TWI402343B

TWI402343B - 新穎肌肉增強子序列及其應用

Info

Publication number: TWI402343B
Application number: TW100102180A
Authority: TW
Inventors: hong yi Gong; Ming Chyuan Chen; Jen Leih Wu; Shih Chin Huang
Original assignee: Univ Nat Taiwan Ocean
Priority date: 2011-01-20
Filing date: 2011-01-20
Publication date: 2013-07-21
Also published as: TW201231660A

Description

新穎肌肉增強子序列及其應用

本發明係關於一種來自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb )基因之新穎肌肉增強子及其應用。

基因轉殖是現今生物技術領域廣泛應用的技術，其係經由遺傳工程技術將可表現特定基因產物之核酸分子導入細胞，以修飾其基因表現、給予新的表現性狀或作為大量生產特定基因產物的工具。例如，針對牛、羊、豬、魚、蝦等經濟動物，可用以改良品種、改良肉質、增加生長率、提高抗病能力及適應力、或提升觀賞價值等。以魚而言，水族產業消費型態由傳統蓄養觀賞，漸漸提升趨向藝術化、精緻化與生活化。而生物科技的發展與創新運用促成了「螢光魚」的誕生，螢光魚產業具有技術密集、高附加價值等特性，因此具有龐大的發展潛力與商機。

一般而言，欲使導入細胞之核酸分子在細胞內表現出所欲的基因產物需要適當的啟動子序列調控，以達所欲效果，例如，組織專一性表現、誘導性表現、或提升的蛋白質表現量，而增強子序列可再進一步增強啟動子活性。以魚類而言，目前常用於基因轉殖螢光觀賞魚的啟動子包括來自斑馬魚肌凝蛋白輕鍊2(myosin light chain 2,mylz2 )的2.2kb啟動子。然而，斑馬魚mylz2 啟動子在斑馬魚種外的其他魚種和物種的活性仍有改善加強的空間。

因此，在此領域中，仍有需要一種可提升啟動子活性的增強子序列，俾應用於動物之轉殖基因技術，特別是魚類。

本發明係從斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb )基因分離出一段肌肉增強子序列，其具有強烈提高啟動子活性之效果，並進一步利用該增強子序列結合啟動子製備轉殖基因動物(如螢光魚)，且不僅可於不同目(Order)魚種中應用，亦有應用到其他脊椎動物如哺乳類之肌肉細胞表現的潛力，有利於生物反應器之應用。

因此，在一方面，本發明提供一種分離的核酸分子，其係由SEQ ID NO: 1之核苷酸序列所組成，其具有增強子之活性。

在另一方面，本發明提供一種重組表現卡匣，其包括：

(a)第一核苷酸片段，其包括一含啟動子之核苷酸序列及SEQ ID NO: 1之核苷酸序列；及

(b)第二核苷酸片段，其編碼外源蛋白且操作地與第一核酸片段連接，使得該外源蛋白在第一核苷酸片段之調控下表現。

根據本發明，該含啟動子之核苷酸序列係衍生自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb )基因。在一具體實例中，該含啟動子之核苷酸序列係選自SEQ ID NOS: 2至11所組成之群之任一者。在另一具體實例中，該第一核苷酸片段係SEQ ID NO: 2或3之核苷酸序列。

在又一方面，本發明提供一種表現載體，其包括上述重組表現卡匣。

本發明尚提供一種宿主細胞，其包括上述表現載體。

本發明亦提供一種製備轉殖基因動物之方法，其包括將前述表現載體導入動物的配子、受精卵、胚胎或體細胞的細胞核或細胞質內，使該表現載體所含之核苷酸片段在胚胎或細胞中繼續複製，進而在個體及其後代細胞上表現；其中該動物不包含人類。根據本發明之具體實例，本發明之方法可用於製備轉殖基因魚，特別是螢光魚。

