CN114874998B

CN114874998B - 一种鲤浮肿病毒体外分离培养方法

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Publication number: CN114874998B
Application number: CN202210810758.6A
Authority: CN
Inventors: 施雯; 刘敏; 任宣宇
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-07-11
Filing date: 2022-07-11
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2042-07-11
Also published as: CN114874998A

Abstract

本发明涉及一种鲤浮肿病毒体外分离培养方法，属于兽用生物制品技术领域，解决了目前鲤浮肿病毒不能体外培养的问题。本发明采用未感染任何病原体的健康松浦镜鲤幼鱼的头肾组织进行酶解处理，对其进行原代细胞培养，将过滤除菌的鲤浮肿病毒阳性的鳃组织匀浆液接种于鲤头肾原代细胞上，对培养后的病毒进行PCR鉴定；测序结果比对，与已公布的鲤浮肿病毒核苷酸序列同源性均为98%以上，说明鲤浮肿病毒能够在鲤头肾原代细胞上分离培养并稳定增殖。本发明的方法实现了鲤浮肿病毒体外细胞传代培养，对该病毒的基础生物学特性研究及疫苗的研发奠定了基础，本发明的方法的实验材料获取广泛，易于实验室操作，能够适用于鲤浮肿病毒体外培养及增殖。

Description

一种鲤浮肿病毒体外分离培养方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鲤浮肿病毒体外分离培养方法。

背景技术

鲤浮肿病毒(carp edema virus，CEV)又名鲤痘病毒，隶属痘病毒科（poxvirus），CEV主要侵染鳃组织器官，感染养殖鲤或锦鲤引起以嗜睡、全身性水肿、鳃增生坏死为主要症状的鲤浮肿病（carp edema virus disease，CEVD），也称鲤鱼昏睡病（koi sleepydisease，KSD）。该病传播范围广，该病流行范围广，传播速度快，致病率高达100%，致死率高达90%以上，鲤浮肿病的暴发及流行给近全球的水产养殖业造成了巨大的经济损失。

普通鲤鱼是世界上三大淡水养殖品种之一，2016年养殖量达455.7万吨，我国作为鲤鱼的传统养殖大国，养殖量可达到335.8万吨，占全世界总量73.7%，是鲤鱼养殖第一大国。而锦鲤又是贸易最广泛的观赏鱼品种。鲤鱼浮肿病已经成为全球流行的病毒性传染病，尤其是幼鱼感染后更容易死亡，死亡率高达90%以上，对鲤鱼养殖行业的威胁很大。目前并没有能够治疗该病的特效药，而预防病毒性疾病最有效的手段就是接种疫苗，其主要原因是鲤浮肿病毒没有合适的易感细胞，无法进行鲤浮肿病毒的体外分离培养，在一定程度上制约鲤浮肿病毒分子生物学的研究发展，严重阻碍鲤浮肿病的防治。因此，筛选鲤浮肿病毒的易感细胞，建立鲤浮肿病毒体外分离培养方法，对该病毒的基础生物学特性研究及疫苗的研发具有重要的理论与实践意义。

发明内容

本发明提供一种鲤浮肿病毒体外分离培养方法，能够解决目前鲤浮肿病毒不能体外培养的问题。

本发明所采用的技术方案如下：一种鲤浮肿病毒体外分离培养方法，方法步骤如下：

步骤一、采集鲤头肾组织：采用未感染任何病原体的健康松浦镜鲤幼鱼的头肾组织，浸泡于预冷的PBS试剂中，并反复冲洗；再将鲤头肾组织剪成碎块，用预冷的PBS试剂反复冲洗，并弃去PBS试剂；

步骤二、消化鲤头肾组织块：将鲤头肾组织块转移到0.05% W/V的胰蛋白酶溶液中，37℃水浴，观察消化的组织块表面有白色絮状出现，组织块松散即可从水浴中取出；

步骤三、终止消化鲤头肾组织块：向装有鲤头肾组织块的胰蛋白酶溶液中加入含有10% V/V 胎牛血清的L15培养液终止消化；

步骤四、鲤头肾原代细胞培养：将消化后的细胞悬液用100目灭菌滤网过滤，离心，弃去上清；用L15培养液重悬，细胞液调整密度后接种于用0.1% W/V明胶处理的细胞培养板，置于25 ℃，气体体积百分数5% CO₂培养，培养72 h后每隔2天换液一次；

