CN101073663A - 一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

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杨惠玲
陈泽雄
夏洪平
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Abstract

本发明公开了一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物，属抗肿瘤药物领域，其技术要点是由下述重量份的原料药制成，莪术15份、半枝莲30份、柴胡10份、黄芩10份、法夏15份、党参30份、甘草5份、大枣10份、生姜6份；本发明的中药组合物可将原料药按常规煎熬、浓缩或醇提、浓缩等加工制成口服液、片剂、胶囊、散剂等；本发明的新复方中药在临床应用已经显示较好的抗肿瘤和改善病人状态功效，组份中的原料药资源丰富，可用于辅助治疗肝癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤。

Description

一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药组合物，尤其是指一种用于恶性肿瘤治疗的中药组合物，本发明还涉及该中药组合物的制备方法。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病，发病率及死亡率逐年上升，癌症患者中约70％～80％是中晚期，大多数失去早期手术根治的机会，多以放疗或化疗为主，虽有一定的近期疗效，但常因不良反应大，且缓解期短，生存质量差，不能明显延长患者的生存期。中医药治疗恶性肿瘤，在改善症状，提高生活质量，稳定缩小癌灶，延长生存期等方面的优势得到国内和国际同仁的广泛认可。
中医药是中华民族文化瑰宝之一，在当今肿瘤治疗中也仍然具有独特的地位和作用，如中医的阴阳平衡理论对于理解与肿瘤发生发展密切相关的癌基因和抑癌基因、细胞信号转导和细胞周期的调控，具有一定的理论指导意义。有效抗癌药如喜树碱、砒霜等已成为抗癌新药开发的原料。中医的一些扶正祛邪方剂在配合西医的抗癌治疗中，也起着一定的辅助作用。中医药关于固本、祛邪攻毒、软坚化积的理论和疗法在癌症防治中显示其特色及显著的疗效。同传统癌症疗法相比，中医药具有不良作用小的优点(有些药物除外)。另外，中医药在癌症治疗上更注重整体与局部的关系，其中，对于提高晚期病人生活质量犹为中医之所长。已有研究表明癌症的疗法如放疗、化疗，甚至某些生物治疗，由于其非特异毒性作用无可避免地损害了机体的正常功能。为了减少放疗或化疗等对机体的影响，提高机体对肿瘤的防御能力，改善病人生活质量，采用中西医结合防治肿瘤也许是理想的方法之一。
随着中医药及中西医结合防治肿瘤研究的传承问题日益被关注，有关临床及实验研究也取得较大的进展，开发抗癌或抗癌辅助治疗的中药势在必行。经资料检索和临床观察，本发明人所采用的复方中药的抗癌作用国内外尚未见相关报道，我们的临床观察初步显示其具有抗癌潜能。为了开拓恶性肿瘤治疗的中药研发，本发明的发明人按照抗肿瘤药物药效学研究指导原则，对一种新的中药复方的抗肿瘤作用进行系列研究，通过体外抗肿瘤活性试验和体内抗肿瘤试验研究该中药复方的抗肿瘤作用，并对其抗肿瘤作用的机制进行了初步探讨，该新复方中药的抗肿瘤作用研究国内外尚未见报道。
发明内容
本发明要解决技术问题是提供一种治疗效果好、适用面广的用于恶性肿瘤治疗的中药组合物。
本发明要的另一技术问题是提供一种上述中药组合物的制备方法。
本发明的前一技术方案是这样的：一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物，是由下述重量份的原料药制成，莪术15份、半枝莲30份、柴胡10份、黄芩10份、法夏15份、党参30份、甘草5份、大枣10份、生姜6份。
上述的用于治疗恶性肿瘤的中药组合物中所述的中药组合物为口服液、片剂、胶囊、散剂等中药常用剂型。
本发明的后一技术方案是：一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物的制备方法，包括下述步骤：(1)原料药加8倍量的水，用水蒸汽蒸馏提取挥发油2次，每次提取时间为2h；(2)药渣与挥发油合并共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，滤过，滤液浓缩成1g生药/ml的浓缩液或将浓缩液干燥成清膏后，加常用药用辅料压片或装填胶囊或装袋。
本发明的复方中药中半枝莲清热解毒活血为君药，莪术行气祛痰，法夏化痰散结，共为臣药，党参、大枣健脾益气扶中，柴胡疏肝理气，黄芩清热解毒，共为佐药；甘草和药为使。诸药合用，具有理气活血、解毒散结、健脾益气之功，临床应用表明本发明的中药组合物对肝癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤具有辅助治疗效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
按下述重量配比称取原料：
莪术15g、半枝莲30g、柴胡10g、黄芩10g、法夏15g、党参30g、甘草5g、大枣10g、生姜6g。
制备方法：加8倍量的水，水蒸汽蒸馏提取挥发油2次，每次提取时间为2h；药渣与挥发油合并共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，滤过，滤液浓缩成1g生药/ml的浓缩液。
本发明的中药组合物还可以进一步将浓缩液干燥成清膏，然后加常用药用辅料压制成片或填装胶囊或直接装袋成散剂。
上述配方的本发明中药组合物，也是人体每日的常用剂量，可采用水煎服两次，早、晚各服用一次。
实验例1  复方中药急性毒性试验
实验分组：三组：药物处理组(1g生药/ml复方中药)，PBS对照组，非处理组。每组10只昆明小鼠。
实验步骤：(1)采用小鼠口服灌胃给药。(2)经预试验，用最高浓度和最大容积的复方中药给予小鼠灌胃，小鼠无一死亡，表明复方中药急性毒性低，未能测得LD50；故本品仅进行最大给药量试验。(3)取SPF级昆明小鼠30只，体重18～22g，如上述分三组，雌雄各半，给药前禁食12h，然后给予上述复方中药(1g生药/ml)及PBS 0.8ml/只灌胃，每日3次，连续给药7d，空白对照组不给药，观察比较并记录小鼠的毒性反应及死亡数。
实验结果：给药后30min小鼠出现轻微活动减少，2h左右恢复正常，实验小鼠连续观察7d，其全身状况、摄食、饮水、大小便和体重增长均正常。无一动物死亡。7d后处死动物，剖解肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等重要脏器，未发现异常改变。
实验例2  复方中药对体外培养多种肿瘤细胞活性的影响(SRB法)