本發明亦提供一種分離的核酸分子，其具有選自SEQ ID NOS: 2至13所組成之群之核苷酸序列。

本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。

無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明，而非以任何方式限制本發明範圍。

除非另有指明，所有在此處使用的技術性和科學性術語具有如同本發明所屬技藝中之通常技術者一般所瞭解的意義。

本文所使用的「一」乙詞，如未特別指明，係指至少一個(一個或一個以上)之數量。

本文所使用的「核酸分子」或「核酸」乙詞是指核苷酸單體之聚合體，其可以是單股或雙股、直線型或環狀、去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一核苷酸單體包括磷酸基部分、糖基部分及鹼基部分。常見的核苷酸之鹼基部分包括鳥糞嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)，其中腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶配對，以及鳥糞嘌呤與胞嘧啶配對。

本文所使用之「分離的核酸分子」係指從天然生物體來源純化而來的核酸，或以化學合成法或PCR擴增技術所製得的核酸。核酸之純化方法、化學合成法及PCR擴增技術可參見Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook J等人編著，1989，以及Current Protocols in Molecular Biology，Frederick M.A.等人編著，2001，John Wiley & Sons,Inc.。此一領域具通常知識者可依據習知的技術獲得本發明之核酸分子，詳細方法描述於以下實例中。

本文所使用之「可操作性地連接」或類似用語是指調節序列與另一編碼特定基因產物之核苷酸序列的連接方式，使得該核苷酸序列接受調節序列之控制或調節，而在適當條件下表現出該基因產物。

本文所使用的「重組」係用以描述核酸分子含有非天然連接的序列。重組核酸分子可為載體形式，其可包括一或多個編碼基因之結構序列及用於表現該基因之調節序列，例如，啟動子序列。載體之種類包括但不限於質體、黏質體、噬菌體、YAC或PAC等。重組載體可用於表現或複製所導入的基因序列。典型地，在重組載體中，編碼基因之結構序列係操作性地連結於調節序列，使得重組載體導入適當宿主中時，編碼基因之結構序列在該調節序列之調控下表現。調節序列可包括但不限於啟動子序列、起始密碼子、複製起始點、增強子序列或分泌訊息序列等。

本文所使用的「核酸分子編碼‧‧‧」或其類似用語是指，該核酸分子帶有一或多個編碼特定基因產物之核苷酸序列，而可在適當條件下作為模板表現出該基因產物。應瞭解的是，由於基因密碼(由三個核苷酸所組成)之簡併性，故不同的基因密碼可編碼相同的胺基酸殘基，例如，GAU與GAC，兩者在核苷酸序列上不同，但均編碼相同胺基酸殘基，即天門冬酸(Asp)。針對相同的多肽產物，所屬領域具通常知識者可運用例行技術及已知的基因密碼偏好性(codon usage)，獲得對應的核苷酸序列及其簡併序列。因此，本文所述編碼特定基因產物之核苷酸序列尚包括其簡併序列(可編碼相同基因產物)。

本文所使用之「重組表現卡匣」乙詞係指一藉由重組技術或合成產生之核苷酸序列，得以在宿主細胞中進行基因表現。表現卡匣可嵌入質體或染色體中。典型地，一重組表現卡匣包含欲轉錄之核苷酸序列及調節序列。

在一方面，本發明提供一種分離的核酸分子，其係由SEQ ID NO: 1之核苷酸序列所組成，其具有增強子之活性。具體而言，本發明之分離的核酸分子係分離自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb )基因之下游序列，長度為335 bp，具有強烈提升啟動子活性之效果。

在另一方面，本發明提供一種重組表現卡匣，其包括：

根據本發明，SEQ ID NO: 1之核苷酸序列可與任何適當的含啟動子之核苷酸序列組合形成第一核苷酸片段，以調節第二核苷酸片段編碼的外源蛋白之表現。在一具體實例中，該含啟動子之核苷酸序列係衍生自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb )基因。在一特定實例中，該含啟動子之核苷酸序列係選自SEQ ID NOS: 2至11所組成之群之任一者。在另一特定實例中，SEQ ID NO: 1之核苷酸序列與該含啟動子之核苷酸序列所形成之第一核苷酸片段係選自SEQ ID NO: 2、3、12及13所組成之群之任一者。表1列出SEQ ID NOS: 1至11對應於ckmb 基因之位置。