步骤五、接种鲤浮肿病毒：鲤头肾原代细胞长满致密单层后弃掉培养液，用PBS试剂清洗一遍细胞，将过滤除菌的鲤浮肿病毒阳性的鳃组织匀浆液用2倍体积L15培养液稀释，接种于鲤头肾原代细胞上，吸附后，加入L15培养液，放置在25℃培养箱培养，对照组不接种病毒只加入L15培养液；

步骤六、病毒的培养与收获：每日观察是否有病变产生，病毒培养7 d后进行收获，保存在-20℃并反复冻融；

步骤七、病毒的鉴定：对病变的鲤头肾原代细胞采用鲤浮肿病诊断规程推荐的套式PCR引物进行鉴定；测序结果比对，与已公布的鲤浮肿病毒核苷酸序列同源性均为98%以上，说明鲤浮肿病毒能够在鲤头肾原代细胞上分离培养并稳定增殖。

进一步的，步骤一中，所述的松浦镜鲤幼鱼体长8~12 cm，体重25~40g。

进一步的，步骤一中，所述的PBS试剂含有300-500U/ml青链霉素。

进一步的，步骤二中，所述的胰蛋白酶溶液中含有0.02% W/V 的EDTA二钠。

进一步的，步骤三中，所述的L15培养液还含有300-500U/ml青链霉素。

进一步的，步骤四中，所述的离心参数为500 g、5 min。

进一步的，步骤四中，所述的细胞液调整后的密度为8×10⁶个/mL。

进一步的，步骤四中，所述的L15培养液中用含有20% V/V胎牛血清。

进一步的，步骤五中，采用吸附1 h后，加入的L15培养液含5% V/V胎牛血清，对照组加入的L15培养液也含5% V/V胎牛血清。

本发明的优点及有益效果：本发明的方法实现了鲤浮肿病毒体外细胞传代培养，解决了目前鲤浮肿病毒不能体外培养的问题，对该病毒的基础生物学特性研究及疫苗的研发奠定了基础，本发明的方法的实验材料获取广泛，易于实验室操作，能够适用于鲤浮肿病毒体外培养及增殖，为鲤浮肿病毒易感细胞系的建立提供了新的依据。

附图说明

图1为病料的PCR诊断结果图；

图2为扩增序列与Geenbank已公布鲤浮肿病毒的毒株P4a序列比对结果图；

图3为鲤浮肿病毒接种鲤头肾脏原代细胞培养结果图；

图4为鲤头肾原代细胞的鲤浮肿病毒培养毒的套式PCR鉴定结果图。

具体实施方式

下面举例对本发明做进一步的说明：

实施例1

病料的鉴定

1.材料与方法

1.1病料

松浦镜鲤，采自辽宁省辽中市的某鲤鱼养殖场疑似感染鲤浮肿病毒的病鱼，病鱼体长在26~30cm；

1.2主要试剂

2×Es Taq MasterMix购自康为世纪生物科技有限公司（北京）；2×SYBR qPCRMix试剂盒购自上海Bimake公司；反转录酶RT Ace、反转录酶抑制剂RRI、RIoligo dT、DNAMarker2000试剂盒及本研究中涉及的限制性内切酶购自宝生物工程有限公司（大连）；总DNA极速抽提试剂盒（OMEGA）购自广州飞扬生物工程有限公司（广州）；

1.3菌种及质粒

pMD19-T-Simple载体购自大连宝生物（Takara）公司；大肠杆菌感受态细胞TG1由本实验室保存；

1.4引物合成

检测鲤浮肿病毒的引物是鲤浮肿病诊断规程推荐的套式PCR引物，在金唯智生物有限公司合成。引物序列为：外套上游引物BF：5'-ATGGAGTATCCAAAGTACTTAG-3'，外套下游引物BR：5'-CTCTTCACTATTGTGACTTTG-3'，扩增目的片段大小为528 bp；内套上游引物IF：5'-GTTATCAATGAAATTTGTGTATTG-3'，内套下游引物IR：5'-TAGCAAAGTACTACCTCATCC-3'，扩增目的片段大小为478 bp；

