TWI396742B - 新穎啟動子片段及其應用 - Google Patents
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Description
本發明係關於來自斑馬魚肌凝蛋白輕鏈2(mylz2)基因之新穎啟動子及其應用。
基因轉殖是現今生物科技領域廣泛應用的技術,其係經由遺傳工程技術,透過人為操控方式,將可表現特定基因之DNA分子導入動物體細胞或生殖細胞中,以修飾動物之基因表現或賦予新的表現性狀。基因轉殖技術是目前畜養業與水產養殖積極運用的技術之一,特別是針對牛、羊、豬、魚、蝦等經濟動物,可用以改良品種、增加生長率、改良肉質、提高抗病能力及適應力、改變顏色、或提升觀賞價值等。
一般而言,欲導入動物體內之DNA分子包含標的基因及用以調控其表現的啟動子序列。選擇適當的啟動子可使標的基因依所欲方式表現,進而達到在轉殖基因動物中之所欲效果,例如,組織專一性表現、誘導性表現、或提升的蛋白質表現能力。
針對魚類,由於基因體學起步較晚,累積的資訊不足,故早期魚類之基因轉殖調控元件大多來自老鼠或病毒,使得轉殖基因魚之體內終究留有病毒來源之DNA片段。近年來,研究人員致力於「全魚」(all-fish)轉殖基因魚之研究,全魚是指所有欲轉殖的基因及所使用的各項調控元件均源自於魚類,使得轉殖成功的魚類得以改變部份基因的調控,以表現出所預期的特性,但不帶有源自其它物種的基因片段。
因此,在此領域中,一直有需要尋求有潛力的啟動子,俾應用於動物之轉殖基因技術,特別是魚類。
因此,在一方面,本發明提供一種分離的核酸分子,其係由SEQ ID NO:1之核苷酸序列所組成。本發明之分離的核酸分子具有啟動子活性。
在另一方面,本發明提供一種重組載體,其包含第一核酸片段,該第一核酸片段係由SEQ ID NO:1之核苷酸序列所組成。典型地,本發明之重組載體尚包括第二核酸片段,其係編碼一蛋白質或多肽,且操作地連接至第一核酸片段。根據本發明,該第二核酸片段係編碼一外源性之蛋白質或多肽。在一具體實例中,本發明之重組載體之第二核酸片段係編碼螢光或冷光蛋白質。
在又一方面,本發明提供一種製備轉殖基因動物之方法,其包含將前述重組載體導入動物細胞中。根據本發明之具體實例,本發明之方法可用於製備轉殖基因魚,特別是螢光魚。
本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。
無須進一步的闡述,咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此,可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明,而非以任何方式限制本發明範圍。
本發明主要從斑馬魚mylz2基因之上游序列分離出一段具提升活性的啟動子之核酸片段,可調控蛋白質或多肽之表現。本發明可利用該核酸片段製備轉殖基因動物,包括但不限於魚類,特別是螢光魚。
除非另有指明,所有在此處使用的技術性和科學性術語具有如同本發明所屬技藝中之通常技術者一般所瞭解的意義。
本文所使用的「一」乙詞,如未特別指明,係指至少一個(一個或一個以上)之數量。
本文所使用的「核酸分子」或「核酸」乙詞是指核苷酸單體之聚合體,其可以是單股或雙股、直線型或環狀、去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一核苷酸單體包括磷酸基部分、糖基部分及鹼基部分。常見的核苷酸之鹼基部分包括鳥糞嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U),其中腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶配對,以及鳥糞嘌呤與胞嘧啶配對。