根據本發明，該第二核酸片段編碼的外源蛋白之表現係由第一核酸片段調控。可依需要選擇所欲表現的外源蛋白實施本發明。在一具體實例中，該外源蛋白係螢光蛋白，包括但不限於綠螢光蛋白(GFP)、藍綠螢光蛋白(CFP)、紅螢光蛋白(RFP)、黃螢光蛋白(YFP)及其修飾形式，例如，強化型綠螢光蛋白(EGFP)、強化型藍綠螢光蛋白(ECFP)、強化型紅螢光蛋白(ERFP)及強化型黃螢光蛋白(EYFP)，以及台灣珊瑚桃紅螢光蛋白TcFP-11，其可由多孔軸孔珊瑚(Acropora millepora )所選殖出，與台灣珊瑚青綠螢光蛋白TcFP-13，其可由軸孔珊瑚(Acropora sp. )所選殖出。在一特定實例中，本發明使用的螢光蛋白係TcFP-11及TcFP-13。

本發明之重組表現卡匣可併入載體，進而導入適當宿主細胞內，以進行轉殖動物之製備或用於生產特定蛋白。

因此，在另一方面，本發明提供一種表現載體，其包括上述重組表現卡匣。

在又一方面，本發明提供一種宿主細胞，其含有前述表現載體。

典型地，本發明之表現載體導入細胞，可在細胞中表現外源蛋白。在一具體實例中，本發明之表現載體導入小鼠肌母細胞，當其受誘導分化成肌管細胞後，會強烈活化表現所編碼的螢光蛋白。因此，本發明可應用於生物反應器(bioreactor)之開發，在動物之肌肉細胞或組織生產所需的外源蛋白。

本發明之載體尚可視需要地包括其他具有特定功能之序列，例如，複製起始點、終止序列、供篩選用途之標記基因，例如，抗生素抗性基因等。此一領域具通常知識者可依現有知識選擇適當的序列，使用習知的遺傳工程技術構築本發明之載體。構築重組載體所需使用的遺傳工程技術，例如，聚合酶連鎖反應(PCR)擴增技術、核酸純化、載體及核酸片段之酵素處理及定序技術，可參見前述Molecular Cloning：A Laboratory Manual及Current Protocols in Molecular Biology(同上)。具體的載體構築細節說明於以下的實例中。

在又一方面，本發明提供一種製備轉殖基因動物之方法，其包含將此處所述之表現載體導入動物的配子、受精卵、胚胎或體細胞的細胞核或細胞質內，使該表現載體所含之核苷酸片段在胚胎或細胞中繼續複製，進而在個體及其後代細胞上表現所編碼的外源蛋白；其中該動物不包含人類。

根據本發明，此處所述「轉殖基因動物」包括但不限於牛、羊、豬、魚、蝦等不包含人纇之動物。特定而言，根據本發明之轉殖基因動物是魚類，更特定而言，為科學上或商業上有應用價值的魚種，包括但不限於斑馬魚(Zebrafish，如Danio rerio )、神仙魚(angelfish，如Pterophyllum 、七彩神仙(discuss))、青鱂魚(medaka)、金魚(goldfish)、鯉魚(carp)、錦鯉(koi)、吳郭魚(tilapia)、孔雀魚(guppy)及劍魚(Xiphophorus)、南美慈鯛(South America Cichlid)如白獅頭(Convict Cichlid)、紅魔鬼(Midas Cichlid)、紫紅火口(Redheaded cichlid)等。