磺基罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)是一种蛋白质结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，在一定波长的OD值与细胞数呈良好的线形关系，可用作细胞数的定量。用胰酶消化对数生长期肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640或DMEM悬浮细胞，并调节细胞浓度为3×104个/ml。接种于96孔培养板内，每孔100μl，置37℃，5％CO2和100％湿度培养箱培养，培养12h后，分为加药组和对照组进行处理。对照组每孔加入200μl全培养液，加药组每孔加入含有各浓度药的全培养液200μl，所加药物浓度为每ml含的生药量不同，分别为20mg/ml，10mg/ml，5mg/ml，2.5mg/ml，1.25mg/ml，0.625mg/ml，0.3125mg/ml。继续培养分别于24h、48h或72h终止实验，首先每孔加入200μl 10％遇冷的TCA固定1h，离心后去上清，再用水洗5遍，晾干，然后每孔加入100μl的SRB染色15min后，用1％醋酸洗5遍，晾干，最后每孔加入10mmol/lTris液150μl，振荡器振荡10分钟，待完全溶解后于酶标仪λ570nm处检测OD值。SRB实验结果显示复方中药处理多种肿瘤细胞活性均有不同程度的抑制作用，并且随着药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用更为明显，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。结果表明该复方中药在体外可抑制多种肿瘤细胞的活性，且抑制作用呈时效和量效关系，参阅表1A-1J。
          表1A  复方中药对CNE-1细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600051
          表1B  复方中药对CNE-2细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600061
          表1C  复方中药对ARO细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600062
          表1D  复方中药对KAT-4细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600063
          表1E  复方中药对MCF-7细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600064
          表1F  复方中药对Her-18细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600071
          表1G  复方中药对A-549细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600072
          表1H  复方中药对H-1299细胞的抑制率(％)(x±sd)
Figure A20071002697600073
          表1I  复方中药对HCT116-14-3-3sigma+/+细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600074
          表1J  复方中药对HCT116-14-3-3sigma-/-细胞的抑制作用(％)(x±sd)
实验例3  复方中药的体内抗肿瘤试验
1.复方中药对S180和EAC荷瘤鼠的抑瘤实验
实验分组：S180和EAC荷瘤鼠各分五组，包括：PBS阴性对照组，CTX阳性组，复方中药治疗的高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)浓度组。
实验步骤：(1)药液的配制：用水将复方中药原药(1g生药/ml)分别配成每毫升含0.5g、0.25g和0.125g生药的高、中和低三个剂量的药液，4℃冰箱保存，用时摇匀。(2)造模：在超净工作台中无菌抽取小鼠腹腔内连续传代的S180、EAC细胞，用生理盐水调整细胞为2×107·ml-1，小鼠右背后皮下接种，每只0.2ml。(3)动物随机分组与处理：造模后随机分为五组，每组10或12只，接种次日复方中药分高、中、低3个剂量灌胃给药(0.2ml/10g)，隐性对照组用等量的水灌胃，阳性对照组采用环磷酰胺(CTX)腹腔注射给药，20mg/(kg·d)。连续给药12d后停药脱颈处死小鼠，取其肿瘤组织，滤纸吸干后称重，以抑瘤率代表治疗作用。同时并取出小鼠脾脏、胸腺和肝脏，用滤纸吸干后称重。(4)计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(1-给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100％。(5)计算脾系数、胸腺系数和肝系数：脾系数＝脾脏重量(mg)/体重(g)，胸腺系数＝胸腺重量(mg)/体重(g)，肝系数＝肝脏重量(mg)/体重(g)。(6)统计学方法用SPSS12.0统计软件做方差分析。
实验结果：从实验结果可见，高、中、低浓度以及阳性对照组的肿瘤均小于阴性对照组(p＜0.05)，表明高、中和低浓度复方中药对S180和EAC小鼠移植瘤均具有明显抑制作用(P＜0.05)，各浓度XCHT用药组抑瘤作用亦有差异(P＜0.05)。此外，我们还发现3种不同浓度复方中药用药后均可不同程度地增加荷瘤小鼠的体重(P＜0.05)。此项实验各细胞株分别重复了三次，确保了其结果的可重复性与稳定性，见表2A-2B。复方中药对S180和EAC荷瘤小鼠脾、胸腺和肝系数的影响结果表明低、中和高浓度复方中药用药后均可使荷瘤鼠脾、胸腺系数有不同程度的升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中高或中浓度组疗效较好，优于低浓度组(P＜0.05)；而各组的肝系数变化差异不显著(P＞0.05)，见表3A-3B。
            表2A  复方中药对S180荷瘤鼠移植瘤的抑瘤作用
  组别   剂量(ml)   给药方式       动物数                 体重(g)   瘤重(g)(x±s)   抑瘤率(％)
  开始   结束   开始   结束
