분배되지 않았거나, 각 세포에 삽입된 외래유전자의 복제수의 차이에 의한 것으로 사료된다. 또한, 무척추동물인 전복에서 분리된 액틴 유전자의 프로모터가 전사시 전복 특이적 전사와 관련된 trans element 또는 factor가 척추동물모델인 얼룩물고기에서는 존재하지 않기 때문인 것으로 사료된다.

아울러, 본 발명은

1) 까막전복 유래의 액틴 유전자 프로모터를 포함하는 발현벡터를 숙주에 도 입하여 형질전환시키는 단계 및

2) 형질전환된 상기 숙주로부터 발현되는 형광표지인자를 측정하는 단계를 포함하는 형질전환체 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 숙주로는 무척추동물, 바람직하게는 전복을 이용할 수 있으며, 포유동물 및 어류와 같은 척추동물을 이용할 수 있다. 또한, 단계 1)에 있어서 상기 발현벡터를 숙주에 도입하는 방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 미세주입법, 전기천공법 및 일렉트로퓨전법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 이는, 생체내 조직으로 상기 발현벡터를 효과적으로 주입할 수 있기 때문이다. 또한, 단계 1)의 발현벡터는 상기 액틴 유전자 프로모터를 포함하며 이 프로모터의 활성에 영향을 주지 않는 한 어떤 벡터도 사용가능하다. 또한, 상기 발현벡터는 상기 숙주내에 존재하는 유용 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이때 사용가능한 유용 유전자로는 Mx, SOD 및 성장촉진인자(growth factor)를 이용할 수 있다.

또한, 단계 2)의 형광표지인자는 특별히 제한되는 것은 아니나, 녹색형광단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP), 루시퍼라제(luciferase), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase), CAT(chloramphenicol acetyl transferase) 및 갈락토시다제(galactosidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 까막전복 유래의 액틴 유전자 분리 및 서열분석

까막전복으로부터 유래된 액틴 유전자를 분리하기 위하여, 우선　살아있는 전복의 근육 조직 100 mg을 절단한 후 20 ul 의 proteinase K (20 mg/ml, QIAGEN, 독일) 및 180 ul의 분쇄용액을 처리하여 게놈 DNA를 분리하였다. 까막전복의 액틴 유전자를 증폭하기 위하여, 데이터베이스에 등록되어 있는 포유류 또는 무척추동물의 베타-액틴 유전자 서열을 다중정렬하여 유전자 서열 중 가장 잘 보존된 서열을 기초로 서열번호 3인 정방향 프라이머(ActF: 5′-ATCATGTTYGAGACMTTCAAC-3′) 및 서열번호 4인 역방향 프라이머(ActR: 5′-CCARGAADGAWGGCTGGAAVAC-3′)를 각각 설계하였다. 구체적으로, 전복에서 추출한 100 ng의 게놈 DNA, 정방향(ActF) 및 역방향(ActR) 프라이머, 10×Cloned Pfu 용액, dNTP, 5 unit의 Pfu 중합효소(Stratagene, USA)를 혼합하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 45초, 50℃에서 45초, 72℃에서 1분간 30회 반복하였다. 상기에서 얻은PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 약 850 bp의 DNA 단편이 증폭됨을 확인한 후, 겔로부터 상기 DNA를 분리 및 정제하였다. 정제된 상기 DNA를 제한효소 SmaI으로 잘린 플라스미드 벡터 pUC 19(Stratagene, 미국)에 클로닝하였다.

까막전복의 액틴 유전자 서열을 분석하기 위하여, 디데옥시 체인 터미네이션(dideoxy chain termination)방법(Sanger, F., S. Nicken 및 A. R. Coulson, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74: 5463-5467)에 의한 염기서열 결정키 트(Big dye terminator cycle sequencing kit, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 액틴 유전자의 서열을 분석하였다. 그 결과, 하기 표 1에서와 같이 까막전복의 근육조직으로부터 439 bp의 서열을 가진 액틴 유전자를 분리할 수 있었다.

