CN108265124A - 一种与油菜根表面积关联的分子标记及应用 - Google Patents
一种与油菜根表面积关联的分子标记及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与油菜根表面积关联的分子标记及应用。本发明首次获得了与油菜根表面积显著关联的基因组单倍型区域，位于油菜C08染色体的第32,337,226碱基至第32,365,749碱基之间，位于其中第32340658碱基处的SNP（单核苷酸多态性）标记的显著水平最高，可解释15.76％的表型变异。根据该分子标记设计的引物为S42‑F：CGGTTACGTTAATAGTTATCCGAA，S42‑R：TGTAGTTTTTCACATCACATTAAGG。通过检查与油菜根表面积显著关联的分子标记S42，即可预测油菜根表面积大小，进而快速准确筛选根表面积较大的优良单株。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与甘蓝型油菜根表面积显著关联的基因组单倍型区域，以及基于此开发的与甘蓝型油菜根表面积显著关联的分子标记及其应用。
背景技术
近年来，我国国产植物油自给率仅为35％左右，严重威胁着我国食用油供给安全(华玮等，2016)。油菜是我国第一大油料作物(Hu等，2016)，菜籽油是国产食用植物油的第一大来源。然而，与加拿大等菜籽出口国相比，我国油菜产业存在着产油量不高的问题，制约了其国际竞争力。在城镇化规模持续扩大耕地面积进一步缩小的形势下，持续提高单位面积产油量是主要出路。目前我国油菜高油份育种取得突破(傅廷栋，2014)而单产仍然低于世界平均水平(http://apps.fas.usda.gov/psdonline/)且增加十分缓慢，这严重影响了农民种植油菜的经济效益和油菜产业的国际竞争力。因此，如何提高油菜单产是保证我国食用油安全的关键。
根系是土壤与植物地上部之间物质交换的重要桥梁，根系发达有利于植株固定、水分和养分吸收利用以及植物激素合成、分泌和转运等。根系构型是植物根系生长和分支的综合表现，它主要通过影响根系对土壤中空间异质性分布的水分和养分的吸收和利用来影响植物地上部的生物量、单株产量(Meister et al.,2014)。在水稻、大豆、玉米、小麦中，国内外大量研究表明根系构型性状与生物量、单株产量之间存在显著相关性(金剑等，2004；刘永霞等，2010；周广生等，2010；褚光等，2014；田中伟等，2015；Moudal and Kuleet,2004；Partha et al.,2004)。油菜是单株生产力较强的油料作物，其植株的生产力依赖于根系的强有力支撑，目前许多栽培措施都是通过影响根系功能来改变植株对土壤水分和养分的利用效率从而达到高产的目的，因此，构建优良根系构型是提高油菜生产力的有效途径。
近年来人们已经逐渐认识到根系性状分子机制解析对作物遗传改良的重要性，并开展了相关工作。目前已发表的水稻、玉米、小麦等农作物根系性状相关QTL多达数百个，主要侧重于根茎粗、根干重、总根长、总根数和根系活力等(班超等，2009；任永哲等，2011；Maiet al.,2014；Meister et al.,2014；Manavalan et al.,2015；Song W et al.,2016)。其中一些调控根系性状的主效QTL位点可以解释30％以上的表型变异，甚至有在生产上直接应用的潜力(Uga et al.,2011；Li JZ et al.,2015；Salvi et al.,2016)。但是在油菜中关于根系形态的QTL的克隆目前还没有报道。本发明通过对油菜根表面积性状的全基因组关联分析，旨在找到对油菜根表面积具有改良效应的基因组区域，并基于此开发实用的分子标记，用于油菜根系育种改良的标记辅助选择。
发明内容
本发明的目的是在于提供了基于油菜C08染色体上位于该区域第32340658个碱基设计的引物在油菜根表面积筛选育种上的应用，包括检测包含有油菜C08染色体上第32340658个碱基的油菜序列的试剂在油菜根表面积筛选育种上的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
(1)收集280份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜核心关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用油菜60K SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minorallele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜基因组中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得23,542个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。将获得的关联分析群体的基因型数据导入STRUCTUREv.2.3.4进行群体结构分析，将280份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用SPAGeDi软件计算280份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(3)利用水培对关联群体的280个株系进行培养，在油菜种子发芽后7天，13天，16天和幼苗发育至3叶期、5叶期和7叶期对每个株系3个单株的根表面积进行测量，计算平均值。