在一特定實例中，根據本發明之轉殖基因動物是斑馬魚。又一特定實例中，根據本發明之轉殖基因動物是神仙魚。

本發明之方法可利用已知的轉殖基因標準技術，例如顯微注射(microinjection)、電破法(electroporation)、病毒載體法(virus infection)及精子載體法(sperm-mediated gene transfer)等方法，使本發明之核酸分子進入動物之配子、受精卵、胚胎或體細胞的細胞核或細胞質內，使本發明核酸分子能在胚胎或細胞中繼續複製，進而在個體及其後代細胞上表現，製得轉殖基因動物。

在一特定實例中，根據本發明之轉殖基因動物是斑馬魚，其係使用顯微注射技術將表現載體導入魚卵細胞中而製得。進一步說明，使用玻璃毛細針吸取適當體積的表現載體，將其注射於單細胞時期之斑馬魚受精卵，將注射完之魚卵集中於乾淨培養皿裡，至於28℃培養箱培養，每日換水並定期觀察。每一批顯微注射胚胎經分析後確認轉殖系統成功作用，即可將此批魚卵養大後進行親代(founder)挑選，再與野生型斑馬魚交配，挑選符合轉殖的組織專一性表現魚隻，並進行品系維持此一領域已發展出各種習知方法辨別或篩選帶有轉殖基因的動物。例如，設計可辨認轉殖基因之探針，以北方墨漬法(Northern blotting)或南方墨漬法(Southern blotting)來偵測候選動物中是否具有轉殖基因的序列，或以PCR針對特定核酸序列放大的方式進行偵測。特定而言，表現螢光蛋白之動物可直接用眼睛觀察。

在一特定實例中，本發明之方法係將編碼螢光蛋白之重組載體導入受精魚卵中，經培養後孵化，直接用眼睛篩選發出螢光的轉殖基因魚。

本發明亦提供一種分離的核酸分子，其具有選自SEQ ID NOS: 2至13所組成之群之核苷酸序列。此等分離的核酸分子具啟動子/增強子活性，可用以實施前述發明。

本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之技術特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而更清楚呈現。

實例 實例1：台灣珊瑚新型螢光蛋白基因TcFP-11與TcFP-13表現載體之構築

本實驗利用台灣珊瑚螢光蛋白基因TcFP-13及TcFP-11之cDNA序列設計引子，PCR反應條件如下：94℃解離2分鐘；94℃解離2分鐘；94℃解離30秒；55℃黏合30秒；68℃合成1分鐘；解離、黏合、合成步驟重複35個循環；最後延伸反應為72℃ 10分鐘，最後保存在4℃下。反應產物經由膠體萃取後與選殖載體(pGEM-T-easy vector)進行接合反應，再轉入勝任細胞中；經由小量培養後抽取選殖載體進行定序，將序列資料與原始序列資料進行比對，並抽取中量高純度質體保存。將接合好的載體利用先前設計的限制酵素切位把TcFP-13及TcFP-11次選殖到pT2-mylz2 -P2.0-AmCyan1(圖1，含斑馬魚肌球蛋白輕鏈2啟動子)取代AmCyan1，完成螢光表現載體：pT2-mylz2 -P2.0-TcFP-11(圖2)及pT2-mylz2 -P2.0-TcFP-13(圖3)。