(표 1) 까막전복의 근육조직으로부터 분리한 액틴 유전자 서열

ATCATGTTCGAGACCTTCAACTCTCCAGCTATGTATGTGGCCATCCAGGCTGTTCTGTCT　　 60

CTGTACGCTTCTGGTCGTACCACGGGTATTGTTTTGGACTCTGGTGATGGTGTCACCCAT　　 120　

ACTGTCCCCATCTATGAAGGTTATGCTCTTCCCCACGCCATCATGAGATTGGATCTTGCT　　 180

GGTCGAGACCTGACTGATTACCTAATGAAGATCCTTACTGAACGTGGCTACTCCTTCACC　　 240

ACCACTGCTGAGAGAGAAATCGTCAGAGACATCAAGGAGAAACTGTGCTACATCGCCCTT　　 300

GACTTCGAGCAGGAAATGGCAACTGCCTCATCATCTTCCTCCCTGGAGAAGAGCTACGAG　　 360

TTGCCTGATGGTCAAGTAATCACCATTGGTAACGAGAGATTCCGTTGTCCAGAGGCCCTC　　 420

TTCCAGCCTTCCTTCTTGG　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 439

< 실시예 2> 액틴 유전자의 프로모터 부위 서열의 동정

까막전복의 액틴 유전자 발현을 조절하는 프로모터 부위 서열을 동정하기 위하여 Long and Accurate PCR을 실시하였다. 우선, 프로모터 부위 서열을 증폭하기 위해, <실시예 1>에서 분석된 까막전복의 액틴 유전자 서열을 기초로 하여 서열번호 5인 정방향 프라이머(HactR1: 5'-GGAGTGTTGAAGGTCTCGAACATGATCTTGGTCAT-3') 및 서열번호 6인 역방향 프라이머(HactR2: 5'-GCCACATACATAGCTGGAGTGTTGAAGGTCTCGAA- 3')을 각각　설계하였다. 구체적으로, 까막전복 근육조직으로부터 분리한 5 ug의 게놈 DNA를 50 unit의 Hind III와 Eco RI으로 각각 무작위로 절단한 후 각각 절단된 게놈 DNA를 제한효소 인식부위를 포함하고 있는 이중가닥 합성용 올리고뉴클레오티드(double strand synthetic oligonucleotide)인 Hind III cassette와 Eco RI cassette에 연결하였다. 연결된 산물 1 ul을 증류수에 넣고 94℃에서 10분간 변성하였다. 여기에 제한효소 cassette 서열에 상보적인 서열을 갖고 있는 C1 프라이머 및 HdactR1 프라이머, 10×LA taq 용액(MgCl₂ 포함), 2.5 unit의 LA taq 중합효소를 첨가하여 1차 PCR을 수행하였다. 1차 PCR은 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간 30회 반복하였다. 1차 증폭된 PCR 산물을 멸균 증류수에 10배 희석하고 이 중 1 ul를 수취하여 2차 PCR을 수행하였다. PCR은 정방향 프라이머(C2) 및 역방향 프라이머(HdactR2)를 제외하고 상기와 동일한 조건으로 증폭하였다. 증폭된 산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인한 결과, Hind III로 절단하고 cassette을 연결하여 증폭된 산물은 약 1100 bp이고, EcoRI으로 절단하여 cassette을 연결하여 증폭된 산물의 크기는 900 bp임을 확인하였다. 각 PCR 산물은 아가로스 겔에 전기영동하여 DNA를 정제한 후 SmaI으로 절단된 pUC 19 벡터에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. 또한, 염기서열이 결정된 까막전복의 액틴 유전자 및 프로모터 부위 서열을 SIGNALSCAN 및 Splice site prediction 프로그램을 이용하여 액틴 유전자의 발현에 관여하는 프로모터 부위, 전사조절 부위 및 인트론-엑손 junction 부위를 각각 측정하였다. 그 결과, 하기 표 2에서와 같이 까막전복의 액 틴 유전자 및 프로모터 부위 서열은 전체 1863 bp(서열번호 1)이며, 뉴클레오티드 1-6bp 및 792-797bp 위치에 각각 제한효소인 Eco RI 및 Hind III 부위가 있음을 확인하였다(표 2).

