CN101845497B - 一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记及其制备方法和应用，其制备步骤是：(1)以耐湿性差异很大的中双9号和GH01为亲本，依次经杂交和套袋自交得F2群体；(2)用CTAB法抽取亲本及F2群体单株叶片的DNA，采用引物进行PCR扩增和电泳检测，获得分子标记资料；(3)采用苗期缺氧法测定F2单株种子的苗期耐湿指数；(4)运用统计软件SPSS软件中的多元线性回归模块对分子标记数据和群体的耐湿指数进行关联分析，以回归显著性P＜0.05和贡献率＞10％为标准，筛选获得分子标记BnGMS130-350。本发明方法易行，操作简便，解决了常规育种方法中存在的湿害鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等问题，有效提高了油菜耐湿抗性的遗传改良步伐。
Description
技术领域
本发明属于油菜育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记，同时还涉及一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记的制备方法，还涉及一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记在提高油菜耐湿抗性育种中的应用。
背景技术
油菜是我国最重要的冬季油料作物，而长江流域又是我国最大的油菜产区，占全国油菜面积的80％以上。然而，长江流域普遍采用水稻-油菜轮作制度，加上秋季和春季气候湿润多雨，造成水稻田地下水位较高，油菜湿害严重，常年发生面积一般达到144.4万公顷，占总面积20％以上，可造成17.0～42.4％的产量损失，严重时甚至绝收。
油菜湿害研究主要集中在生理生化方面。湿害可造成油菜根际缺氧，糖酵解、乙醇发酵和乳酸发酵产生的乙醇、乳酸、氧自由基等有害物质对细胞形成伤害，使光合作用大大下降，甚至完全停止，分解大于合成，使生长受阻，产量下降，影响油菜株高、茎粗、根粗、根长、绿叶数、叶面积、干重，造成有效分枝数、单株角果数和粒数大幅下降。为减轻油菜湿害带来的产量损失，生产上一般采用开沟排水降低地下水位、土壤翻耕和中耕等农艺措施，但需要花费大量的劳动成本。为降低油菜生产成本，培育耐湿性强的油菜新品种是最为经济有效的途径。
有关油菜耐湿的遗传和育种研究较少，而且主要集中在油菜品种间的生理差异响应以及耐湿性遗传差异等方面(张学昆等，不同耐湿基因型甘蓝型油菜苗期对缺氧胁迫的生理差异响应，中国农业科学，2007，40(3)：485-491；张学昆等，甘蓝型油菜耐湿性的遗传差异鉴定，中国油料作物学报，2007，29(2)：204-208)。丛野等以生产中广泛种植的、耐湿性很强的优良品种中双9号(P1)和湿害十分敏感的育种材料GH01(P2)为亲本，配制了F1、B1、B2、F2:3等6个世代群体材料，分析了中双9号的耐湿抗性遗传规律，发现中双9号的耐湿抗性符合2对主基因+多基因混合遗传模型，主基因的遗传率为74～78％，耐湿性在早期选择效率较高(丛野等，甘蓝型油菜发芽种子耐湿性的主基因+多基因遗传分析，作物学报，2009，35(58)：1462-1467)。经文献查新，国内未见有关油菜耐湿抗性的分子标记及其应用的研究报道，也未见相关的专利技术公开或使用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记，可利用分子标记技术开展耐湿抗性辅助育种，解决了常规育种方法中存在的湿害鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等问题，提高了油菜耐湿抗性的遗传改良步伐。
本发明的另一个目的在于提供了一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记的制备方法，该方法简单易行，操作方便。
本发明还有一个目的在于提供了一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记在提高油菜耐湿抗性育种中的应用。通过耐湿抗性相关分子标记的早期鉴定和辅助选择，可显著提高油菜的耐湿抗性水平，极大减轻了耐湿性的鉴定工作量，有效提高了选择的效率和准确性。
本发明提供的一种油菜耐湿抗性相关的分子标记，其制备方法的步骤如下：
(1)以耐湿性强亲本中双9号(中国农业科学院油料作物研究所培育，种子市场可购买)和湿害敏感材料GH01(张学昆等，甘蓝型油菜耐湿性的遗传差异鉴定，中国油料作物学报，2007，29(2)：204-208)为研究材料，杂交得到F1代，F1代套袋自交得到F2群体；
(2)用CTAB法(Doyle J.DNA protocols for plants-CTAB total DNAisolation.In：Hewitt G M，Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy.Berlin：Springer-Verlag，1991.P283-293)抽取油菜亲本及F2群体单株叶片的DNA，采用简单重复序列标记(SSR)引物进行PCR扩增，扩增产物在6g/L变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色后获得分子标记资料；