實例2：斑馬魚 ckmb 基因調節序列之分子選殖及表現載體之構築

本實驗利用基因組瀏覽器Ensembl Genome Browse(http://www.ensembl.org)搜尋斑馬魚ckmb 基因，由起始密碼子(ATG)往5’端方向預測與肌肉生長相關的轉譯音子結合位置，以線上資料庫的程式(Genomatix,www.genomatix.de ,MatInspector program)進行搜尋和預測，以可信度達80%做為挑選指標；選取以下三個片段做為夾取範圍並以此設計引子進行增幅：2363 bp片段(-1202/+1161)、1271 bp片段(-1202/+69)及1343 bp片段(-182/+1161)(序列位置參見圖4)，設定以下條件反應：94℃解離2分鐘；94℃解離30秒；55℃黏合30秒；68℃合成2.5分鐘；解離、黏合、合成步驟重複35個循環；延伸反應為72℃ 10分鐘，最後保存在4℃下。反應產物經由膠體萃取後與選殖載體(pGEM-T-easy vector)進行接合反應，再轉型入勝任細胞中；經由小量培養後抽取選殖載體進行定序，將序列資料與原始序列資料進行比對。以上述步驟選殖出ckmb -P2363片段、ckmb -P1271片段及ckmb -P1343片段，利用限制酵素切位分別次選殖到表現載體pT2-mylz2-P2.0-TcFP-13，取代mylz2-P2.0啟動子，完成以下螢光表現載體：pT2-ckmb -P2363-TcFP-13、pT2-ckmb -P1271-TcFP-13及pT2-ckmb -P1343-TcFP-13。亦可以相同方式構築以下TcFP-11表現載體：pT2-ckmb -P2363-TcFP-11。

實例3：斑馬魚卵的螢光定性實驗

使用實例2之螢光表現載體，以Tol2轉殖系統於斑馬魚卵進行螢光定性實驗，分析ckmb -P2363片段、ckmb -P1271片段及ckmb -P1343片段的表現活性。

收集斑馬魚(Danio rerio )排列在置卵盤中，將含有載體DNA的顯微注射溶液(100 ng/μL)與Tol2轉位子mRNA(100 ng/μL)以1：1的比例混和，以顯微注射器(IM-300 Microinjector,Narishige)配合顯微鏡(LEICAEZ4,LEICA)進行注射，注射條件設定為注射壓力7~10 psi，注射時間為100 msec，並視實際條件略為調整，注入之溶液(以pheno red染劑顏色觀察)約佔卵的1/4，針以45度角自胚胎細胞刺入，注射位置在細胞中或細胞與卵黃介面附近，待進入二細胞期即停止注射，將魚卵置於10公分培養皿，於28℃培養箱發育，以Leica Z16 APO螢光顯微鏡觀察。

圖5及6分別顯示以載體pT2-ckmb -P2363-TcFP-13及pT2-ckmb -P1271-TcFP-13利用顯微注射至單一細胞階段(one-cell stage)斑馬魚受精卵，以螢光顯微鏡觀察2天及3天大的斑馬魚胚胎之暫時性表現。結果顯示ckmb -P2363片段及ckmb -P1271片段在組織專一性方面都具有良好的表現，且具一定程度的啟動子活性，其中ckmb -P2363片段又較ckmb -P1271片段之活性強。

實例4：片段系列刪減之啟動子活性分析

針對ckmb -P1271片段進行系列刪除，藉由啟動子活性分析找出重要的肌肉生成轉錄因子結合位置。

以pT2-ckmb -P1271-TcFP-13為模板進行PCR，設計引子以產生ckmb -P1271片段及其刪減片段如表2所示。

PCR反應條件如下：94℃解離2分鐘；94℃解離30秒；55℃黏合30秒；68℃合成1.5分鐘；解離、黏合、合成步驟重35個循環；延伸反應為72℃ 10分鐘，最後保存在4℃下。反應產物經由膠體萃取，利用ApaI和BamHI限制酵素切位進行限制酵素切割反應後，再次純化DNA片段，將DNA片段分別與含有TcFP-13螢光基因之Tol2載體進行接合反應，再轉型入勝任細胞中；將正確的選殖載體經由中量培養，抽取高純度質體保存，以顯微注射技術方式分啟動子活性。將啟動子活性及專一性分為五個等級，以正號表示。圖7顯示結果。

結果顯示，ckmb -P1271片段表現強度最強，逐漸刪減ckmb -P371片段時，強度明顯下降的趨勢，而刪減至ckmb -P251片段時，強度比ckmb -P371片段略強，刪減至ckmb -P183片段時強度明顯變弱但仍具有肌肉專一性，持續刪減至ckmb -P69片段，其與其他組別相比幾乎沒有表現，但以放大圖檢視仍具有微弱啟動子活性和一定程度的組織表現專一性。