(4)结合关联群体的根表面积表型数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 4.0软件(Bradbury et al.2007)进行关联分析。最终在油菜种子发芽后13天，16天和幼苗发育至5叶期和7叶期的数据中，在C08染色体上检测到与油菜根表面积显著关联的19个SNP标记，其P值范围为1.81E-06-3.43E-09，其中Bn-scaff_16197_1-p1800542的显著水平最高(p＝3.43E-09)，可解释15.76％的表型变异，该SNP变异位点(由T到C的变异)位于油菜C08染色体的第32340658bp处。
(5)通过Haploview软件(Barrett et al.,2005)采用四配子模式(four gameterule,Wei et al.,2016)计算各标记单倍型，结果这19个SNP位于同一个单倍型内，位于油菜基因组的32,337,226至32,365,749bp之间。
(6)提取油菜C08染色体第32340658个碱基上下游各100bp的序列，按照引物设计原则，开发SNP标记引物S42，正向引物为S42-F：CGGTTACGTTAATAGTTATCCGAA，反向引物为S42-R：TGTAGTTTTTCACATCACATTAAGG，扩增大小为73bp。
(7)对该标记采用高分辨率溶解曲线(HRM)技术在油菜关联群体中进行基因型分型，再次利用Tassel 4.0软件进行关联分析，确定该标记是与油菜根表面积显著关联的标记位点。
(8)挑选出280份材料中根表面积大和根表面积小的材料，分析分子标记的基因型及其在水培16天的根表面积表型数据。
以上所述的应用，可利用现有技术，对待甘蓝型油菜32,337,226至32,365,749bp处的变异进行检测，实现对油菜根表面积进行早期育种的目的。
利用本领域的常规技术，设计的检测油菜C08染色体第32340658个碱基的引物，其用于甘蓝型油菜根表面积筛选育种，也属于本发明的保护范围。
检测包含有油菜C08染色体上第32340658个碱基的油菜序列的试剂在甘蓝型油菜根表面积筛选育种上的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次获得了与油菜根表面积显著关联的基因组区域，位于其中与油菜根表面积显著关联的分子标记最高可解释15.76％的表型变异，且在多个时期均可重复检测，可有效应用于油菜的优异根系构型遗传改良。
(2)首次研究发现了与油菜根表面积显著关联的分子标记S42，为油菜根表面积的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
(3)利用分子标记S42可在油菜幼苗生长期快捷地对油菜品种或品系中与根表面积显著关联的基因组单倍型区域进行选择，能够极大减轻育种筛选的工作量，缩短育种周期，加快油菜根系改良的育种进程。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
油菜根表面积显著关联的基因组单倍型区域的获得：
(1)收集280份来自世界各个国家的甘蓝型油菜自交系作为油菜核心关联群体，采集关联群体各株系的单株叶片，用CTAB法提取总DNA，利用油菜60K SNP芯片对每个样本进行基因型分析。
(2)利用Illumina BeadStudio基因分型软件(http://www.illumina.com/)计算群体材料在每个位点的标记杂合率(heterozygous rate)、缺失率(missing rate)、最小等位基因频率(minorallele frequency)。以缺失率≤0.2、杂合率≤0.2、最小等位基因频率>0.05以及SNP标记在甘蓝型油菜基因组中唯一匹配为筛选标准进行SNP标记的过滤，最终获得23,542个高质量SNP标记用于全基因组关联分析。将获得的关联分析群体的基因型数据导入STRUCTUREv.2.3.4进行群体结构分析，将280份甘蓝型油菜种质资源划分为3个亚群。利用SPAGeDi软件计算280份甘蓝型油菜种质资源间亲缘关系(Hardy and Vekemans,2002)。
(3)利用水培对关联群体的280个株系进行培养，在油菜种子发芽后7天，13天，16天和幼苗发育至3叶期、5叶期和7叶期对每个株系3个单株的根表面积进行测量，计算平均值。
(4)结合关联群体的根表面积表型数据、基因型数据和群体结构，利用TASSEL 4.0软件(Bradbury et al.2007)进行关联分析。最终在油菜种子发芽后13天，16天和幼苗发育至5叶期和7叶期的数据中，在C08染色体上检测到与油菜根表面积显著关联的19个SNP标记，其P值范围为1.81E-06-3.43E-09，其中Bn-scaff_16197_1-p1800542的显著水平最高(p＝3.43E-09)，可解释15.76％的表型变异，该SNP变异位点位于油菜C08染色体的第32340658bp处。
(5)通过Haploview软件(Barrett et al.,2005)采用四配子模式(four gameterule,Wei et al.,2016)计算各标记单倍型，结果这19个SNP位于同一个单倍型内，位于油菜基因组的32,337,226至32,365,749bp之间。
