CN1739346A - 一种牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法 - Google Patents

一种牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，首先观察一定培育水温下第一次卵裂的发生时间，由此确定处理的最佳效应期范围，然后进行了处理温度和处理时间的筛选实验，获得了各自的范围。选取发育正常的牙鲆雌鱼和雄鱼，分别挤取成熟卵、精液，行人工授精，使用筛选获得的低温处理参数进行诱导实验：抑制牙鲆受精卵第一次卵裂，使染色体组加倍，产生四倍体胚胎。经染色体直接计数法测定诱导率为6.2－11.2％，其卵子相对启动率为50～70％。该发明方法简单，容易掌握，适用于养殖生产应用。

Description

一种牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法
技术领域
本发明涉及海水鱼类染色体操作技术，具体地说是一种我国重要海水养殖对象-牙鲆四倍体的诱导方法。
背景技术
受精卵第一次卵裂的抑制是产生四倍体或与精子灭活技术结合产生同质雌核发育二倍体的关键技术。虽然日本学者曾采用静水压法进行牙鲆受精卵第一次卵裂的抑制与精子灭活技术结合产生了牙鲆同质雌核发育二倍体，但静水压法需要用特殊的仪器(水静压仪)，成本较高，而我们采用的是低温休克法，方法简单易行，适于应用；另外，采用上述方法，其成活率虽然高一些，但诱导率却并不高，为2.7-5.3％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，根据我国的国情和应用的可行性，我们一开始除了采用自行设计改造的水静压机进行诱导外，也一直进行了低成本的低温法进行牙鲆受精卵第一次卵裂的抑制研究，并获得了一定的诱导率。
本发明的技术方案是：
首先观察一定培育水温下第一次卵裂的发生时间，由此确定处理的最佳效应期范围，这也是第一次卵裂有效抑制的关键点。然后通过多次的梯度实验和重复实验，最终确定了处理时刻区间。依此为基础，又进行了处理温度和处理时间的筛选实验，获得了各自的范围，采用筛选出各处理因子的适宜条件进行重复诱导实验，最终获得了第一次卵裂抑制的胚胎-四倍体胚胎。诱导的具体方法如下：选取发育正常的牙鲆雌鱼和雄鱼，分别挤取成熟卵、精液，行人工授精，卵启动75-100min，置于0-5℃，30-55min，抑制激活卵子的第一次卵裂，使染色体组加倍，产生四倍体，将牙鲆四倍体诱导组置于正常海水中培育，发育至原肠期时，取其100粒左右进行染色体制片，以检测其诱导效果。
所述牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，较佳为：卵启动80-90min，置于0-3℃下，时间40-50min。
本发明原理是：
采用略高于致死温度(低温)的温度来终止已经进行染色体复制但还未开始的第一次卵裂(此时受精卵处于有丝分裂中后期)。
与其他研究报道相比，本发明的特点有：
1、本发明通过我们的反复实验证明，采用低温方法的确可以抑制牙鲆受精卵的第一次卵裂，从而获得一定比例的牙鲆四倍体。
2、采用该发明方法可以诱导产生一定比例的牙鲆四倍体，其诱导率为6.2-11.2％，虽然比例并不太高，但是采用染色体计数的直接方法来检测的，其卵子相对启动率为50～70％。该发明方法简单，容易掌握，适用于将来的推广应用。而现有技术得到的诱导率是2.7-5.3％，则是用同工酶法这种间接方法检测得到的。
3、本发明工艺简单、成熟、成本低，可以诱导出牙鲆四倍体，而且只要用海水冰甚至普通淡水冰就可以实施本实验，不需要其它过多投资。
4、本发明不仅可以用于牙鲆四倍体的诱导，结合紫外照射灭活精子遗传物质技术，也适用于牙鲆同质雌核发育二倍体诱导；其技术方案和其中的一些处理参数也适用于其它海水鱼类的四倍体和同质雌核发育二倍体诱导。因此，其适用范围较广。
具体实施方式
下面结合实例详述本发明。
实施例1
选取成熟的牙鲆雌鱼和雄鱼，分别挤取成熟卵、精液，镜检其质量无误后，行半干湿法人工授精，2min后洗卵置于正常海水(15℃)中恒温培育。卵启动85min时，放于2℃海水中处理45min，使染色体组加倍，牙鲆四倍体诱导组放于正常海水(15℃)中培育，发育到原肠期时，取其100粒左右采用普通空气干燥法进行染色体制片，经镜检计数获得其诱导率为11.2％，卵子相对启动率为55％。
实施例2
选取成熟的牙鲆雌鱼和雄鱼，分别挤取成熟卵、精液，镜检其质量无误后，行半干湿法人工授精，2min后洗卵置于正常海水(15℃)中恒温培育。卵启动80min时，放于0℃海水中处理40min，使染色体组加倍，牙鲆四倍体诱导组放于正常海水(15℃)中培育，发育到原肠期时，取其100粒左右采用普通空气干燥法进行染色体制片，经镜检计数获得其诱导率为7.2％，卵子相对启动率为50％。
实施例3
选取成熟的牙鲆雌鱼和雄鱼，分别挤取成熟卵、精液，镜检其质量无误后，行半干湿法人工授精，2min后洗卵置于正常海水(15℃)中恒温培育。卵启动90min时，放于2～3℃海水中处理50min，使染色体组加倍，牙鲆四倍体诱导组放于正常海水(15℃)中培育，发育到原肠期时，取其100粒左右采用普通空气干燥法进行染色体制片，经镜检计数获得其诱导率为6.2％，卵子相对启动率为70％。

Claims (2)

1、一种牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，其特征在于诱导方法如下：选取发育正常的牙鲆雌鱼和雄鱼，分别挤取成熟卵、精液，行人工授精，卵启动75-100min，置于0-5℃，30-55min，抑制激的卵子的第一次卵裂，使染色体组加倍，产生四倍体，将牙鲆四倍体诱导组置于正常海水中培育，发育至原肠期时，取样进行染色体制片，以获得诱导效果。
2、按照权利要求1所述牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，其特征在于：所述卵启动80-90min，置于0-3℃下，时间40-50min。
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