實例5：增強子之選殖

另以前述ckmb P251片段為起始，往下游設計ckmb -P1343片段(-182/+1161)，構築螢光表現載體pT2-ckmb -P1343-TcFP-13，圖8顯示載體構築示意圖。

接著，以Tol2 轉殖系統表現TcFP-13螢光蛋白基因進行定量分析，比較ckmb -P1343片段與ckmb -P1271片段的活性。如圖9顯示，ckmb -P1343片段表現較ckmb -P1271片段強。顯示P251下游1kb內含子1內具有活性較P251上游1kb強的增強子。進一步分析ckmb -P1343片段之序列結構，發現在內含子1中具有335 bp(SEQ ID NO: 1)密集的轉錄因子結合位點，推測具有增強子活性。

為證實335 bp片段之增強子活性，依先前定性分析結果挑選具代表性的載體，將此335 bp片段次選殖至此等載體，其中將螢光蛋白TcFP-13置換成冷光酶(luciferase,Luc)，進行利用冷光定量分析，同時比對不含335 bp片段之載體，藉此測試335 bp片段提升啟動子強度的能力。

測試載體及其序列片段如表3所示。

將上述表現載體分別以50 ng/μL與10 ng/μL內部控制質體pRL-TK以1：1比例混合，以顯微注射方式送入斑馬魚的單一細胞階段受精卵中。待28℃孵化72小時後，每組各取10個發育正常的小魚，使用商業套組(Dual-Luciferase reporter assay system kit,Promega)進行冷光活性分析。圖10顯示結果。

如圖10所示，以pT2-ckmb -P69-Luc所得冷光活性值當做1倍做為數據標準化，pT2-EnIn1-ckmb -P2363-Luc(含二段335 bp片段)產生最高為647倍的冷光活性，與不含335片段之pT2-ckmb -P2363-Luc及pT2-mylz 2-P2.0-Luc相比高出許多，亦比pT2-ckmb -P1343-Luc(含一段335 bp片段)高；且pT2-ckmb -P1343-Luc(含一段335 bp片段)和pT2-ckmb -P1271-Luc(不含335 bp片段)兩組個別相比，兩者具有共同的ckmb -251片段(參見圖8)，前者為後者的6.3倍；又pT2-EnIn1-ckmb -P371-Luc(含一段335 bp片段)與pT2-ckmb -P371-Luc(不含335 bp片段)兩組個別相比，前者為後者的23倍。以上結果證明335 bp片段是一段增強子片段，具有相當強烈的增強活性。

實例6：TcFP-13螢光斑馬魚品系

將含有一個335 bp增強子片段之ckmb -P2363構築之載體pT2-ckmb -P2363-TcFP-13，以Tol2轉位子轉殖系統建立基因轉殖螢光觀賞魚Tg(ckmb-P2363:TcFP-13) ，將F0親代與野生型斑馬魚做交配挑選具有生殖細胞遺傳的親代，F1轉基因魚子代透過肉眼即可觀察到強烈螢光表現(圖11)。

實例7：不同魚種及物種之試驗

將335 bp片段選殖於pT2-ckmb -P2363-TcFP-11，構築含此增強子片段之載體pT2-EnIn1-ckmb -P2363-TcFP-11，以顯微注射法打入一個細胞期神仙魚受精卵中，在親代神仙魚(F0)肌肉可見鑲嵌性表現紅色螢光，證實本研究開發之鯉形目鯉科斑馬魚ckmb 啟動子及增強子片段可強烈專一性表現於不同目(order)之鱸形目慈鯛科神仙魚肌肉(圖12)。