1.5病料的处理

在超净台中无菌环境下取鳃组织，加入液氮进行研磨，用3倍体积的PBS重悬后经0.22微米滤器进行无菌过滤；

1.6病料的DNA提取

参照总DNA提取试剂盒（OMEGA)说明书提取病料组织的总DNA；

（1）将病料组织匀浆液加入200µL TL Buffer；

（2）加入25µL OB Protease Solution，涡旋混匀，放置在55℃水浴摇床中振荡孵育，直至组织完全消化。如果不具备水浴摇床，水浴期间每隔20-30 min就要拿出涡旋混匀一次；

（3）加入5µL RnaseA（25mg/mL）混合均匀，室温下放置2-5 min；

（4）常温下，10,000×g离5 min除去不溶解的杂质，将上清液转移到新的1.5 mL离心管中，留下不溶解的杂质；

（5）加入220 µL BL Buffer，涡旋混合均匀，温度为70℃，水浴10 min，加入BufferBL；

（6）加入220µL无水乙醇（常温，浓度96-100%），10,000×g转速下涡旋充分混匀；

（7）将HiBind®DNA结合柱套入2 mL收集管中，将第6步得到的所有溶解液包括沉淀物转入HiBind®DNA结合柱中，8,000×g离心1 min以结合DNA，弃滤液和收集管；

（8）将HiBind®DNA结合柱套入新的2 mL收集管中，并加入500µL HBC Buffer至HiBind®DNA结合柱中，8,000×g离心1 min，弃去滤液和收集管；

（9）将HiBind®DNA结合柱套入新的2 mL收集管中，并加入700 µLDNA WashBuffer 至HiBind® DNA 结合柱中，8,000×g离心1 min，弃去滤液；

（10）重复步骤9，用DNA Wash Buffer进行二次洗涤；

（11）将HiBind®DNA结合柱套入同一个2 mL收集管中，12,000×g离心2 min甩干，以干燥HiBind®DNA结合柱的基质；

（12）将HiBind®DNA结合柱套入新的1.5 mL灭菌离心管，加入50-200µL预热至70℃ Elution Buffer，滴加在HiBind®DNA结合柱的膜中央，室温静置3 min；

（13）室温下，10,000×g离心1 min，洗脱DNA；

（14）重复步骤12-13；

（15）将洗脱的DNA放在-20℃保存；

1.7目的基因的扩增

采用鲤浮肿病诊断规程推荐的套式PCR引物进行鉴定：

采用2×MasterMix25 µL，10pmol/µL上游和下游引物各2 µL，模板5 µL，DEPC水补至50µL的反应体系进行两轮PCR扩增，如表1-2所示。反应条件为95℃预变性4 min，95℃变性1 min，45℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环后72℃延伸10 min，4℃保存，如表3所示。PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖电泳，核酸染色剂染色。电压150 V，电泳30 min，标准分子量作对照，结果用凝胶成像系统处理。将PCR阳性产物进行测序，测序结果在NCBI上进行blast对比。

表1鲤浮肿病毒的PCR反应体系（第一轮）

表2鲤浮肿病毒的PCR反应体系（第二轮）

表3鲤浮肿病毒的PCR反应条件

1.8 PCR扩增产物的纯化胶回收

参照胶回收纯化试剂盒说明书对上述获得的鲤浮肿病毒的478 bp段PCR产物进行胶回收纯化。操作如下：

（1）当所需要的DNA 478 bp片段完全分离后，将凝胶移至紫外灯上，将需要的DNA片段切掉，目的条带大小为478 bp。注：切胶时尽量将多余的凝胶除去，DNA曝露在紫外线照射下不得超过30 s；