  第1批：阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组第2批：阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组第3批：阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组 0.40.20.40.40.40.40.20.40.40.40.40.20.40.40.4 灌胃腹腔注射灌胃灌胃灌胃灌胃腹腔注射灌胃灌胃灌胃灌胃腹腔注射灌胃灌胃灌胃 111111111110111110101212121212 111099101091010101211121111 18.00±1.8117.83±1.3417.92±1.4417.92±1.4417.92±1.4419.40±1.3519.30±1.419.09±1.3018.90±1.2019.10±1.5217.92±1.5617.83±1.5317.75±1.5517.83±1.6417.82±1.63 24.92±1.8624.05±1.2728.94±2.9528.43±2.7026.67±1.3225.26±1.24223.56±1.0728.83±1.9228.59±1.3926.52±1.2527.75±1.6524.87±1.5930.97±2.1629.14±1.5328.38±1.7 0.98±0.440.40±0.150.43±0.150.51±0.140.70±0.271.03±0.2170.20±0.100.25±0.080.36±0.120.67±0.140.91±0.210.2±0.090.28±0.10.37±0.090.60±0.09 56.8253.3945.2526.2280.9376.1364.7034.9978.3369.4859.1834.28
注：The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
           表2B  复方中药对EAC荷瘤鼠移植瘤的抑瘤作用
  组别   剂量(ml)   给药方式       动物数               体重(g)   瘤重(g)(x±s)   抑瘤率(％)
  开始   结束   开始   结束
  第1批：阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组 0.40.20.40.4 灌胃腹腔注射灌胃灌胃 10101010 109109 18.10±0.8617.90±0.9917.90±1.3718.10±1.56 25.07±1.1923.46±1.8026.14±1.2026.07±0.91 0.94±0.120.20±0.040.30±0.030.36±0.09 78.6667.7461.63
  低浓度处理组第2批阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组第3批阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组   0.40.40.20.40.40.40.40.20.40.40.4   灌胃灌胃腹腔注射灌胃灌胃灌胃灌胃腹腔注射灌胃灌胃灌胃   1010101111111010101010   1010810101010910109   18.00±1.1519.10±1.3719.10±1.4219.00±1.6119.09±1.5119.27±1.4218.60±2.3718.60±2.3718.55±2.1618.30±2.1118.50±2.37   25.31±1.2925.37±1.4423.72±1.2427.58±1.9726.95±2.0525.98±1.6125.42±1.1223.36±1.9327.50±2.5028.50±2.0726.13±1.39   0.54±0.150.91±0.280.17±0.060.29±0.020.34±0.080.60±0.180.97±0.130.24±0.050.38±0.060.32±0.060.60±0.08   38.8681.3168.5862.5934.0175.0167.1460.3837.90
注：The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
         表3A  复方中药对S180荷瘤小鼠脾、胸腺和肝系数的影响(x±sd)
  组别   动物只数   脾系数   胸腺系数   肝系数
  第1批阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组第2批阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组第3批阴性对照组阳性对照组 111099101091010101211 5.61±0.795.37±0.56.81±0.866.64±0.746.09±0.465.68±0.935.23±0.548.78±1.288.65±1.756.6±0.55.62±0.415.49±0.7 2.51±0.382.73±0.233.83±0.453.57±0.353.08±0.532.54±0.312.39±0.334.03±0.493.85±0.683.06±0.622.52±0.242.47±0.25 53.54±6.0456.79±5.2158.54±4.0858.06±3.0459.96±2.3958.9±7.8257.5±4.1163.5±4.9962.05±3.6860.83±4.3358.73±4.8958.8±5.88
  高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组   121111   8.32±1.217.52±1.786.91±1.32   3.99±0.673.6±0.642.96±0.52   61.23±2.2259.47±3.6359.32±3.11
注：The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
         表3B  复方中药对EAC荷瘤小鼠脾、胸腺和肝系数的影响
  组别   动物只数   脾系数   胸腺系数   肝系数
  阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组第2批阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组第3批阴性对照组阳性对照组高浓度处理组中浓度处理组低浓度处理组   1091091010810101010910109   7.23±0.626.96±0.969.3±0.887.86±1.927.67±2.165.56±0.915.13±0.538.8±1.217.73±1.396.66±0.466.01±0.515.5±0.797.51±0.977.02±0.826.59±0.32   2.74±0.472.83±0.513.45±0.963.05±0.382.92±0.562.6±0.272.54±0.314.06±0.643.63±0.63.11±0.762.82±0.332.68±0.273.78±0.583.76±0.323.29±0.62   59.89±2.8859.97±3.464.45±3.6362.13±3.5460.54±1.6759.03±6.3657.28±4.3465.11±3.7361.2±1.6359.7±1.6859.44±4.8759.1±6.261.48±3.8861.73±2.9660.07±2.99
注：The mean difference versus controlis significant at the 0.05 level.