本文所使用之「分離的核酸分子」係指從天然生物體來源純化而來的核酸,或以化學合成法或PCR擴增技術所製得的核酸。核酸之純化方法、化學合成法及PCR擴增技術可參見Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Sambrook J等人編著,1989,以及Current Protocols in Molecular Biology,Frederick M.A.等人編著,2001,John Wiley & Sons,Inc.。此一領域具通常知識者可依據習知的技術獲得本發明之核酸分子,詳細方法描述於以下實例中。
本文所使用之「可操作性地連接」或類似用語是指調節性序列與另一編碼特定基因產物之核苷酸序列的連接方式,使得該核苷酸序列接受調節性序列之控制或調節,而在適當條件下表現出該基因產物。
本文所使用的「重組」係用以描述核酸分子含有非天然連接的序列。重組核酸分子可為載體形式,其可包括一或多個編碼基因之結構序列及用於表現該基因之調節性序列,例如,啟動子序列。載體之種類包括但不限於質體、黏質體、噬菌體、YAC或PAC等。重組載體可用於表現或複製所導入的基因序列。典型地,在重組載體中,編碼基因之結構序列係操作性地連結於調節性序列,使得重組載體導入適當宿主中時,編碼基因之結構序列在該調節性序列之調控下表現。調節性序列可包括但不限於啟動子序列、起始密碼子、複製起始點或分泌訊息序列等。
本文所使用的「核酸分子編碼‧‧‧」或其類似用語是指,該核酸分子帶有一或多個編碼特定基因產物之核苷酸序列,而可在適當條件下作為模板表現出該基因產物。應瞭解的是,由於基因密碼(由三個核苷酸所組成)之簡併性,故不同的基因密碼可編碼相同的胺基酸殘基,例如,GAU與GAC,兩者在核苷酸序列上不同,但均編碼相同胺基酸殘基,即天門冬酸(Asp)。針對相同的多肽產物,所屬領域具通常知識者可運用例行技術及已知的基因密碼偏好性(codon usage),獲得對應的核苷酸序列及其簡併序列。因此,本文所述編碼特定基因產物之核苷酸序列尚包括其簡併序列(可編碼相同基因產物)。
在一方面,本發明提供一種分離的核酸分子,其係由SEQ ID NO:1之核苷酸序列所組成。具體而言,本發明之核酸分子係分離自斑馬魚mylz2基因之上游序列,其長度為2.5kb並具有提升的啟動子活性,可用於表現操作性地連接於其上的基因序列。根據本發明實施例,該核酸分子與其他啟動子片段相比,具較佳之啟動子活性;尤其較1.9kb啟動子片段之活性高出約2.8倍之多(如實例3所列)。
在另一方面,本發明提供一種重組載體,其包含第一核酸片段,該第一核酸片段係由SEQ ID NO:1之核苷酸序列所組成。典型地,本發明之重組載體進一步包含第二核酸片段,其編碼蛋白質且操作性地連結至第一核酸片段。根據本發明,該第二核酸片段表現係由第一核酸片段調控。根據本發明,該第二核酸片段可為修飾動物之基因表現或賦予新的表現性狀,例如,增加生長率、改良肉質、提高抗病能力及適應力、改變顏色、或提升觀賞價值等。本發明一具體實施態樣中,第二核酸片段係編碼一外源性蛋白質或多肽,例如該外源蛋白質可為冷光或螢光蛋白質俾製成觀賞魚,或該外源蛋白質可為抗病源蛋白等俾製成抗病魚增加魚類生存活力。
根據本發明,冷光蛋白包括但不限於螢火蟲冷光酶及水母冷光酶;以及螢光蛋白包括但不限於綠螢光蛋白(GFP)、藍綠螢光蛋白(CFP)、紅螢光蛋白(RFP)、黃螢光蛋白(YFP)及其修飾形式,例如,強化型綠螢光蛋白(EGFP)、強化型藍綠螢光蛋白(ECFP)、強化型紅螢光蛋白(ERFP)及強化型黃螢光蛋白(EYFP)。此等蛋白之胺基酸及核苷酸序列已為此領域所習知者。例如,紅螢光蛋白具有SEQ ID NO:2之核苷酸序列及SEQ ID NO:3之胺基酸序列(圖4)。
在一特定實例中,本發明之重組載體包含SEQ ID NO:4之核苷酸序列,其涵蓋SEQ ID NO:1之核苷酸序列(啟動子)及編碼紅螢光蛋白之SEQ ID NO:2核苷酸序列。
更進一步說明,本發明之載體尚可視需要地包括其他具有特定功能之序列,例如,複製起始點、終止序列、供篩選用途之標記基因,例如,抗生素抗性基因等。此一領域具通常知識者可依現有知識選擇適當的序列,使用習知的遺傳工程技術構築本發明之載體。構築重組載體所需使用的遺傳工程技術,例如,聚合酶連鎖反應(PCR)擴增技術、核酸純化、載體及核酸片段之酵素處理及定序技術,可參見前述Molecular Cloning:A Laboratory Manual及Current Protocols in Molecular Biology(同上)。具體的載體構築細節說明於以下的實例中。