(3)采用苗期缺氧法(陈洁等，甘蓝型油菜耐湿种质资源的快速筛选，中国油料作物学报，2006，28(2)：138-143)测定每个F2单株收获种子的苗期耐湿指数(相对活力指数)，耐湿指数小于0.30为湿害敏感；耐湿指数在0.30～0.70之间为中等耐湿，指数大于0.70为高耐湿；
(4)运用统计软件SPSS 9.0软件(SPSS Inc.，Chicago)中的多元线性回归(逐步回归法)模块对分子标记数据和群体耐湿指数进行关联分析，以回归显著性P＜0.05和贡献率＞10％为标准，筛选获得1个显著关联的分子标记BnGMS130-350。该标记与耐湿抗性的相关性达到极显著水平(P＜0.001)，而且对表型方差的贡献率达到16.1％。
一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记在提高油菜耐湿抗性育种中的应用，其步骤是：
(1)以油菜总DNA为模板；
(2)采用SSR引物BnGMS130(引物来源请参见文献：Xiaomao Cheng etal.Development and genetic mapping of microsatellite markers from genome surveysequences in Brassica napus.Theor Appl Genet，2009，118：1121-1131)进行PCR扩增，
引物正向序列为：5′-TATCTTCCTCTTCCTCCTCC-3′
引物反向序列为：5′-CTTCTTCTTCTGGACGGTTA-3′；
(3)扩增产物经6g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，获得分子量为350bp的特异性条带；
(4)350bp特异性条带出现时，预测油菜的耐湿性显著增强，350bp特异性条带缺失时，预测油菜的耐湿性显著下降，可用于油菜耐湿抗性的早期辅助选择。
本发明的积极效果是有效解决了常规育种方法中存在的湿害鉴定工作量大、周期长、易受环境影响等缺点，并且利用分子标记技术开展耐湿抗性辅助育种，可显著提高耐湿抗性的选择效率，加快油菜品种的耐湿抗性遗传改良步伐。在油菜F2分离群体中，采用分子标记BnGMS130-350进行鉴定和选择，可将群体的耐湿抗性水平显著提高43.8％以上，耐湿抗性鉴定工作量减少52％以上。
附图说明
图1为SSR标记在亲本间的多态性筛选情况(1为耐湿亲本中双9号，2为湿害敏感亲本GH01，→指示多态性条带)。
图2为SSR标记BnGMS130-350在“中双9号×GH01”F2分离群体中的检测情况(M为分子量标准物100bp DNA ladder，1为耐湿亲本中双9号，2为湿害敏感亲本GH01，→指示特异性条带)。
具体实施方式
实施例1：与油菜耐湿抗性相关SSR标记的获得
为更好地理解本发明，本发明以耐湿抗性品种中双9号和湿害敏感材料GH01为例，构建了一个F2分离群体，详细说明获得与耐湿抗性相关分子标记的方法。但应当理解，上述举例并不构成对本发明的任何限制。在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。具体方法如下：
(一)群体构建：
以耐湿抗性很强的油菜品种中双9号(耐湿抗性相对活力指数为0.87，公知公用的品种)为母本，湿害敏感油菜育种材料GH01(耐湿抗性相对活力指数为0.09，请参见文献：张学昆等，中国油料作物学报，2007，29(2)：204-208)为父本，经一次杂交和一次自交构建了一个耐湿抗性分离群体，共190个单株。
(二)耐湿抗性的鉴定：
采用文献报道的方法(陈洁等，甘蓝型油菜耐湿种质资源的快速评价与筛选，中国油料作物学报，2006，28(2)：138-143)，对亲本及F2群体190个单株收获种子的发芽期湿害抗性进行鉴定，获取群体的表型数据，具体的步骤是：
(1)每份材料选取100粒饱满的种子，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，在光照培养箱(25℃)中萌发60h；
(2)选取50粒能够正常发芽的种子(胚根长约2～5mm)，转入装有超纯水的10mL离心管中进行密闭水淹缺氧处理12h；
(3)将处理过的种子转入到装有湿润蛭石(厚度为1cm)的培养皿中继续生长6d，以发芽后不经水淹缺氧处理而直接放于蛭石中培养6d的幼苗为对照；
(4)统计缺氧处理和对照的存活幼苗数和成苗率，并随机各选取10株幼苗测量根长、茎长和鲜重，最后计算相对活力指数(耐湿指数)I，其计算公式如下：
I＝(处理成苗率×处理幼苗茎长)/(对照成苗率×对照幼苗茎长)
(5)耐湿抗性鉴定标准：根据相对活力指数I的大小，对油菜发芽耐湿抗性水平进行划分，见表1。
表1油菜发芽期水淹缺氧法测定的相对活力指数范围与耐湿性等级划分
| 相对活力指数I区间 | 耐湿抗性等级 |
| 0.70～1.00 | 高抗 |
| 0.30～0.70 | 中等 |
| 0.00～0.30 | 敏感 |
(三)DNA提取：
采集亲本及F2群体的190个单株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取叶片的总DNA，具体提取步骤如下：
(1)将新鲜或-20℃冰冻保存的叶片0.5g放入1.5ml离心管中，用玻璃棒磨为匀浆，加入800μl CTAB提取液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0；20mmol/L EDTA，pH8.0；50mmol/L NaCl，1g/L CTAB)并摇匀，65℃水浴30min；