2.复方中药对EAC荷瘤鼠脾淋巴细胞增殖的影响
实验分组：阴性对照组：水；阳性对照组：CTX；复方中药处理组分：高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)浓度处理组。
实验步骤：(1)收集淋巴细胞：无菌条件下取出经治疗的荷瘤鼠脾脏，将脾脏研成细胞悬液，过200目不诱钢筛，经计细胞数后，用培养液稀释并调整细胞浓度为1×107/ml的脾细胞悬液。(2)接种：取脾细胞悬液50μl(5×105细胞)加入96孔平板中，加ConA 2μg/孔，平行样3份置于37℃，5％CO2孵育箱中培养72h。(3)用MTT法[4]测定小鼠脾淋巴细胞转化率，即用加ConA孔的光密度值减去不加ConA的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。
实验结果：实验结果可见，高、中和低浓度组以及阳性对照组较空白对照组高，提示小鼠脾淋巴细胞转化增殖能力提高(P＜0.01)，阴性对照组小鼠脾淋巴细胞转化率较空白组低(P＜0.05)，见表4。
3.复方中药对EAC荷瘤鼠白细胞介素2(IL-2)活性的影响
实验分组：参照2。
实验步骤：各组经处理的小鼠常规制备脾细胞悬液5×109/l，加到24孔板中，每孔1ml，再加ConA(终浓度为5mg/l)，置于37℃，5％CO2孵育箱中培养48h后，离心吸上清，即获得IL-2粗制剂，-20℃冻存待测。测定时取C57BL/6小鼠，无菌摘取胸腺，制备5×109/l的细胞悬液，加到96孔板中，使ConA终浓度为3mg/l，然后加入不同稀释度的IL2上清，培养72h，培养结束前6h加入185×104Bq/孔3HTdR。收集细胞，液闪仪计数每min脉冲数。
实验结果：从实验结果可见，与空白对照组相比，高、中、低浓度组以及阳性对小鼠脾细胞IL-2分泌有促进作用(P＜0.05)，以中浓度和阳性对照组最为明显；阴性对照组与空白对照组比较没有明显统计学意义(P＞0.05)，见表4。
4.复方中药对EAC荷瘤鼠CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的影响
实验分组：参照2。
实验步骤：摘小鼠眼球取血标本，取20μl抗凝血，加入20μl的抗CD4或抗CD8荧光抗体，作用15分钟后加入200μl红细胞裂解液，5分钟后加入1ml PBS，3000r/min 2分钟，沉淀用400μl PBS重悬后，在Facscalibur流式细胞仪(Becton Dickinson Inc)上检测CD4+及CD8+T细胞数，并计算CD4+/CD8+比值。
实验结果：从实验结果可见，与阴性对照组比较，高、中浓度组以及阳性对照组荷瘤小鼠CD4+/CD8+T淋巴细胞比值均升高(P＜0.01)，其中以中浓度最为明显；而阴性对照组CD4+/CD8+T淋巴细胞比值较空白组低(P＜0.01)，见表4。
           表4  对EAC荷瘤小鼠免疫的影响(x±sd，n＝6)
Group   Spleenlymphocyteproliferation ODvalue IL-2value(u/L) CD4+/CD8+value
  ControlNegativeLow doseMid doseHigh doseLentinan   0.0455±0.00100.0396±0.0019**0.0531±0.0017*0.0621±0.0013*△0.0623±0.0005*△0.0620±0.0014*△   54.00±2.4551.70±3.3660.47±2.02**▲79.29±2.39*△65.27±3.63**▲80.53±3.28*△   1.2535±0.05821.0128±0.0306**1.0874±0.0385**1.3043±0.0921▲1.2253±0.0145▲1.2415±0.0425▲
*P＜0.01，**P＜0.05vs control group    △P＜0.01，▲P＜0.05vs negative group，
5.电镜观察：
实验分组：S180荷瘤鼠阴性对照组：水；阳性对照组：CTX；复方中药处理组分：高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)浓度处理组。
实验步骤：(1)小鼠体内抑瘤实验结束时，采用颈椎脱臼法杀死小鼠后，在无菌条件下取出肿瘤组织及小鼠脾脏、胸腺和肝脏置于培养皿中，用刀片切取约1×1mm3大小放入预冷的2.5％戊二醛中固定；(2)2％饿酸后固定，酒精、丙酮梯度脱水，Epon812渗透包埋，LKBTV型超薄切片机切片，铀铅双重染色；(3)CM10透射电镜观察和照像。
实验结果：电镜观察细胞超微结构变化发现，复方中药高中浓度治疗组S180荷瘤鼠肿瘤组织中细胞出现典型凋亡形态学改变。电镜下可见，凋亡细胞皱缩，核膜完整，染色质浓缩、聚集，边移至核膜内侧，呈新月形或马蹄型的块状。而CTX用药组亦出现凋亡，但主要以细胞坏死为主。可以判定复方中药在上述浓度条件下可以诱S180荷瘤鼠肿瘤组织细胞凋亡。此外电镜观察肝脏未见明显损伤，电镜检测荷瘤小鼠脾和胸腺发现出现明显的淋巴细胞增殖的表现。