(표 2) pUC19 벡터에 클로닝된 까막전복 액틴 유전자 및 프로모터 서열

GAATTCTggatttagcactacaatgttctataactaacgaagtgttaaacagattttaga　　　 60

EcoRI

agctatgcatttcccaataatgctgacatatgcatttaacttaacatatttatcaaacca　　　 120

　　　　　　　　　　　　 CAAT box

gcatcgtttgcttacatacattctcgtcagctcaaggagaacttcccattttccggcatc　　　 180

ataccacgtggcgctctacctgcttcggggataggggaaggggctacttccttctagggg　　　 240

gaaaagggtgatcagctcgccttcggtagctgagtgcagatgacccccgactgtgacaca　　　 300

ttcttccacatgtacacatgaaaggctgttatgcaatatcatacataagaagggtatatt　　　 360

tattacaattacattggttacgtttctattattcccaaacacaatctgattggtcgccta　　　 420

　　　　　　　　　　　 CAAT box 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 CAAT box

ctaatgggggatgtataaaagacgcctggatgttaacctcgatagtgcatccgctttcag　　　 480

　　　　　　　　　　　 TATA box

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 M　 D　

tcttcagttgactcgcatcgtctttcctgtttctcacacaactacctacaaccATGGATG　　　 540

D　 D　 V　 A　 A　 L　 V　 C　 D　 N　 G　 S　 G　 M　 C　 K　 A　 G　 F　 A　

ATGATGTTGCTGCATTGGTCTGTGACAACGGCTCCGGTATGTGCAAGGCTGGTTTCGCAG　　　 600

G　 D　 D　 A　 P　 R　 A　 V　 F　 P　 S　 I　 V　 G　 R　 P　 R　 H　 Q　　　

GCGACGACGCTCCCAGAGCTGTTTTCCCTTCCATCGTCGGACGCCCAAGACATCAGgtaa　　　 660

caccgtttattattaatatgaaaataaataggtttaatacctgaaatatttagtttaccc　　　 720

gggtgtttgagaaggcattataatacagttaagtattgtaacacgatgacgtgataattg　　　 780

aattattagagaagctttcaacagatcagaatcgagtcgcccatcttttgtctctgtaga　　　 840

　　　　　　　　　　 HindIII

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 G　 V　 M　 V　 G　 M　 G　 Q 　

ttacacgtaaataatgacaaatgatttcgtgtttcagGGCGTGATGGTCGGTATGGGACA　　　 900

　 K　 D　 S　 Y　 V　 G　 D　 E　 A　 Q　 S　 K　 R　 G　 I　 L　 T　 L　 K　 Y　

GAAAGACAGCTATGTCGGTGACGAGGCTCAGTCCAAGAGAGGCATCCTTACGCTCAAGTA　　　 960

　 P　 I　 E　 H　 G　 I　 V　 T　 N　 W　 D　 D　 M　 E　 K　 I　 W　 H　 H　 T

TCCCATCGAGCATGGTATCGTCACAAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCATCACAC　　　 1020