因此,在又一方面,本發明提供一種製備轉殖基因動物之方法,其包含將此處所述之重組載體導入動物細胞中。
根據本發明,此處所述「轉殖基因動物」包括但不限於牛、羊、豬、魚、蝦等不包含人纇之動物。特定而言,根據本發明之轉殖基因動物是魚類,更特定而言,為科學上或商業上有應用價值的魚種,包括但不限於斑馬魚(Zebrafish,如Danio rerio
)、神仙魚(angelfish,如七彩神仙(discuss)、Pterophyllum
)、青鱂魚(medaka)、金魚(goldfish)、鯉魚(carp)、錦鯉(koi),泥鰍(loach)、吳郭魚(tilapia)、玻璃魚(glassfish),鯰魚(catfish),鰻(eel)、紅蓮燈(tetra)、蝦虎(goby)、攀鱸科淡水魚(gourami)、孔雀魚(guppy)、劍魚(Xiphophorus)、茉莉魚(Molly fish)及鯰魚(pangasius)。
在一特定實例中,根據本發明之轉殖基因動物是斑馬魚。
本發明之方法可利用已知的轉殖基因標準技術,例如顯微注射(microinjection)、電破法(electroporation)、病毒載體法(virus infection)及精子載體法(sperm-mediated gene transfer)等方法,迫使本發明之核酸分子進入動物之配子、受精卵、胚胎或體細胞的細胞核或細胞質內,使本發明核酸分子能在胚胎或細胞中繼續複製,進而在個體及其後代細胞上表現,製得轉殖基因動物。
在一特定實例中,根據本發明之轉殖基因動物是斑馬魚,其係使用顯微注射技術將重組載體導入魚卵細胞中而製得。進一步說明,使用毛細針吸取適當體積的重組載體,將其注射於單細胞時期之斑馬魚受精卵,將注射完之魚卵集中於乾淨培養皿裡,至於28℃培養箱培養,約48至72小時孵出魚苗。
此一領域已發展出各種習知方法辨別或篩選帶有轉殖基因的動物。例如,設計可辨認轉殖基因之探針,以北方墨漬法(Northern blotting)或南方墨漬法(Southern blotting)來偵測候選動物中是否具有轉殖基因的序列,或以PCR針對特定核酸序列放大的方式進行偵測。特定而言,表現螢光蛋白之動物可直接用眼睛觀察。
在一特定實例中,本發明之方法係將編碼螢光蛋白之重組載體導入受精魚卵中,經培養後孵化,直接用眼睛篩選發出螢光的轉殖基因魚。
本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之技術特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而更清楚呈現。
本實驗採用斑馬魚(Zebrafish,Danio rerio
)為材料,使用商業套組PureLinkTM
Genomic DNA Mini Kit(Invitrogen,美國)萃取基因組DNA。簡言之,將組織放入微量試管之中,加入PureLinkTM
基因組消化緩衝液和蛋白酶K,於55℃條件下分解組織,其間偶爾的震盪,均勻試劑,直至組織完全分解,過程約1至4小時。之後在室溫下離心,取上清液置於新的微量試管,加入RNase A,輕微的震盪,靜置室溫2分鐘。加入200μl的PureLinkTM
基因組瓦解/結合緩衝液,混合均勻後,再加入酒精(96-100%),震盪混合。將溶解產物以離心的方式通過管柱過濾,清洗後,加入二次水或PureLinkTM
基因組沖提緩衝液,靜置後離心,獲得純化的基因組DNA。
設計正反引子,交由生工有限公司及台灣生醫聯盟合成,引子序列如下:
以斑馬魚基因組DNA為模板,在PCR離心管中添加上述正反引子、Taq
DNA聚合酶、緩衝液、dNTPs等試劑,含量如下:
將上述PCR離心管移至PCR反應器(Applied Biosystems 2700,美國),進行PCR反應,其條件為:起始變性反應為94℃ 5分鐘,變性、黏合及延伸反應之循環為94℃ 30秒、55℃ 30秒及72℃ 2分鐘,重複35個循環,最後延伸反應為72℃ 10分鐘,最後置於4℃終止反應。PCR反應結束後,以瓊脂膠體電泳分析PCR產物,再將含有預測大小的PCR產物片段之膠體切下,以商業套組Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit (Geneaid,Taiwan),獲得純化的PCR產物。
將純化的PCR產物選殖至pCRII-TOPO-TA載體(Invitrogen),先經由轉殖菌株之抗生素篩選,再由台北基龍米克斯生物科技股份有限公司以核酸序列自動定序儀(autosequencer,ABI)進行定序工作,從5’端及3’端進行至少兩次定序分析,選出品系,確認其含有重組載體pCRII-mylz2-2.5k,該重組載體帶有核苷酸序列為SEQ ID NO:1之啟動子片段,下稱「2.5kb啟動子片段」。圖1顯示2.5kb啟動子片段之核苷酸序列(-1至-2504)。
以上述重組載體pCRII-mylz2 2.5k為模板,分別使用下列5’端引子之其中一種,加上3’端引子,以PCR增幅出2.5kb啟動子片段及其截短片段(2.3kb、2.1kb及1.9kb):
將各種長度之啟動子片段分別選殖至pGL3基礎冷光報導載體(Promega,美國),獲得含有不同長度之啟動子片段之重組pGL3載體。使用表現水母冷光酶基因之pRL-TK載體做為內部對照組,以1:1之比例,分別與前述重組pGL3載體(含有不同長度之啟動子片段)或pGL3基礎載體(不含啟動子片段)混合後,以顯微注射法,導入單細胞時期之斑馬魚受精卵。使受精卵在28℃培育72小時,以商業套組Dual-Reporter Assay System(Promega,美國)測量啟動子活性。
簡言之,每組取10個健康胚胎,加入50μl被動裂解緩衝液(passive lysis buffer),在冰上磨碎。離心10分鐘,取上清液與50μl冷光酶分析試劑II(LAR II)混合,使用冷光分析儀(Fluoroskan Ascent FL luminometer,Thermo Labsystems,美國)測量發光。圖2顯示啟動子活性分析結果。數據係以平均數值±SEM呈現,共進行三重複實驗,使用SAS統計程式(SAS Institute,美國),統計上的顯著性設定於p<0.05或p<0.01,所有數據係以單因子變異數分析(ANOVA)進行分析而得。
如圖2所示,相較於不具啟動子片段的對照組載體(pGL3基礎載體)以及含有其他長度之啟動子片段的重組pGL3載體(2.3kb、2.1kb及1.9kb),本發明之含有2.5kb啟動子片段之重組pGL3載體展現顯著提升的啟動子活性,其中比較2.5kb啟動子片段及1.9kb啟動子片段,2.5kb啟動子片段之活性約高出2.8倍之多。
從前述重組載體pCRII-mylz2-2.5k切下2.5kb啟動子片段,接入可表現紅螢光之pDsRed2-1載體(Clontech,美國),挑選正確品系,獲得pmylz2 2.5K-DsRed重組載體(圖3)。
使用毛細針吸取適當體積的重組載體(濃度不超過30ng/μl)和追蹤染劑(最終濃度為約2%的酚紅),對單細胞時期之斑馬魚受精卵進行顯微注射。將注射完之魚卵集中於乾淨培養皿裡,加入曝氣水於28℃培養箱培養。每天檢查發育情形並挑出發育失敗之魚卵,待48-72小時孵出魚苗。
養至成魚之後,依外觀表現從中挑選6隻轉殖基因候選魚,分別為:雄魚1號、雄魚2號、雄魚3號、雄魚5號、雄魚6號、和雌魚1號,再個別與野生型斑馬魚進行交配。轉殖基因候選魚之螢光魚子代產出率分別為:18.23%、18.06%、0%、0%、0%和5.88%,其中又以雌魚1號之F1的螢光表現最強。繼而從雌魚1號之F1中篩選出達目標之表現的個體,養成後再與野生型斑馬魚交配,產生F2,隨後以F2自交,純化並穩定品系,至少可繼續繁衍至第五代,命名此穩定品系為pm2.5k-DsRed Tg1。該品系在腹部有明顯螢光表現,更甚者在吻部亦有明顯螢光表現;相較之下,含有1,9kb啟動子片段之轉殖基因斑馬魚,腹部無明顯螢光表現,呈白色狀(Gong et al.,2003)。