实验例4  复方中药治疗鼻咽癌的体内外研究
1.复方中药对体外培养的CNE-1和CNE-2细胞形态的影响
实验分组：药物处理组：复方中药终浓度分别为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml；
对照组：无血清的RPMI-1640培养液；
实验步骤：(1)药物配制：用RPMI-1640配制浓度分别为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml的复方中药备用；(2)接种细胞：培养CNE-1和CNE-2细胞至对数生长期，经0.25％胰酶消化细胞，1000rpm离心3min，弃上清后用含10％胎牛血清的RPMI-1640重悬；(3)分别接种等量的细胞于12孔板上，每组2个平行孔，每株细胞5个孔，置CO2培养箱(37℃，5％CO2，以下同)培养12h，细胞贴壁；(4)药物处理细胞：吸去培养液，加入预制的含有不同浓度药物的培养液，每孔2ml，放培养箱中培养；(5)观察结果：分别在药物处理后24h，，48h取出，在显微镜下拍照。
实验结果：光镜下观察发现，培养的CNE-1和CNE-2细胞均存在肿瘤细胞的生长特性，表现为增殖快，分裂相多。而受复方中药药物作用的影响，细胞增殖的速度发生明显变化，随着药物浓度的增加和药物作用时间的延长，细胞出现明显的坏死，5mg/ml以上浓度处理组几乎无贴壁细胞，表现为细胞间间隙增大，细胞变圆并从瓶底脱落。
2.复方中药对体外培养的CNE-1和CNE2细胞活性的影响(MTT法)
实验分组：
药物处理组：复方中药终浓度分别为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml和0.3125mg/ml；
对照组：无血清的RPMI-1640培养液；
实验步骤：(1)药物配制：无血清RPMI-1640培养液配制320mg/ml的复方中药备用，使用时用培养液等倍稀释成上述药物处理组各浓度。用PBS配制5mg/mlMTT，过滤消毒备用；(2)收集细胞：取对数生长期的CNE-1和CNE-2细胞常规胰酶消化后，离心，用含10％胎牛血清的RPMI-1640配成5×104/ml细胞悬液；(3)接种细胞：将细胞以适当的密度(5000个/孔)接种于用96孔培养板中，每孔100μL，37℃、5％CO2孵箱中培养12h，细胞贴壁；(4)药物处理细胞：按药物处理组与对照组加入不同浓度的复方中药以及无血清的RPMI-1640培养液，每组6个平行孔，共3块培养板，置培养箱中继续培养；(5)加入MTT：在24h、48h和72h后分别取出一块板，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续培养约4h；(6)加入DMSO溶解结晶：吸出培养液后，加入150μL/孔DMSO，室温下振荡10min，待紫蓝色结晶完全溶解后，在自动酶标仪上测定各孔的570nm处的吸光值(A570)；(7)复方中药抑制率的计算：按以下公式计算每孔的抑制率，绘制剂量—效应曲线：
Figure A20071002697600151
(8)IC50计算：SPSS做抑制率对药物浓度的对数回归，获得回归方程后，以抑制率为50％代入方程，算出半数抑制浓度(IC50)，进行比较；(9)统计分析：运用SPSS12.0单因素方差分析，使用SNKq法(方差齐性时)及Dunnet′s T3法(方差不齐时)验后比较，相关分析采用Spearman′sρ相关系数表示。检验水准：α＝0.05。
实验结果：此实验中，将不同浓度的药物复方中药分别作用于CNE-1和CNE-2细胞24h，48h和72h，用MTT法检测药物作用后CNE-1和CNE-2细胞的存活情况，发现复方中药对两株细胞均存在不同程度的抑制作用，其药效随药物浓度的增加而明显增强，见表5A，表5B。
          表5A  复方中药对CNE-1细胞的抑制作用(％)(x±sd)
Figure A20071002697600152
          表5B  复方中药对CNE-2细胞的抑制率(％)(x±sd)
3.复方中药对体外培养的CNE-1和CNE2细胞活性的影响：克隆形成实验
实验分组：复方中药终浓度分别为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.625mg/ml；
对照组：2倍的RPMI-1640培养液；