　 F　 Y　 N　 E　 L　 R　 V　 A　 P　 E　 E　 H　 P　 V　 L　 L　 T　 E　 A　 P

CTTCTACAACGAGCTCCGAGTGGCTCCAGAGGAGCACCCTGTCCTCCTGACAGAGGCTCC 　　 1080

　 L　 N　 P　 K　 A　 N　 R　 E　 K　 M　 T　 Q　 I　 M　 F　 E　 T　 F　 N　 S

TCTCAACCCAAAGGCCAACCGTGAAAAGATGACCCAGATCATGTTCGAGACCTTCAACTC　　　 1140

　 P　 A　 M　 Y　 V　 A　 I　 Q　 A　 V　 L　 S　 L　 Y　 A　 S　 G　 R　 T　 T

TCCAGCTATGTATGTGGCCATCCAGGCTGTTCTGTCTCTGTACGCTTCTGGTCGTACCAC　　　 1200

　 G　 I　 V　 L　 D　 S　 G　 D　 G　 V　 T　 H　 T　 V　 P　 I　 Y　 E　 G　 Y

GGGTATTGTTTTGGACTCTGGTGATGGTGTCACCCATACTGTCCCCATCTATGAAGGTTA　　　 1260

　 A　 L　 P　 H　 A　 I　 M　 R　 L　 D　 L　 A　 G　 R　 D　 L　 T　 D　 Y　 L

TGCTCTTCCCCACGCCATCATGAGATTGGATCTTGCTGGTCGAGACCTGACTGATTACCT 　　 1320

　 M　 K　 I　 L　 T　 E　 R　 G　 Y　 S　 F　 T　 T　 T　 A　 E　 R　 E　 I　 V

AATGAAGATCCTTACTGAACGTGGCTACTCCTTCACCACCACTGCTGAGAGAGAAATCGT　　　 1380

　 R　 D　 I　 K　 E　 K　 L　 C　 Y　 I　 A　 L　 D　 F　 E　 Q　 E　 M　 A　 T

CAGAGACATCAAGGAGAAACTGTGCTACATCGCCCTTGACTTCGAGCAGGAAATGGCAAC　　　 1440

　 A　 S　 S　 S　 S　 S　 L　 E　 K　 S　 Y　 E　 L　 P　 D　 G　 Q　 V　 I　 T

TGCCTCATCATCTTCCTCCCTGGAGAAGAGCTACGAGTTGCCTGATGGTCAAGTAATCAC　　　 1500

　 I　 G　 N　 E　 R　 F　 R　 C　 P　 E　 A　 L　 F　 Q　 P　 S　 F　 L　 G　 M

CATTGGTAACGAGAGATTCCGTTGTCCAGAGGCCCTCTTCCAGCCTTCCTTCTTGGGTAT　　　 1560

　 E　 T　 V　 G　 I　 H　 E　 T　 T　 F　 N　 S　 I　 M　 R　 C　 D　 V　 D　 I

GGAAACAGTTGGTATTCACGAAACCACATTCAACTCCATTATGAGGTGCGATGTTGATAT　　　 1620

　 R　 K　 D　 L　 Y　 A　 N　 T　 V　 L　 S　 G　 G　 T　 T　 M　 F　 P　 G　 I　

CCGTAAGGACTTGTACGCCAACACTGTTCTCTCAGGGGGTACCACCATGTTCCCTGGTAT　　　 1680

　 A　 D　 R　 M　 Q　 K　 E　 I　 T　 S　 L　 A　 P　 S　 T　 M　 K　 I　 K　 I

CGCCGACAGAATGCAGAAGGAGATCACATCTCTTGCCCCAAGCACAATGAAGATCAAGAT　　　 1740

　 I　 A　 P　 P　 E　 R　 K　 Y　 S　 V　 W　 I　

CATCGCACCCCCAGAGAGGAAATACTCCGTCTGGATCGGTGGCTCCATCCTTGCCTCTCT　　　 1800

GTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCACCAAGCAGGAGTA

CGCCGACAGAATGCAGAAGGAGATCACATCTCTTGCCCCAAGCACAATGAAGATCAAGAT　　　 1740

　 I　 A　 P　 P　 E　 R　 K　 Y　 S　 V　 W　 I　

CATCGCACCCCCAGAGAGGAAATACTCCGTCTGGATCGGTGGCTCCATCCTTGCCTCTCT　　　 1800

GTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCACCAAGCAGGAGTA

또한, GENSCAN 프로그램 분석으로 클로닝된 상기 까막전복의 액틴 유전자는 1-533 bp의 5' 단편(서열번호 2)을 가지고 있으며, 2개의 단백질 암호화 부위(엑손 1: 뉴클레오티드 535-540bp에 위치 및 엑손 2 일부 서열: 뉴클레오티드 1117-1556 bp에 위치)가 221 bp(뉴클레오타이드 657-877bp에 위치)의 인트론에 의하여 나누어져 있음을 확인하였다. 또한, Neural network 프로그램을 이용하여 까막전복 액틴 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위를 예측한 결과, 프로모터 부위 서열은 424-474 nt로 예측되었고, 432-439 nt에 TFIID가 결합하는 염기서열(TATATAA)인 TATA box 및 465 nt에서 전사시작부위(transcription start site)를 확인하였다. 또한, SIGNALSCAN 프로그램을 이용하여 전사에 관여하는 다양한 인자를 확인한 결과, 3개의 CAAT box가 73 nt, 373 nt 및 409 nt로 예측되었다. 또한, 까막전복에서 분리된 액틴 유전자의 프로모터 서열을 붉은전복(red abalone)의 액틴 유전자의 프로모터 서열과의 상동성을 비교한 결과 81.5%의 서열 상동성을 보였으며, 까막전복의 프로모터 및 붉은전복의 프로모터 모두 동일한 전사시작 부위(+1)에서 상위 60 bp의 뉴클레오타이드 서열내에 CAAT box 및 TATA box가 잘 보존되어 있음을 확인할 수 있었다(표 3).

(표 3)