(2)取出离心管，加入400μl的纯氯仿，在振荡仪上2000rpm震荡30秒，然后室温(20-25℃以下相同)下12000rpm离心6min，取上清液(约400μl)；
(3)在上清液中加入两倍体积的无水乙醇(约800μl)，冰上静置30min后，再12000rpm离心8min收集DNA沉淀；
(4)DNA沉淀自然风干后，加入双蒸水200μl溶解即可使用。
(四)SSR标记分析：
SSR标记分析的具体步骤是：
(1)PCR反应体系：总体积为10μl，具体成分如下：
| DNA模板(25ng/μl) | 1.0μl |
| 正向引物(50ng/μl) | 0.5μl |
| 反向引物(50ng/μl) | 0.5μl |
| 10×PCR Buffer | 1.0μl |
| dNTPs(10mmol/L) | 0.2μl |
| MgCl2(25mmol/L) | 0.8μl |
| Taq(5U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 5.5μl |
其中，Taq酶购自Fermentas公司，PCR Buffer溶液中包含750mmol/L Tris-HCl，200mmol/L(NH4)2SO4和0.1％(v/v)Tween20，pH为8.8。筛选所用的SSR引物编号为BnGMS103-BnGMS282(序列信息请参见文献：Xiaomao Cheng et al，Development and genetic mapping of microsatellite markers from genome surveysequences in Brassica napus.Theor Appl Genet，2009，118：1121-1131)。PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的PTC-200型PCR仪上进行。
(2)PCR扩增程序：95.0℃预变性3min；94.0℃变性30s，60.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，每个循环复性温度降低0.5℃，共10个循环；94.0℃变性30s，55.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，共30个循环；72.0℃延伸10min，4℃保存。反应完成后，在扩增产物中加入等体积的变性凝胶电泳上样缓冲液(配制方法：在100ml去离子甲酰胺中，加入pH8.0的0.5mol/L EDTA溶液2ml，二甲苯青FF干粉5mg，溴酚蓝干粉5mg，充分溶解后摇匀)，95℃变性5min后立即冰浴冷却，4℃放置备用；
(3)电泳检测：PCR产物在6g/L变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，电极缓冲液为1×TBE，上样量为2.5μl，恒压1500V电泳分离。凝胶染色采用硝酸银快速染色法，胶板无需固定，直接在1g/L硝酸银溶液中浸泡10min，超纯水漂洗30s，然后转入预冷的显色液(5g氢氧化钠干粉，1L超纯水溶解，然后加入3ml37％(v/v)的甲醛)快速摇动至条带出现为止，最后用10％(v/v)冰醋酸溶液固定。胶板自然晾干，人工读带并拍照保存，获得分子标记数据。分子标记数据的记录方法是，在胶板上迁移率相同(分子量相同)的条带记录为一个标记，有带记录为“1”，无带记录为“0”，该标记以扩增所用的SSR引物名称和分子量命名，中间用短划线分开。
(五)SSR引物筛选：
根据文献(Xiaomao Cheng et al.Development and genetic mapping ofmicrosatellite markers from genome survey sequences in Brassica napus.Theor ApplGenet，2009，118：1121-1131)公开的油菜SSR引物序列信息，从中选择了180对引物的序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物干粉用超纯水稀释到50ng/μl，-20℃保存备用。
首先以亲本中双9号和GH01的DNA为模板，采用上述步骤(四)的流程对所有SSR引物进行初步筛选，在亲本间呈现多态性的SSR引物重复验证，获得候选的SSR标记87个。
根据F2群体的耐湿性鉴定结果，挑选出耐湿抗性最强的6个单株，等量混合其DNA构建一个“抗性”样品池；同样，挑选湿害最敏感的6个单株选择构建一个“敏感”样品池。利用亲本间有差异的SSR引物继续在两个样品池之间进一步筛选，获得在两个样品池之间有多态性的SSR引物20对。
参照文献(Kang等，Development of AFLP and STS markers linked to awaterlogging tolerance in Korean soybean landraces.Biologia Plantarum，2010，54(1)：61-68)的方法，从F2群体中挑选耐湿抗性最好的单株50株，湿害最为敏感的单株50株构建为一个关联分析群体，利用在样品池之间有多态性的SSR引物进一步分析，记录这些标记在群体中的分离情况，获得分子标记数据资料，共记录到39个分子标记。