此外，測試根據本發明之pT2-EnIn1-ckmb -P2363-TcFP-13載體在不同物種細胞的活性。使用小鼠C2C12肌母細胞(myoblasts)，其在2%馬血清培養可誘導分化，形成肌管細胞(myotubes)。將pT2-EnIn1-ckmb -P2363-TcFP-13載體導入小鼠C2C12肌母細胞，當改變培養條件使細胞分化成肌管細胞後，會強烈活化表現螢光蛋白，見圖13，顯見根據本發明之ckmb 啟動子及增強子片段除可在魚類肌肉中表現外，亦有應用到其他其他脊椎動物如哺乳類肌肉表現的潛力。另外斑馬魚mylz2啟動子只表現在骨骼肌，但本發明之ckmb 啟動子及增強子片段不只強烈表現在骨骼肌亦可表現在心肌，可同時應用於骨骼肌及心肌之功能性基因研究，亦可應用於以魚類肌肉做為生物反應器(bioreactor)之開發。

上述相關序列如下：

EnIn1(335 bp片段)

ckmb -P1343片段

ckmb -P2363片段

ckmb -P69片段

ckmb -P183片段

ckmb -P227片段

ckmb -P251片段

ckmb -P371片段

ckmb -P511片段

ckmb -P1079片段

ckmb -P1271片段

EnIn1- ckmb -P371片段

EnIn1- ckmb -P2363片段

Mylz2-P2.0

<110>　國立台灣海洋大學

<120>　新穎肌肉增強子序列及其應用

<130>　IN0208/NT00008TW

<160>　14

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　335

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

<400>　1

<210>　2

<211>　1343

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

<400>　2

<210>　3

<211>　2363

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

<400>　3

<210>　4

<211>　69

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

<400>　4

<210>　5

<211>　183

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

<400>　5

<210>　6

<211>　227

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

<400>　6

<210>　7

<211>　251

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

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<210>　8

<211>　371

<212>　DNA

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<400>　8

<210>　9

<211>　511

<212>　DNA

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<400>　9

<210>　10

<211>　1079

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

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<211>　1271

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<211>　706

<212>　DNA

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<400>　12

<210>　13

<211>　2698

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<213>　斑馬魚(Danio rerio)

<400>　13

<210>　14

<211>　1990

<212>　DNA

<213>　斑馬魚(Danio rerio)

<400>　14

圖1顯示pT2-mylz2 -P2.0-AmCyan1載體結構示意圖。

圖2顯示pT2-mylz2 -P2.0-TcFP-11載體結構示意圖。

圖3顯示pT2-mylz2 -P2.0-TcFP-13載體結構示意圖。

圖4顯示根據本發明之ckmb -P2363片段(-1202/+1161)。由ATG(+1162)轉譯起始點往前進行選殖2363 bp片段，序列中標示重要肌肉生長相關轉譯因子結合位置。+1為轉譯起始位置，＊為第二個轉譯起始位置，↓和↑代表1.2 kb啟動子系列刪減位置。下半部陰影部位表示335 bp增強子片段。

圖5顯示根據本發明以載體(a)pT2-ckmb -P2363-TcFP-13及(b)pT2-ckmb -P1271-TcFP-13利用顯微注射至斑馬魚單一細胞階段(one-cell stage)受精卵，以螢光顯微鏡觀察2天大的斑馬魚胚胎之暫時性表現，其中左圖是經HcRed1濾鏡觀察，右圖是亮視野合併圖。曝光時間1000 msec，比例尺為1 mm。

圖6顯示根據本發明以載體(a)pT2-ckmb -P2363-TcFP-13及(b)pT2-ckmb -P1271-TcFP-13利用顯微注射至斑馬魚單一細胞階段受精卵，以螢光顯微鏡觀察3天大的斑馬魚胚胎之暫時性表現，其中左圖是經AmCYAN1濾鏡觀察，右圖是亮視野合併圖。曝光時間500 msec，比例尺為1 mm。