까막전복 1 GAATTCTGGATTTAGCACTACAATGTTCTATAACTAACGA------AGTGTTAAACAGAT

붉은전복 1 GAAGTTTGGATATAACTTTACAATGCTTTATAACTGATGAGTAGTAAGCGTTGTATGGAT

*** * ***** ** * ******* * ******* * ** ** *** * ***

까막전복 55 TTTAGAAGCTATGCATTTCCCAATAATGCTGACATATGCATTTAACTTAACATATTTATC

붉은전복 61 TTTAGAATCTATGCATTTCCCAATAATGCTGATATATTCATTTAACTTAATTTATT----

******* ************************ **** ************ ****

까막전복 115 AAACCAGCATCGTTTGCTTACATACATTCTCGTCAGCTCAAGGAGAACTTCCC-ATTTTC

붉은전복 117 --ACCAGCATCACATTCTTGCATTCATGCTCGTCAGCTCGAGAAGCGCTTCCCCATTCTC

********* * *** *** *** *********** ** ** ****** *** **

까막전복 174 CG-GCATCATACCACGTGGCGCTCTACCTGCTTCGGGGATAGGGGAAGGGGCTACTTCCT

붉은전복 175 CGCGCACCATACCACGTGGCGTTGTCCTTGCTTCGGGAACGGGGGTAGGGGGTACTTACT

** *** ************** * * * ********* * **** ***** ***** **

까막전복 233 TCTAGGGGGAAAAGGGTGATCAGCTCGCCTTCGGTAGCTGAGTGCAGATGACCCCCGACT

붉은전복 235 TCTAGGGG--AAAGAGAGATCAG-------------------TGCAGATCACCCCCGACT

******** **** * ****** ******* **********

까막전복 293 GTGACACATTCTTCCACATGTACACATGAAAGGCTGTTATGCAATATCATACATAAGAAG

붉은전복 274 GTGACACATTCTTCCACATGTACACATGAAAGGTTGTTATGCAATATAATACATTAGAAG

********************************* ************* ****** *****

까막전복 353 GGTATATTTATTACAATTACATTGGTTACGTTTCTATTATTCCCAAACACAATCTGATTG

붉은전복 334 GGTATATTTATTACAATTACAATGGTTACGTTTCTATTATTCTCAAACACAATCTGATTG

********************* ******************** *****************

까막전복 413 GTCGCCTACTAATGGGGGATGTATAAAAGACGCCTGGATGTTAACCTCGATAGTGCATCC

붉은전복 394 GTCGCCTACTAATGGGGTATGTATAAAAGACGCCTGGGTCAGAACATCGATATTGCATCC

***************** ******************* * *** ****** *******

까막전복 473 GCTTTCAGTCTTCAGTTGACTCGCATCGTCTTTCCTGTTTCTCACACAACTACCTACAAC

붉은전복 454 GCTTTCAGTCTTCAGCTGACAC--ATCGTCTTTCCCGTTTCTCACACAGCAACCTACAAC

