CN108272855A - 一种抗禽白血病病毒中药 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗禽白血病病毒中药，其特征在于：其组分为黄芪。其制备方法包含以下步骤：称取黄芪，用蒸馏水浸泡1‑2h，大火加热，沸腾后换成文火加热，从沸腾时开始计时，煎煮0.5‑1h后用纱布过滤，收集滤液，余下的药渣中加入蒸馏水，大火加热至沸腾后换成文火并开始计时，煎煮0.5‑1h收集滤液，剩下的药渣再用蒸馏水煮30‑50min，收集滤液，将三次滤液合并，用砂锅加热浓缩至药液含生药量为1g/mL，100‑110℃高压灭菌30‑40min，置4℃冰箱备用。
Description
技术领域
本发明涉及兽医药的技术领域，具体涉及一种抗禽白血病病毒中兽药。
背景技术
禽白血病是家禽三大肿瘤病之一，因其能引起具有传染性肿瘤，且能使机体产生严重的免疫抑制，继发感染其它疾病，对养禽业危害巨大。该病尚无有效疫苗，控制只能靠种群净化，故筛选到能抗禽白血病病毒的特效药对该病的防治具有重要意义。
目前临床上主要用化学药物进行抗肿瘤治疗，疗效显著，但价格昂贵，毒副作用大，相比之下，毒副作用小、药性可靠、价格低廉的中药引起了学者的广泛关注，抗肿瘤中药的研究也成为研究热点。在此背景下，出现了许多中药复方治疗肿瘤疾病的方案，但鲜有针对禽白血病的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种抗禽白血病病毒的中药，其疗效显著、毒副作用小、药性可靠、价格低廉，为抗禽白血病病毒提供了新的解决方案。
本发明的技术方案是：一种抗禽白血病病毒中药，其组分为黄芪。
所述的中药其剂型为黄芪药液。
所述的黄芪药液的最大安全浓度为62.5mg/mL。
所述的一种抗禽白血病病毒中药的制备方法，包含以下步骤：称取黄芪，用蒸馏水浸泡1-2h，大火加热，沸腾后换成文火加热，从沸腾时开始计时，煎煮0.5-1h后用纱布过滤，收集滤液，余下的药渣中加入蒸馏水，大火加热至沸腾后换成文火并开始计时，煎煮0.5-1h收集滤液，剩下的药渣再用蒸馏水煮30-50min，收集滤液，将三次滤液合并，用砂锅加热浓缩至药液含生药量为1g/mL，100-110℃高压灭菌30-40min，置4℃冰箱备用。
用煎煮法制备黄芪药液，将药液和禽白血病病毒同时作用于DF-1细胞，用荧光定量PCR方法检测黄芪对禽白血病病毒复制的影响。
本发明的有益效果：本发明制备的黄芪药液对禽白血病病毒的复制有明显的抑制作用，首次发现了防治禽白血病的单味中药，可应用于临床，对禽白血病的控制有重要意义。
附图说明
图1为黄芪对禽白血病病毒复制的抑制作用。
具体实施方式
1、材料
黄芪购自贵阳同济堂，原产地甘肃。禽白血病病毒为A亚型，购自中国兽药监察所。DF-1细胞由实验室保存。
2、方法
2.1中药制备
称取20g黄芪，用240mL蒸馏水浸泡1-2h，大火加热，沸腾后换成文火加热，从沸腾时开始计时，煎煮0.5-1h后用纱布过滤，收集滤液。余下的药渣中加入200mL蒸馏水，大火加热至沸腾后换成文火并开始计时，煎煮0.5-1h后收集滤液。剩下的药渣再用160mL蒸馏水煮20-40min，收集滤液。将三次滤液合并，用砂锅加热浓缩至20mL。药液含生药量为1g/mL。100℃高压灭菌30min，置4℃冰箱备用。
2.2最大安全浓度的测定
DF-1细胞长满后，用常规方法消化，加入10mL含10％NBS的细胞培养液，混匀后吸到96孔细胞培养板中，每孔加100μL，放入含5％CO2的37℃恒温培养箱培养。用f12DMEM倍比稀释药液，浓度分别为1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、0.125g/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL、15.625mg/mL、7.813mg/mL，3.907mg/mL，1.953mg/mL，0.977mg/mL，0.488mg/mL。待细胞长成单层后，弃掉原培养液，加入100μL稀释好的药液，每种中药用不同的两块细胞培养板做，每块板上做三个平行对照，需设立只加维持液的细胞对照组。每孔再补加100μL含1％NBS的细胞维持液，放入恒温培养箱中继续培养，分别于24h、48h、72h观察细胞生长情况。选择细胞生长良好，全部或基本形成完整单层，细胞折光性强且无空隙的最高稀释浓度作为药物的最大安全浓度。结果见表1，综合各组数据，黄芪药液的最大安全浓度为62.5mg/mL。