綜上,本發明之2.5kb啟動子片段源自斑馬魚mylz2基因,相較於其他長度之啟動子片段,具顯著提升的啟動子活性。本發明之啟動子片段可用於轉殖基因動物之製備,特別對於水產動物之基因轉殖研究有極大助益,更特別是在螢光魚之製備上有顯著提升螢光表現之效果,對於觀賞魚之產業有相當貢獻。
無須進一步的闡述,咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此,可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用,而非以任何方式限制其餘的揭露內容。
圖1A及1B顯示2.5kb啟動子片段之核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。數字代表轉譯起始位置ATG向上游計算之核苷酸位置。
圖2顯示本發明之2.5kb啟動子片段之冷光酶活性分析結果。
圖3顯示根據本發明之用於製備轉殖基因魚之pm2.5K-DsRed重組載體之結構圖。
圖4顯示pm2.5K-DsRed重組載體編碼之紅螢光蛋白之核苷酸序列(SEQ ID NO:2)及胺基酸序列(SEQ ID NO:3)。
圖5A及5B顯示pm2.5K-DsRed重組載體編碼之啟動子至紅螢光蛋白之核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。
Claims (10)
- 一種分離的核酸分子,其係由SEQ ID NO:1之核苷酸序列所組成,其具有啟動子活性。
- 一種重組載體,其包含第一核酸片段,該第一核酸片段係由SEQ ID NO:1之核苷酸序列所組成。
- 根據申請專利範圍第2項之重組載體,其進一步包含第二核酸片段,其編碼蛋白質且操作地連結至第一核酸片段。
- 根據申請專利範圍第3項之重組載體,其中第二核酸片段係編碼外源蛋白質或多肽。
- 根據申請專利範圍第3項之重組載體,其中第二核酸片段係編碼冷光或螢光蛋白。
- 根據申請專利範圍第3項之重組載體,其中第二核酸片段係由SEQ ID NQ:2之核苷酸序列所組成。
- 根據申請專利範圍第4項之重組載體,其包含SEQ ID NO:4之核苷酸序列。
- 一種製備轉殖基因魚之方法,其包含將申請專利範圍第3至7項中任一項之重組載體導入魚的配子、受精卵、胚胎或體細胞的細胞核或細胞質內,使該重組載體所含之核酸分子在胚胎或細胞中繼續複製,進而在個體及其後代細胞上表現。
- 根據申請專利範圍第8項之方法,其係使用顯微注射技術將該重組載體導入魚的受精卵中。
- 根據申請專利範圍第8項之方法,其中該魚係斑馬魚。
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Citations (1)
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WO2000049150A1 (en) * | 1999-02-18 | 2000-08-24 | National University Of Singapore | Chimeric gene constructs for generation of fluorescent transgenic ornamental fish |
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Patent Citations (1)
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WO2000049150A1 (en) * | 1999-02-18 | 2000-08-24 | National University Of Singapore | Chimeric gene constructs for generation of fluorescent transgenic ornamental fish |
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