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까막전복 533 C

붉은전복 512 C

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< 실시예 3> 액틴 유전자 프로모터 부위를 포함하는 발현벡터의 제조

까막전복의 액틴 유전자 프로모터 부위 서열이 실질적으로 액틴 유전자를 발현시키는지 알아보기 위하여, 상기 까막전복 액틴 유전자의 프로모터 부위 서열을 발현벡터에 클로닝하였다. 구체적으로, 상기 액틴 유전자의 게놈 서열 중 액틴 유전자의 엑손 1 서열내 단백질 시작 코돈 앞의 533 bp(서열번호 2)까지 증폭하여 클로닝하였다.

이때, 사용된 정방향 프라이머(5′-GAGAGAATTCGGATTTAGCACTACAATGTTC-3′, 서열번호 7) 및 역방향 프라이머(5′-GAGAGGATCCGGTTGTAGGTAGTTGTGTGAG-3′, 서열번호 8)에는 각각 제한효소인 Eco RI 및 Bam HI을 포함시켜 설계하였다. 증폭된 PCR 산물 및 EGFP 유전자를 가진 프로모터가 없는 벡터인 pEGFP-1(Clontech, USA)을 제한효소인 Eco RI 및 Bam HI으로 각각 절단한 후 연결효소를 이용하여 조합하였다. 이를 대장균에 형질전환시킨 후, 카나마이신(30 mg/ml)이 함유된 LB 플레이 트에 배양하여 클론이 형성됨을 관찰하였다. 상기 클론을 카나마이신이 첨가된 LB broth배지에 배양하였고, 이로부터 플라스미드 DNA를 분리하였고 염기서열분석을 통해 최종적인 pHDAP-EGFP발현벡터를 완성하였다. 상기 발현벡터는 알카라인 분쇄방법으로 플라스미드 DNA를 추출한 후, 미세주입 및 세포주 형질도입에 사용하였다.

< 실시예 4> 생체내 도입된 발현벡터의 발현양상 분석

<4-1> 얼룩물고기에서의 발현양상

까막전복의 액틴 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 발현벡터가 얼룩물고기의 수정난에서 액틴 유전자를 발현시키는지 알아보기 위하여, <실시예 3>에서 제작한 pHDBA-EGFP 발현벡터를 얼룩물고기 수정난에 미세주입하여 분석하였다. 구체적으로, 얼룩물고기(Zebrafish)는 28℃에서 낮 14시간 및 밤 10시간을 주기로 성장시켰고, 암, 수는 교배시키기 전에 나누어 키웠고, 교배시에는 성체가 알을 먹는 것을 방지하기 위하여 작은 탱크의 바닥부분을 제거하여 얼룩물고기의 수정난보다 조금 큰 사이즈의 철망을 바닥에 부착하고, 이를 다른 탱크와 겹쳐 철망바닥보다 조금 높게 물을 채운 후 수정하였다. 수정시, 강한 형광등으로 수정의 효과를 높였으며 수정된 알은 20 ppm 메틸렌 블루를 첨가한 에그워터로 2-3회 세척하여 알 주위의 박테리아와 난질이 좋지 않은 수정난을 제거하였다. 미세주입을 위해 수정난을 해부현미경 관찰하에서 세포층이 위로 오도록 수정난을 정렬하여 준비하였다. 이어, 정렬된 난을 제1세포기 수정난에 마이크로인젝터 (Microinjector, World precison Instrument, Inc)를 이용하여 미세주입하였다. 미세바늘은 1mm 유리관을 이용하여 바늘의 끝이 직경 3 ㎛ 되도록 절단하였고, 미세주입을 위한 DNA는 0.5% 페놀레드(phenol red)가 함유된 0.1M KCl 용액과 혼합하여 약 100-200 ul로 제조된 pHDBA-EGFP를 1세포기의 얼룩물고기의 수정난에 미세주입하였다. 미세주입된 수정난을 회수하여 28℃에서 배양하였으며, 24-48시간 경과 후 난막을 제거하여 형광현미경하에서 주입된 유전자의 발현양상을 관찰하였다.