平板克隆实验步骤：(1)取指数生长期的CNE-1和CNE-2细胞，0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数细胞；(2)接种到直径6em的平皿中(100个/平皿)，培养箱中过夜，细胞贴壁后，弃培养液，PBS洗2次，换不同浓度药物或无血清的RPMI-1640培养液培养24h后，全部换新鲜培养液。每个浓度组设3个平行孔；(3)37℃，5％CO2条件下培养10～14d，每三d换新鲜培液一次，至肉眼可见集落形成；(4)弃培养液，用PBS洗2次，甲醛固定15min，姬姆萨应用液染色20min；(5)流水冲洗染色液，空气干燥；(6)灯箱下计数每个培养孔中的集落数，以＞50个细胞数作为一个集落，计算每组均值；(7)计算每孔的克隆形成率，按以下公式：克隆形成率(％)＝克隆数/接种细胞数×100％；(8)统计学处理：运用SPSS12.0单因素方差分析，使用SNKq检验(方差齐)及Dunnet’s T3法(方差不齐)，检验水准：a＝0.05。
软琼脂克隆实验步骤：(1)琼脂糖配制：制备1.4％和0.7％的琼脂糖溶液：称取0.7g和0.35g琼脂糖，分别加入50ml三蒸水，高压蒸汽灭菌。溶解后即为1.4％和0.7％的琼脂糖溶液。置于45℃烤箱中待用；(2)药物配制：制备2倍的RPMI-1640培养液(含20％新生牛血清以及2倍双抗)，并用其对倍稀释配制10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml和0.625mg/ml浓度的复方中药。对照组为2倍的RPMI-1640培养液；(3)制备下层琼脂糖：取6支离心管，每管中加入500μL含有上述浓度的药物或培养液。每管中再加入500μL1.4％琼脂糖溶液，迅速混匀后加入24孔板中，每孔500μL，每组两孔；(4)制备上层琼脂糖：a)再取6支离心管，各管中加入440μL含有上述浓度的药物或培养液；b)取培养至对数生长期的CNE-1和CNE-2细胞，消化成单个细胞，离心，用适当的培养液重悬至1×105/ml，在上述离心管中加入60μL/管(3000个/孔)；c)取出0.7％的琼脂糖溶液，在超净工作台中放置片刻，等冷至40℃时，加入离心管，500μL/管，吹打均匀，迅速加入24孔板，500μL/孔；(5)放置37℃、5％CO2的培养箱培养10-14d；(6)染色并观察：用1mg/mL的iodonitrotetrazolium chloride进行染色，每孔加入0.1ml染色液，置培养箱中放置过夜；(7)计数集落形成数：低倍镜(4×物镜)视野下在每孔的四角和中心随机选取5个视野，计数直径大于10μm的集落数量；(8)统计学处理：运用SPSS12.0采用单因素方差分析(ANOVA)，验后比较采用SNKq(方差齐性)和Dunett′s T3(方差不齐)。检验水准：α＝0.05。
实验结果：平板克隆试验发现不同浓度复方中药作用细胞24h后，观察细胞克隆形成情况，与对照组比较，处理组细胞克隆数减少，并随着药物剂量的增加而减少，说明复方中药对细胞的增殖能力也有抑制作用。各个药物浓度组的细胞击落形成率见表6；
表6  复方中药对CNE-1和CNE-2细胞克隆形成数的影响(x±sd)(平板克隆实验)
  CNE-1   CNE-2
  Control0.625mg/mL1.25mg/mL2.5mg/mL5mg/mL10mg/mL   96.7±1.565.3±6.546.7±4.038.3±2.531.7±2.517.3±1.5   62.7±5.551.3±4.543.3±4.034.7±4.128.3±3.511.3±2.5
The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
软琼脂克隆试验亦发现与对照组相比，通过低倍镜(4×物镜)观察，处理组的集落形成的数目随着剂量的增加而减少，高浓度实验组的集落形成的数目明显减少(P＜0.01)。低浓度处理组虽在形成集落的数量上与对照相仿，但可见其集落略小于对照组的平均水平，见表7。
表7  复方中药对CNE-1和CNE-2细胞的克隆形成数的影响
  (个/10×4视野，4×物镜)(x±sd)(软琼脂克隆试验)
  CNE-1   CNE-2
  Control0.625mg/mL1.25mg/mL2.5mg/mL5mg/mL10mg/mL   95.6±3.080.3±4.061.7±3.654.3±3.330.7±3.017.3±1.4   82.3±3.072.3±3.554.3±1.943.7±2.825.7±1.815.7±2.0
The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
4.复方中药对CNE-2裸鼠移植瘤模型的半体内抑瘤实验
实验分组：
药物处理组：复方中药的终浓度分别为10mg/ml、5mg/ml和2.5mg/ml的各5只；
对照组：PBS对照组，5只。