实施例2：
一种与根表面积显著关联的分子标记引物的获得：
(1)提取油菜C08染色体第32340658个碱基上下游各100bp的序列，按照引物设计原则，开发SNP标记引物S42，正向引物为S42-F：CGGTTACGTTAATAGTTATCCGAA，反向引物为S42-R：TGTAGTTTTTCACATCACATTAAGG，扩增大小为73bp。
在甘蓝型油菜3S1334中扩增的序列为A基因型，序列如下所示：
CGGTTACGTTAATAGTTATCCGAATATATGGAAATTTATGAATAGAAAAACTATATATGGATAGTACTAAAGTATTAACCTTAATGTGATGTGAAAAACTACA
在甘蓝型油菜3S1135中扩增的序列为B基因型，序列如下所示：
CGGTTACGTTAATAGTTATCCGAATATATAAAAATTTATGAATAGAAAAACTATATATGGATAGTACTAAAGTATTAACCTTAATGTGATGTGAAAAACTACA
(2)对该标记采用高分辨率溶解曲线(HRM)技术在油菜关联群体中进行基因型分型，再次利用Tassel 4.0软件进行关联分析，确定该标记是与油菜根表面积显著关联的标记位点。
实施例3：
基于油菜C08染色体第32340658个碱基设计的引物在油菜根表面积筛选育种中的应用，其步骤如下：
(1)挑选出280份材料中经过多代自交已纯合的根表面积大的材料39份(LI etal.2014)和根表面积小的材料39份(LI et al.2014)。
(2)检查了与根表面积显著关联分子标记S42的两种基因型在根表面积大的材料39份和根表面积小的材料39份的分布情况，结果表明，分子标记S42的基因型在39份根表面积大的材料中33份为A，6份为B，而在39份根表面积小的材料中35份为B，仅有4份为A(表1)。另外，T测验结果表明分子标记S42检测出的A和B两类基因型在油菜根表面积性状上存在极其显著的差异。
以上的结果足以说明我们制备的分子标记S42与油菜的根表面积是高度关联的，因而可用于根表面积的分子标记辅助选择。
表1分子标记S42在根表面积极端材料中的基因型
序列表
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种与油菜根表面积关联的分子标记及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggttacgtt aatagttatc cgaa 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtagttttt cacatcacat taagg 25
<210> 3
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggttacgtt aatagttatc cgaatatatg gaaatttatg aatagaaaaa ctatatatgg 60
atagtactaa agtattaacc ttaatgtgat gtgaaaaact aca 103
<210> 4
<211> 103
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggttacgtt aatagttatc cgaatatata aaaatttatg aatagaaaaa ctatatatgg 60
atagtactaa agtattaacc ttaatgtgat gtgaaaaact aca 103
Claims (3)
1.检测包含有油菜C08染色体第32340658个碱基的序列的试剂在油菜根表面积筛选育种上的应用。
2.针对检测油菜C08染色体第32340658个碱基设计的引物在油菜根表面积筛选育种上的应用。
3.根据权利要求2所述应用，所述的引物为：S42-F：CGGTTACGTTAATAGTTATCCGAA，反向引物为S42-R：TGTAGTTTTTCACATCACATTAAGG。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| US20060162006A9 (en) * | 1999-11-17 | 2006-07-20 | Sherman Bradley K | Polynucleotides and polypeptides in plants |
| CN104805080A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-07-29 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种油菜角果数主效qtl的分子标记及应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| 王杰； 顿小玲；王汉中；等: "甘蓝型油菜幼苗期根系性状QTL分析", 《中国作物学会——2015年学术年会论文摘要集》 * |
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|---|---|
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