表1最大安全浓度测量结果(mg/mL)
2.3荧光定量PCR方法建立
2.3.1引物设计
采用Primer Premier5.0软件，参照NCBI上ALV-J原型毒株ADOL-7501(基因登录号:Z45390)序列，在相对保守的g37基因处设计一对荧光定量PCR特异性引物，F：CAAGACGTGGAAGGGATG；R：GCAATGCAAACAGTAGCG。同时参照NCBI上Gallus 18srRNA(基因登录号:AF173612.1)序列设计内参引物，F：GTTCAGCCACCCGAGATTGA；R：CCCATCACGAATGGGGTTCA，送上海捷瑞生物工程有限公司合成。
2.3.2标准曲线的构建
以重组阳性质粒为标准品，进行10倍倍比稀释，取10-2-10-7浓度稀释数，每个稀释度设3个平行，在荧光定量PCR仪上进行扩增，建立标准曲线。结果显示，熔解曲线均产生单一峰型，无引物二聚体等非特异性产物，特异性强。18s标准曲线E＝98.6％，R2＝0.996；g37标准曲线E＝102.0％，R2＝0.999，两者扩增效率均符合要求。综合分析，本试验所建qPCR方法具有一定的特异性，所使用的引物特异性好，可用于下一步试验。
2.4黄芪对禽白血病病毒的直接灭活作用
将稀释到最大安全浓度的药液与100TCID50的禽白血病病毒液(体积比:1:1)混合后作用1h，接种于长满单层DF-1细胞的12孔细胞板上，每孔1mL，每种药重复3孔，并设病毒对照(只加1mL100TCID50的禽白血病病毒液)和细胞对照(只加1mL的细胞维持液)，置于5％CO2的37℃温箱培养72h。结果显示，病毒组的g37基因含量为1.564，细胞对照组为0.005，黄芪直接灭活组0.688。
2.5黄芪对禽白血病病毒的预防作用
将稀释到最大安全浓度的中药药液加入己长满单层DF-1细胞的12孔细胞板上，每孔500μL，每种药重复3孔，置5％CO2，37℃温箱孵育1h，用DMEM清洗之后，以500μL100TCID50的禽白血病病毒液攻击细胞。并设病毒对照和细胞对照，置5％CO2的37℃温箱培养72h。结果显示，病毒组的g37基因含量为1.564，细胞对照组为0.005，黄芪预防组0.467。
2.6黄芪对禽白血病病毒的治疗作用
将100TCID50的禽白血病病毒液加入己长满单层DF-1细胞的12孔细胞板上，每孔500μL，每种药重复3孔，置5％CO2，37℃温箱孵育1h，用DMEM清洗之后，补加稀释到最大安全浓度的中药药液。并设病毒对照和细胞对照，于5％CO2的37℃温箱培养72h。结果显示，病毒组的g37基因含量为1.564，细胞对照组为0.005，黄芪治疗组0.354，治疗组g37基因含量明显低于病毒对照组。
3、结果
3.1最大安全浓度测定结果
用细胞病变法测得黄芪药液的最大安全浓度为62.5mg/mL。
3.2标准曲线建立结果
成功构建两条标准毒株，特异性强，扩增效率高，可用于后续试验。
3.2黄芪对禽白血病病毒转录水平的影响
结果见图1，三组用药组的g37基因含量均明显低于病毒对照组，三组中治疗组的含量最低，直接灭活组相对较高。说明黄芪对禽白血病病毒的复制有明显的抑制作用，且用于治疗时效果最好。
Claims (4)
1.一种抗禽白血病病毒中药，其特征在于：其组分为黄芪。
2.根据权利要求1所述的一种抗禽白血病病毒中药，其特征在于：其剂型为黄芪药液。
3.根据权利要求2所述的一种抗禽白血病病毒中药，其特征在于：黄芪药液的最大安全浓度为62.5mg/mL。
4.如权利要求1或2所述的一种抗禽白血病病毒中药的制备方法，其特征在于：称取黄芪，用蒸馏水浸泡1-2h，大火加热，沸腾后换成文火加热，从沸腾时开始计时，煎煮0.5-1h后用纱布过滤，收集滤液，余下的药渣中加入蒸馏水，大火加热至沸腾后换成文火并开始计时，煎煮0.5-1h收集滤液，剩下的药渣再用蒸馏水煮30-50min，收集滤液，将三次滤液合并，用砂锅加热浓缩至药液含生药量为1g/mL，100-110℃高压灭菌30-40min，置4℃冰箱备用。
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