实验步骤：(1)处理细胞：取对数生长期的CNE-2细胞常规胰酶消化后，离心，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液配成5×105/ml细胞悬液，以每瓶2mL接种于底面积为75cm2培养瓶上(共接种40瓶)，培养箱中培养24h。待细胞贴壁后，弃去原培养液，加入等量预制的含有不同浓度药物的培养液，继续培养24h后，消化细胞，离心，配成1×106/ml细胞悬液；(2)荷人鼻咽癌裸鼠模型的复制和分组：取20只裸鼠称重后完全随机分为4组，即PBS对照组、ELXCH低(2.5mg/ml)、中(5mg/ml)、高(10mg/ml)浓度组。无菌条件下，在裸鼠左臀部和右颈前皮下接种CNE2细胞悬液0.2ml/只复制荷人鼻咽癌裸鼠模型，接种肿瘤细胞后不作任何处理。每3d称裸鼠体重(g)以及测量肿瘤的长径(L)和宽径(D)一次，按照公式如下公式计算肿瘤体积：
V = π 6 × L · D 2
(3)收集标本：接种CNE-2细胞16d，颈椎脱臼处死裸鼠，将肿瘤取出拍照、称重；(4)统计处理：肿瘤体积和剥离肿瘤重量的差异运用SPSS12.0作单因素方差分析。
实验结果：饲养的BALB/c裸小鼠在背部皮下种植了CNE-2细胞后的第3d，对照组即可在种植局部触摸到新生的肿瘤组织。质硬、与周围组织有粘连而不易推动。用游标卡尺测量肿瘤的长、短径来估计肿瘤的体积，发现对照组肿瘤增殖明显快于复方中药处理组，肿瘤的体积与处理组比即有统计学差异，见表8A。
          表8A  复方中药对CNE-2移植瘤体积的影响(mm3)(x±sd)
Figure A20071002697600182
*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
种植肿瘤16d后，将肿瘤组织剥离，切取部分组织做HE染色，证实所切取的是NPC组织。对照组各只裸鼠均有肿瘤生长；低浓度处理组的5只裸鼠也均有肿瘤生长；中、高浓度处理组未见明显的肿瘤组织。将剥离的肿瘤组织称重，发现低浓度处理组与对照组相比肿瘤重量有差异(P＜0.05)，见表8B。
    表8B  CNE-2接种裸鼠16d后剥离出肿瘤的重量
  组别   肿瘤重量
  control2.5mg/mL5mg/mL10mg/mL   1.079±0.5560.392±0.2210±00±0
*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
5.复方中药对CNE-2裸鼠移植瘤模型的体内抑瘤实验
实验分组：分五组，包括：PBS阴性对照组，CTX阳性组，复方中药药物治疗组：分高(0.5g/ml)、中(0.25g/ml)、低(0.125g/ml)浓度组。
实验步骤：(1)药液的配制：用蒸馏水将复方中药原药(1g生药/ml)分别配成每毫升含0.5g、0.25g和0.125g生药的高、中和低三个剂量药液，4℃冰箱保存，用时摇匀。(2)造模：取对数生长期的CNE-2细胞常规胰酶消化后，离心，用无血清的RPMI-1640培养液配成5×105/ml细胞悬液，小鼠右背后皮下接种，接种体积0.2ml/只。(3)动物随机分组与给药：造模成功后随机分为五组，每组8只，接种次日复方中药分高、中、低3个剂量灌胃给药(0.2ml/10g)，模型对照组用同等量经消毒的水灌胃，阳性药物组采用环磷酰胺(CTX)腹腔注射，20mg/(kg·次)，2次/周，连续给药15d。(4)每3d测量肿瘤的长径(L)和宽径(D)一次，按照公式如下公式计算肿瘤体积：
V = π 6 × L · D 2
(5)收集标本：接种CNE-2细胞16d，颈椎脱臼处死裸鼠，将肿瘤取出拍照、称重。(6)统计处理：肿瘤体积和剥离肿瘤重量的差异运用SPSS12.0作单因素方差分析。
实验结果：饲养的BALB/c裸小鼠在背部皮下种植了CNE-2细胞后的第3d，对照组即可在种植局部触摸到新生的肿瘤组织。质硬、与周围组织有粘连而不易推动。用游标卡尺测量肿瘤的长、短径来估计肿瘤的体积，发现对照组肿瘤增殖明显快于复方中药和环磷酰胺治疗组，肿瘤的体积与中、高浓度复方中药治疗组及环磷酰胺治疗组比即有统计学差异(P＜0.05)，见表9，与低浓度治疗组比无统计学意义(P＞0.05)。
     表9A  复方中药对CNE-2裸鼠移植瘤体积的影响(mm3)(x±sd)
Figure A20071002697600192
*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
种植肿瘤15d后，将肿瘤组织剥离，切取部分组织做HE染色，证实所切取的是NPC组织。除CTX组一只未长肿瘤，其它均可见大小不等的肿瘤生长。将剥离的肿瘤组织称重，发现中、高浓度、CTX处理组与对照组相比肿瘤重量有差异(P＜0.05)，低浓度组与对照组比肿瘤肿瘤无差异(p＞0.04)，见表9B。
表9B CNE-2接种裸鼠15d后剥离出肿瘤的重量
  组别   肿瘤重量
  control0.125g/mL0.25g/mL*0.5g/mL*CTX*   0.76±0.280.88±0.400.22±0.140.20±0.160.20±0.10
*The mean difference versus control is significant at the 0.05 level.