（2）将离心管称重，再将带有目的片段478 bp的凝胶块转移至1.5 mL EP管中，称重得出总重量，再计算凝胶重量然后计算其体积。加入与凝胶相同体积的XP2 BindingBuffer，放置在50-60℃水浴中温浴至凝胶融化，每过2-3 min进行一次振荡或者涡旋混匀；

（3）将HiBind®DNA Mini结合柱套入在2 mL收集管中；

（4）将得到的DNA熔胶液转移到HiBind®DNA Mini结合柱。在常温下离心，10,000×g 1 min。弃去滤液，将结合柱套回2 mL收集管；

（5）在结合柱中加入300µL Binding Buffer，常温离心，13,000×g1 min，弃滤液；

（6）将结合柱套入2 mL 收集管。加入700µL SPW Buffer。室温10,000×g离心1min，弃去滤液；

（7）重复步骤6；

（8）将结合柱套回2 mL收集管。室温下13,000×g离心2 min，甩干结合柱中残余的基质液体；

（9）将结合柱放入在一个新的1.5 mLEP管中，加入30µL的经过预热的ElutionBuffer到结合柱的基质上，室温静置1 min，13,000×g离心1 min，洗脱DNA，得到的DNA命名为L-3，放置在-20℃保存；

1.9质粒pMD19-T-L-3的连接转化

胶回收得到的PCR产物L-3与克隆载体（pMD19-T-Simple）连接，连接反应体系如表4所示：

表4 pMD19-T-L-3连接反应体系

将上述10 µL的体系充分混匀后，置于金属连接仪中连接4 h，温度设定为16℃。4h后将连接产物通过热转化法导入大肠杆菌TG1感受态细胞中。具体操作步骤如下：

取出放置在-80℃冰箱中保存的大肠杆菌TG1感受态细胞，置于冰水混合物中5min；

（1）待TG1感受态细胞于冰水中融化后，将10 µL连接产物和100 µL感受态细胞在无菌条件下轻柔混匀，冰浴处理30 min；

（2）冰浴完成后，于42℃水浴中热激90 s，然后冰浴2-5 min；

（3）无菌条件下，加入无抗的800µL LB液体培养基；

（4）将EP管固定于37℃恒温震荡培养箱中，190 r/min震荡培养1 h；

（5）无菌条件下，取150 µL上述菌液均匀涂布在LB筛选平板上（Amp+抗性）；将平板倒置于37℃恒温培养箱中静置培养8-12h；

1.10质粒pMD19-T-L-3的提取

（1）在5 mL LB/抗生素培养液中接种E.coli（带有质粒），放置在摇床培养，温度37°C，时间12~16 h；

（2）取5 mL的菌液，在室温下，10,000×g离心1 min然后收集细菌；

（3）弃掉培养基，加入250µl Solution I和RNaseA混和液，漩涡振荡充分，使细菌悬浮；

（4）将250µL的Solution II加入到重悬混和液中，慢慢地颠倒混匀10次。此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5 min；

（5）加入350µl Solution III，慢慢颠倒数次，直至出现白色絮狀沉淀；

（6）13,000×g离心10 min，温度室温即可；

（7）将上清液转移至HiBind®Miniprep DNA 结合柱中并放置在2 mL的收集管中，室温13,000×g离心1 min，弃掉收集管中的滤液；

（8）将结合柱重新装入收集管中，加500 µL HBC Buffer，室温下13,000×g离心1min，弃滤液；

（9）将结合柱重新装入收集管中，加700 µL DNA Wash Buffer，室温下13,000×g离心1 min，弃滤液；

（10）重复步骤9；

（11）弃液，将结合柱重新装入收集管，13,000×g空离2 min甩干结合柱中的残留基质；

（12）将结合柱装入新的无菌1.5 mL EP管上，加入30-100µl Elution Buffer到结合柱基质中，静置1 min，13,000×g离心1 min洗脱出DNA；