(六)关联分析：
参照文献(Roy等.Association analysis of agronomically important traits usingSSR，SAMPL and AFLP markers in bread wheat.Current Science，2006，90(5)：683-689)的方法，将耐湿抗性鉴定表型数据与分子标记数据进行关联分析，具体是以耐湿指数(相对活力指数)为因变量，各个SSR标记为自变量，采用统计分析软件SPPS 9.0中的多元回归模块(逐步回归法)进行回归分析，建立最优回归方程，并获得各个回归变量的统计数据(回归系数大小、显著水平和贡献率等)。确定一个分子标记与耐湿抗性存在关联的标准是：回归系数显著水平P＜0.05，且单个标记的贡献率＞10％。
利用群体中获得的39个分子标记数据进行回归分析，建立了一个包含6个标记的多元回归方程。方程的回归系数是0.643(显著水平P＜0.001)，可通过回归解释的表型方差占41.4％，其中贡献率最大的标记是BnGMS130-350，贡献率为16.1％，其余标记的贡献率均较小(＜3.9％)。
标记BnGMS130-350对应的引物是：
正向序列：5′-TATCTTCCTCTTCCTCCTCC-3′
反向序列：5′-CTTCTTCTTCTGGACGGTTA-3′
该标记扩增的特异性PCR片段大小是350bp。
实施例2：油菜耐湿抗性相关SSR标记的鉴定效果
一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记在提高油菜耐湿抗性育种中的应用，其步骤是：
(一)群体构建、DNA提取和SSR标记分析
群体构建、耐湿性鉴定、DNA提取和SSR标记分析与实施例1相同，具体请参见步骤(一)至(四)。特异性标记BnGMS130-350所用引物序列参见步骤(六)，该标记扩增的特异性PCR片段大小是350bp。
(二)利用特异性标记BnGMS130-350对油菜耐湿抗性的鉴定效果
以F2群体中用于关联分析的100个单株为研究材料，该群体的相对活力指数平均值为0.299。利用特异性标记进行鉴定后可将该群体分为两类，第一类为出现特异性350bp带型的单株，共48株，其平均相对活力指数为0.430(见表2)，显著高于群体平均值0.299(P＝0.015)；第二类为缺失350bp带型的单株，共52株，其平均相对活力指数为0.179(见表2)，显著低于群体平均值0.299(P＝0.024)。上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留出现350bp特异带型的单株，淘汰缺失350bp特异带型的单株，即可显著提高群体的耐湿抗性水平(提高43.8％)，提高选择效率，减少筛选鉴定的工作量(减少52％)，加速育种进程。
表2耐湿鉴定分子标记BnGMS130-350在F2群体中的鉴定效果
(三)利用特异性标记BnGMS130-350对油菜耐湿抗性的预测效果
利用标记BnGMS130-350进一步扩大检测范围，预测凡是出现350bp特异带型的单株其耐湿抗性水平将显著提高，而无法检测到350bp特异片段的单株其耐湿抗性显著降低。总共分析检测了F2群体的190个单株，结果表明，F2群体中有带的单株为81株，其相对活力指数(耐湿抗性)的平均值为0.394，显著高于群体的平均值0.246(P＝0.001)。以上结果充分说明，该标记确实可以用于耐湿性的预测、鉴定和筛选。
Claims (3)
1.一种油菜耐湿抗性紧密相关的分子标记BnGMS130-350，所述标记是以油菜总DNA为模板，采用SSR引物BnGMS130扩增获得；
所述引物的正向序列为：5′-TATCTTCCTCTTCCTCCTCC-3′
所述引物的反向序列为：5′-CTTCTTCTTCTGGACGGTTA-3′。
2.权利要求1所述的一种分子标记BnGMS130-350的制备方法，其步骤是：
(1)以强耐湿性的中双9号和湿害敏感材料GH01为亲本，杂交得到F1代，F1代套袋自交得到F2群体；
(2)用CTAB法抽取油菜亲本及F2群体单株叶片的DNA，采用简单重复序列标记引物进行PCR扩增，扩增产物在6g/L变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色后获得分子标记资料；
(3)采用苗期缺氧法测定每个F2单株收获种子的苗期耐湿指数；
(4)运用统计分析软件SPSS中的多元线性回归模块对分子标记数据和群体耐湿指数进行关联分析，以回归显著性P＜0.05和贡献率＞10％为标准，筛选获得1个分子标记BnGMS130-350。
3.权利要求1所述的一种分子标记BnGMS130-350在提高油菜耐湿抗性育种中的应用。
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| 刘列钊等.油菜简单重复序列SSR(simple sequence repeat)研究进展.《生命科学》.2004,第16卷(第3期),第173-176页. * |
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Granted publication date: 20120725 Termination date: 20190409 |