6.激酶试验
实验分组：药物处理组：复方中药终浓度分别为5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml；对照组：PBS。
实验步骤：(1)收集细胞：弃去旧液，用2ml PBS洗涤，弃去PBS后，置于冰上。添加1.5ml无菌PBS液。收集细胞，放入1.5ml的离心管内离心，5000rpm 5分钟后弃去PBS液；(2)加入400ul NP40-RIPA+1x pepstatin+1xPMSF+coctail蛋白酶抑制剂+1xNaF+1x NaVO4溶解细胞，将细胞溶解产物离心，14K，15min，4℃，移上清液于新的微量离心管；(3)用Bradford法检测蛋白沉淀物；(4)使每份样本的总蛋白量一致，并加溶解缓冲液致每份样品总容量为400ul；(5)在微量管中加入8ulαCdK2，于4℃孵育1h，适时振荡，加入70ul Protein A悬浊液，孵育30min，将免疫沉淀复合物离心，4000rpm，5min，4℃；(6)用1ml NP40-RIPA(无NaF，NaVO4)洗涤，重复3次，用1ml 1x激酶缓冲液洗涤一次；(7)将免疫沉淀复合物离心，4000rpm，5min，4℃，加入同位素标记的ATP；(8)加50ul/Rx Histone H1 mix入复合物，室温下孵育15min，加入10ul 5x上样缓冲液，煮沸变性5min；(9)行SDS-PAGE电泳，180V，1h；(10)去除凝胶的两端，置于干胶器上30min，依据phosphor-imaging说明显影。
实验结果：激酶分析试验检测发现复方中药可引起CNE-1和CNE-2细胞CDK-2激酶水平改变，其中5mg/ml复方中药引起CNE-1激酶水平降低最为明显而1.25mg/ml复方中药引起CNE-2激酶水平降低最明显。
7.miRNA表达谱芯片检测复方中药对CNE-2细胞miRNA表达的影响
实验分组：CNE-2；复方中药(10mg/ml)处理48h的CNE-2。
实验步骤：(1)样品RNA抽提，取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，吸去PBS后用TRIZOL试剂抽提RNA；(2)RNA质量检测：a.紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260NM和280NM的吸收值，以计算浓度并评估纯度；b.用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性；(3)制备荧光标记探针：采用miRCURYARRAY标记试剂盒，用标记酶将CY3或CY5荧光基团标记microRNA，可以得到用于与芯片杂交的荧光探针。(4)芯片杂交：在标准条件下将标记好的探针和miRCURY的microRNA芯片杂交；(5)图像采集和数据分析：使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。
实验结果：CNE-2经10mg/mL的复方中药处理48h后，经miRNA表达谱芯片检测，从Cy3和Cy5信号图像可以直接读出miRNA表达谱，从Cy3/Cy5比的信号图像可以得到两个样本之间的差异表达；经miRNA芯片检查发现复方中药处理的CNE-2与正常CNE-2间miRNA表达差异如下表所示，见表10；我们选出log2(Sample B/Sample A)>2的miRNA进行靶点预测发现hsa-miR-450存在7个可能的靶基因，但进一步的验证工作需要深入探讨。
            表10  复方中药对CNE-2细胞的miRNA的影响
No. Probe ID   Sample ASignal   Sample BSignal   log2(Sample B/Sample A)
  123456789101112131415161718   hsa-miR-122ahsa-miR-450hsa-miR-494hsa-miR-513hsa-miR-373*hsa-miR-489hsa-miR-498hsa-miR-210hsa-miR-198hsa-miR-602hsa-miR-129hsa-miR-637hsa-miR-422bhsa-miR-557hsa-miR-636hsa-miR-365hsa-miR-654hsa-miR-98   883.9712.05162.972,369.49229.76266.952,255.611,413.28429.672,398.84345.033,139.99649.05501.68681.38607.136,105.663,178.69   42.99250.02920.606,871.35742.17780.086,124.943,567.54980.025,247.70726.816,013.88347.79954.921,248.841,051.9411,116.405,570.58   -4.334.022.351.651.601.461.431.381.291.131.100.98-0.940.920.860.850.810.80
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Claims (3)

1.一种用于治疗恶性肿瘤的中药组合物，其特征是由下述重量份的原料药制成，莪术15份、半枝莲30份、柴胡10份、黄芩10份、法夏15份、党参30份、甘草5份、大枣10份、生姜6份。
2.根据权利要求1所述的用于治疗恶性肿瘤的中药组合物，其特征是所述的中药组合物为口服液、片剂、胶囊、散剂。
3.权利要求2所述的用于治疗恶性肿瘤的中药组合物的制备方法，其特征是包括下述步骤：(1)原料药加8倍量的水，用水蒸汽蒸馏提取挥发油2次，每次提取时间为2h；(2)药渣与挥发油合并共煮，加8倍量的水提取2次，每次煎煮2h，滤过，滤液浓缩成1g生药/ml的浓缩液或将浓缩液干燥成清膏后，加常用药用辅料压片或装填胶囊或装袋。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101991807A (zh) * 2009-08-24 2011-03-30 陈泽雄 一种治疗肝癌的中药复方
CN102614284A (zh) * 2012-04-02 2012-08-01 郑美芳 一种治疗恶性肿瘤的口服液及制备方法

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