（13）将洗脱的DNA在超微量紫外分光光度计下测出浓度并记录后，保存在-20℃；

1.11目的片段的序列分析

将pMD19-T-L-3质粒送予吉林库美科技有限公司进行测序，利用DNAMAN 6软件比较质粒目的片段的核酸序列与GeneBank已公布的鲤浮肿病毒的P4a序列同源性，从而确定病料是否为鲤浮肿病毒阳性；

2.结果与分析

2.1病料的PCR诊断结果

使用鲤浮肿病毒的特异性引物进行PCR扩增，结果如图1所示，1：鳃外套PCR结果；2：鳃内套PCR结果；3：水对照。可见鲤浮肿病毒内套引物扩增出特异性条带；

2.2病料扩增目的片段的序列分析

病料扩增的序列与已公布的波兰病毒株55-2013（KX254004）和687-2014（KX254000）同源性为99.09%，如图2所示，判定该病料为鲤浮肿病毒阳性，将该分离毒株命名为CEV L-3株。

实施例2

鲤头肾原代细胞的培养

1.材料与方法

1.1试验动物及饲养条件

试验动物为松浦镜鲤（Cyprinus carpio 'songpu mirror carp'），是中国水产科学研究院黑龙江水产科学研究所利用德国镜鲤第四代选育系（F4）与散鳞镜鲤杂交而成功选育得到的一个镜鲤品种；

试验动物购自哈尔滨市农业科学院，体长8~12 cm，体重25~40g的松浦镜鲤幼鱼，经PCR检测未感染鲤浮肿病毒（CEV），鲤疱疹病毒（KHV），鲤春病毒血症病毒（SVCV）。试验开始前放置在室内恒温水族箱中饲养，每个水族箱大小为（2.0 mｘ0.6 mｘ1.0 m），水温为18~20℃，溶氧大于10 mg·L^-1，每日投喂两次，投喂量约为鱼体重的2%，每日清理动物粪便，周期为3 d换水一次，24 h供给氧气；

1.2主要试剂

胰蛋白酶、L15培养基、明胶购自GIBCO公司；胎牛血清购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；氨苄青霉素和链霉素为Sigma公司进口分装；

1.3鲤头肾原代细胞的培养

用丁香酚麻醉实验鲤鱼，剪断脑后神经，放于解剖盘上，用75%乙醇体表消毒，剪断鳃弓放血。

（1）鲤头肾的处理

无菌条件下取出头肾组织，浸泡于预冷的PBS（含300-500U/ml青链霉素）并反复冲洗3次。用剪刀将组织剪碎成约1mm³碎块，用预冷的PBS（含300-500U/ml青链霉素）充分漂洗并弃去PBS液。

（2）胰蛋白酶消化组织块

1、将头肾组织块转移入加有0.05% W/V 胰蛋白酶（含0.02% EDTA二钠）中消化，37℃水浴，每隔15 min摇晃一次，观察消化状态。

2、约20~40 min，观察消化的组织块表面有白色絮状出现，组织块松散。此时即可消化终止，将装有组织块的胰蛋白酶消化瓶从37℃水浴中取出，放入生物安全柜内准备终止消化。

3、弃掉胰酶，加入5 mL含有10% V/V胎牛血清的L15培养液（含300-500U/ml青链霉素）终止消化。

4、消化后的细胞悬液用100目灭菌滤网过滤，500 g离心5 min，弃去上清。用20%V/V 胎牛血清的L15培养液（含300-500U/ml青链霉素）重悬，调细胞液的密度为8×10⁶个/mL后，接种于用0.1% W/V 明胶处理的24孔细胞培养板，置于25 ℃，5% CO₂培养。48 h内勿动细胞培养板，培养72 h后每隔2天换液一次。

实施例3

鲤浮肿病毒的体外培养与鉴定

1.材料与方法

1.1接种鲤浮肿病毒

鲤头肾原代细胞长满致密单层后弃掉培养液，用PBS清洗一遍细胞。将过滤除菌的鲤浮肿病毒阳性鳃组织匀浆液用2倍体积无血清L15培养液稀释，接种于鲤头肾原代细胞上，吸附1 h后加入L15培养液（含5% V/V胎牛血清），放置在25℃培养箱培养，对照组不接种病毒只加入L15培养液（含5% V/V胎牛血清）；