圖7顯示片段系列刪減之啟動子構築示意圖及活性分析結果。虛線部分為未選殖區段，實線部分為實際選殖區段，各形狀區塊表示轉譯因子結合位置，位於實線上方代表順向，位於實線下方代表反向。啟動子活性及專一性依照強度劃分為五個等級，以正號表示，+/-代表與其他組別相比趨近於不表現，但仍具有微弱表現。表示MyoD家族，表示MEF2，表示E-盒子，表示TATA盒子，表示TREX/SIX4，表示MAZ，表示外顯子1，表示外顯子2(在ATG之前)。

圖8顯示pT2-ckmb -P1343-TcFP-13載體構築示意圖。表示MyoD家族，表示MEF2，表示E-盒子，表示SIX4/MEF3，表示MAZ，表示TATA盒子，表示外顯子1，表示外顯子2(在ATG之前)。

圖9顯示根據本發明以載體pT2-ckmb -P1271-TcFP-13及pT2-ckmb -P1343-TcFP-13利用顯微注射至斑馬魚單一細胞階段受精卵，以螢光顯微鏡觀察3天大的斑馬魚胚胎之暫時性表現。曝光時間500 msec，比例尺為1 mm。

圖10顯示以各種載體利用顯微注射至斑馬魚單一細胞階段受精卵，使用商業套組進行冷光活性分析之結果。

圖11顯示根據本發明製備之基因轉殖螢光觀賞魚Tg(ckmb-P2363:TcFP-13)F1子代。

圖12顯示根據本發明以斑馬魚ckmb 調節序列表現台灣珊瑚紅色螢光蛋白(TcFP-11)的親代神仙魚(F0，二個月)，其肌肉可見鑲嵌性表現紅色螢光。

圖13顯示根據本發明以pT2-EnIn1-ckmb -P2363-TcFP-11載體導入小鼠C2Cl2肌母細胞，經誘導分化成肌管細胞後，觀察到強烈的螢光蛋白表現，其中(a)是可見光圖，(b)是螢光圖以及(c)是合併圖。

Claims

一種分離的核酸分子，其係由SEQ ID NO：1之核苷酸序列所組成，其具有增強子之活性。
一種重組表現卡匣，其包括：(a)第一核苷酸片段，其包括一含啟動子之核苷酸序列及SEQ ID NO：1之核苷酸序列；及(b)第二核苷酸片段，其編碼外源蛋白且操作地與第一核酸片段連接，使得該外源蛋白在第一核苷酸片段之調控下表現。
根據申請專利範圍第2項之重組表現卡匣，其中該含啟動子之核苷酸序列係衍生自斑馬魚肌肉型肌酸激酶b(ckmb )基因。
根據申請專利範圍第2項之重組表現卡匣，其中該含啟動子之核苷酸序列係選自SEQ ID NOS：2至11所組成之群之任一者。
根據申請專利範圍第2項之重組表現卡匣，其中該第一核苷酸片段係選自SEQ ID NO：2、3、12及13所組成之群之任一者。
根據申請專利範圍第2項之重組表現卡匣，其中該外源蛋白係螢光蛋白。
一種表現載體，其包括根據申請專利範圍第2至6項中任一項之重組表現卡匣。
一種宿主細胞，其包括根據申請專利範圍第7項之表現載體。
一種製備轉殖基因魚之方法，其包括將根據申請專利範圍第7項之表現載體導入魚的配子、受精卵、胚胎或體細胞的細胞核或細胞質內，使該表現載體所含之核苷酸片段在胚胎或細胞中繼續複製，進而在個體及其後代細胞上表現所編碼的外源蛋白。
根據申請專利範圍第9項之方法，其係使用顯微注射技術將該表現載體導入魚的受精卵中。
根據申請專利範圍第9項之方法，其中該魚係斑馬魚或神仙魚。
一種分離的核酸分子，其係由選自SEQ ID NOS：2、3、12及13所組成之群之核苷酸序列所組成，可作為啟動子片段。