그 결과, 도1에서와 같이 일부 근육세포에서 형광단백질의 발현을 확인할 수 있었다. 이는, 전복으로부터 분리된 액틴 유전자의 프로모터가 정상적으로 액틴 유전자의 전사조절에 관여하고 있음을 의미한다.

<4-2> 포유동물 세포주에서의 발현양상

실시예 <4-1>에서와 같이, 상기 발현벡터가 포유동물 세포주에서도 액틴 유전자를 발현시키는지 확인하기 위해, Vero 세포주(African green monkey kidney에서 유래된 세포주)를 10% FBS가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Eagle's Minimal Medium) 배지 및 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 형질도입 하기 전, 95 % 정도로 자란 상기 세포를 EDTA-PBS 및 EDTA-PBS/Trypsin 용액을 처리하여 세포를 떼어낸 후 세포 수를 2×10⁵(cells/ml)로 맞춰서 24-웰 플레이트에 항생제를 첨가하지 않은 EMEM 배지상에서 배양하였다. 0.8 ug 및 1.6 ug의 pHDBA-EGFP를 각각 lipofectamine 2000(Invitrogen)과 FBS가 포함되지 않은 MEM 배지에 희석하여 실온에서 5분간 방치한 후, 두 혼합물을 다시 20 분간 실온에서 방치하여 DNA-lipofectamine 혼합물을 준비하였다. 이와 함께, 양성대조군인 CMV 프로모터를 가진 pEGFP- C1(Clontech, USA)을 상기와 같은 방법으로 준비하였다. 전날 배양시킨 세포주의 배양액을 제거한 후, 상기 혼합물을 각 웰에 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 혼합물을 각 웰에서 제거한 후 각 웰에 FBS와 항생제(ampicillin and streptomycin, 100 mg/ml)가 첨가된 MEM 배지를 넣어 배양하였고, 24-48시간 간격으로 리포터 유전자인 EGFP의 발현양상을 형광현미경으로 관찰하였다.

형질도입 후 48시간째 때 상기 세포주에 트립신을 처리하여 세포를 떼어낸 후, 형광현미경으로 리포터 유전자의 발현양상을 관찰한 결과, 리포터 유전자의 발현이 상기 실시예 <4-1>의 동물모델인 얼룩물고기에서 일부 관찰된 것과는 달리, 대부분의 세포에서 형광단백질이 발현됨을 확인하였다(도 2). 또한, 양성대조군인 CMV 프로모터와 발현 세기를 비교했을 때 유의한 수준의 발현을 관찰할 수 있었다(도 2).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의한 까막전복 유래의 액틴 유전자 프로모터를 포함하는 발현벡터는 까막전복 및 다양한 무척추동물의 유용 유전자를 특이적으로 발현시키는 발현벡터로 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 까막전복의 액틴 유전자의 프로모터로서, 서열번호 2의 1 내지 533 bp 의 핵산서열을 포함하는 까막전복 액틴 발현용 벡터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 벡터는 도 3에 도시된 개열지도를 갖는 pHDAP-EGFP인 것인, 벡터.
3. 제 1항 또는 제 2항의 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환된 형질전환체.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 숙주는 무척추동물, 포유동물 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 형질전환체.
5. 제 3항에 있어서, 상기 숙주는 얼룩물고기(zebrafish) 및 포유동물 세포주(Vero)인 것인 형질전환체.

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