1.2病毒的培养与收获

每日观察是否有病变产生，病毒培养7 d后进行收获，保存在-20℃并反复冻融3次；

1.3病毒的鉴定

采用鲤浮肿病诊断规程推荐的套式PCR引物进行鉴定，鉴定阳性样品送予测序；

2.结果与分析

2.1鲤浮肿病毒接种鲤头肾脏原代细胞培养结果

在第10代盲传的细胞出现少量细胞脱落的现象，细胞产生病变，将所得病毒继续繁殖，在第17代细胞中出现明显的CPE，病变现象在显微镜下观察到有大量细胞脱落，如图3所示，a:接种L-3第24h的肾脏原代细胞；b: 接种L-3第168h的肾脏原代细胞； c:对照组；

2.2鲤头肾原代细胞的鲤浮肿病毒的培养毒的套式PCR鉴定结果

提取细胞DNA经过PCR检测，外套PCR出现特异性条带528 bp，内套也出现了CEV的特异性条带478 bp。测序结果比对，与已公布的鲤浮肿病毒核苷酸序列同源性均为98%以上，说明鲤浮肿病毒能够在鲤头肾原代细胞上分离培养并稳定增殖。PCR鉴定如图4所示，1：第17代CEV L-3外套PCR结果；2：17代CEV L-3外套PCR结果；3：阴性对照PCR外套结果；4：阴性对照PCR内套结果。

Claims

1.一种鲤浮肿病毒体外分离培养方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一、采集鲤头肾组织：采用未感染任何病原体的健康松浦镜鲤幼鱼的头肾组织，浸泡于预冷的PBS试剂中, 所述的PBS试剂含有300-500U/ml青链霉素，并反复冲洗；再将鲤头肾组织剪成碎块，用预冷的PBS试剂反复冲洗，并弃去PBS试剂, 所述的松浦镜鲤幼鱼体长8~12 cm，体重25~40g；

步骤二、消化鲤头肾组织块：将鲤头肾组织块转移到0.05% W/V的胰蛋白酶溶液中, 所述的胰蛋白酶溶液中含有0.02% W/V 的EDTA二钠，37℃水浴，观察消化的组织块表面有白色絮状出现，组织块松散即可从水浴中取出；

步骤三、终止消化鲤头肾组织块：向装有鲤头肾组织块的胰蛋白酶溶液中加入含有10%V/V 胎牛血清的L15培养液终止消化， L15培养液还含有300-500U/ml青链霉素；

步骤四、鲤头肾原代细胞培养：用消化后的细胞悬液用100目灭菌滤网过滤在参数500g下离心5 min，弃去上清；用L15培养液重悬，L15培养液中含有20% V/V胎牛血清，调整细胞液的密度为8×10⁶个/mL,接种于用0.1% W/V明胶处理的细胞培养板，置于25 ℃，气体体积百分数5% CO₂培养，培养72 h后每隔2天换液一次, 所述的细胞液调整后的密度为8×10⁶个/mL；

步骤五、接种鲤浮肿病毒：鲤头肾原代细胞长满致密单层后弃掉培养液，用PBS试剂清洗一遍细胞；将过滤除菌的鲤浮肿病毒阳性的鳃组织匀浆液用2倍体积L15培养液稀释，接种于鲤头肾原代细胞上，吸附1 h后，加入L15培养液，L15培养液含5% V/V胎牛血清，放置在25℃培养箱培养，对照组不接种病毒只加入L15培养液，其中，对照组加入的L15培养液也含5% V/V胎牛血清；

步骤六、病毒的培养与收获：每日观察是否有病变产生，病毒培养7 d后进行收获，保存在-20℃并反复冻融，盲传多代；

步骤七、病毒的鉴定：对病变的鲤头肾原代细胞采用鲤浮肿病诊断规程推荐的套式PCR引物进行鉴定；测序结果比对，与已公布的鲤浮肿病毒核苷酸序列同源性为98%以上，说明鲤浮肿病毒能够在鲤头肾原代细胞上分离培养并稳定增殖。