CN103525919B - 芝麻耐湿性状主效基因位点紧密连锁的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及芝麻耐湿性状主效基因位点紧密连锁的分子标记及其应用。该主效基因位点qWHCHL09位于第9连锁群，与其紧密连锁的分子标记为ZM428，其序列为：ZM428F： AGGATGATGATGTGATGAGAG（5’—3’）ZM428R： CTGCTACTCCTTTTGTCTCTG（5’—3’）其是通过利用芝麻耐湿品种中芝13和敏感种质宜阳白进行杂交获得F6代分离群体即重组自交系（RIL）群体；对其进行分子遗传连锁分析获得的。上述芝麻耐湿性状主效基因位点紧密连锁的分子标记用于芝麻耐湿育种及芝麻种质资源耐湿性状筛选及早期预测中，辅助耐湿性选择目标明确，成本较低。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种芝麻耐湿性状主效基因位点、其紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
芝麻（Sesamum indicum L.）是我国传统特色油料作物，各地均有种植，经济和营养保健价值很高，不仅小磨香油深受人们喜爱，而且在食品、医药等行业广泛应用。我国是世界芝麻主产国之一，单产居世界首位，总产占世界的五分之一。近年，国内芝麻需求量逐年上升，已达一百万吨，进口量居世界之首，连续三年达40万吨左右，但是国内芝麻生产总供给量不足60％，因此，提高芝麻抗灾能力，促进单产提高，对促进我国芝麻生产发展、解决总量自给不足问题十分迫切。
芝麻是对湿害极其敏感的作物，湿害是影响我国芝麻生产发展和单产提高的主要障碍因素。我国芝麻生产主要集中在黄淮、江淮流域，约三分之二种植在一年两熟制地区，且以麦茬、油菜茬夏播芝麻为主，6-8月份是芝麻的主要生育期间，是该区一年中降雨较集中的季节，统计结果显示6-8月份降雨量与该区芝麻产量呈显著负相关，90％的歉收年份由湿害所致，湿害造成减产30％以上，严重时减产50％-90％，甚至绝收。湿害不仅引发病害、造成减产，还导致芝麻籽粒商品性变差，含油量降低，严重影响芝麻加工品质。
通过芝麻耐湿性的遗传改良提高品种的耐湿害能力，是解决芝麻湿害胁迫问题最经济、有效的途径。自上世纪七十年代开始，我国芝麻育种家就把提高品种的耐湿性作为主要育种目标之一，通过鉴定发现，遗传背景不同的芝麻材料间耐湿性差异较大，以耐湿性较强的资源为亲本利用杂交等技术能够在一定程度上改良品种的耐湿性，但至今尚未取得突破，仍是制约我国芝麻生产发展的“瓶颈”问题。在研究中存在的主要问题有：1）缺乏高耐湿优异基因资源，遗传基础狭窄；2）常规田间耐湿性表型选择方法工作量大且易受环境影响，育种家基本不采用，限制了耐湿育种的步伐；3）缺乏可用于耐湿性分子辅助选择的有效标记和高效准确的选择技术；4）耐湿功能基因挖掘严重滞后，无法利用先进的基因工程育种等手段改良芝麻的耐湿性。因此，采用现代分子生物学技术对芝麻耐湿性进行深入系统的研究，定位芝麻耐湿性相关基因位点，筛选鉴定重要相关基因，挖掘可靠的高耐湿优异基因资源，对构建分子辅助选择高效技术和推动芝麻耐湿性遗传改良具有非常重要的科学意义。
作物耐湿性是较为复杂的数量性状，定位和挖掘相关的耐湿基因已成为研究热点。在小麦、大豆和油菜等作物开展了耐湿遗传基础研究，小麦耐湿性受一对（曹旸等，1995）或两对（方先文等，1997）显性主效基因控制，或受4对以上加性效应基因控制（Boru等，2001），大豆耐湿性为2对连锁主基因+多基因遗传（孙慧敏等，2010），甘蓝型油菜耐湿性为2对完全显性主基因+加性-显性多基因控制（丛野等，2009）。方先文等（2003）利用重组自交系通过连锁分析发现Xgwm148和Xgwm149两个SSR标记与马卡小麦耐湿性连锁显著，解释率分别为7.7%和4.6%。孙慧敏等（2010）利用重组自交系检测到2个大豆苗期耐湿QTL，贡献率分别为11.76%-25.20%和10.10%-12.34%。Qiu等（2007）利用玉米的F2:3家系对5个耐湿相关性状进行QTL定位，检测到59个QTL，贡献率3.9%-37.3%。李真（2008）利用DH群体检测到油菜与株高、根长、地上部干重、根干重、总干重有关的26个耐湿相关QTL，贡献率5.45%-22.89%。Lin等（2010）利用抑制差减杂交技术，从茄子根部获得了湿害胁迫反应相关的25个已知基因和9个新基因。Tereshonok等（2011）将来自根癌农杆菌的细胞分裂素生物合成关键酶基因ipt转入小麦中，有效增强了其耐湿性。
芝麻耐湿性分子生物学研究基础薄弱。王林海等（2010）通过抑制差减杂交构建了芝麻湿害胁迫的差减cDNA文库，获得82条非重复序列与GenBank中的基因或蛋白具有较高的同源性。Wang等（2012）盛花期对耐湿和敏感材料淹水胁迫，利用处理和对照的根部开展了耐湿基因表达谱分析，获得大量上调和下调的差异表达基因。但是，国内外尚未见有关芝麻耐湿性基因定位的研究报道。本发明旨在得到芝麻耐湿性状主效基因位点，及与其紧密连锁的分子标记，用于芝麻耐湿性的分子辅助选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种芝麻耐湿性状主效基因位点qWHCHL09。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种芝麻耐湿性状主效基因位点紧密连锁的分子标记ZM428。
本发明所要解决的技术问题之三是提供一种上述芝麻耐湿性状主效基因位点的分子标记鉴定方法。
本发明所要解决的技术问题之四是提供一种上述所述的分子标记ZM428在芝麻耐湿育种中的应用。
本发明所要解决的技术问题之五是提供一种上述所述的分子标记ZM428在芝麻种质资源耐湿性状筛选及早期预测中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种芝麻耐湿性状主效基因位点，其特征在于：主效基因位点qWHCHL09位于第9连锁群，与其紧密连锁的分子标记为ZM428，其序列为：
ZM428F： AGGATGATGATGTGATGAGAG（5’—3’）
ZM428R： CTGCTACTCCTTTTGTCTCTG（5’—3’）
一种与上述芝麻耐湿性状主效基因位点紧密连锁的分子标记（ZM428），其特征在于：其序列为：
ZM428F： AGGATGATGATGTGATGAGAG（5’—3’）
ZM428R： CTGCTACTCCTTTTGTCTCTG（5’—3’）
上述芝麻耐湿性状主效基因位点的分子标记鉴定方法，其特征在于：用分子标记ZM428扩增芝麻叶片总DNA，可扩增获得520bp-540bp的扩增片段，则表明存在本发明所述的芝麻耐湿性状主效基因位点，预测该芝麻具有较高的耐湿性。
上述所述的芝麻耐湿性状的主效基因位点qWHCHL09在芝麻耐湿育种中的应用。
按上述方案，所述芝麻耐湿性状的主效基因位点qWHCHL09在芝麻耐湿育种中的具体应用方法为：用所述的ZM428分子标记扩增芝麻叶片总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得520bp-540bp的扩增片段，则表明存在权利要求1所述的芝麻耐湿性状主效基因位点，预测该芝麻具有较好的耐湿性。
上述所述的芝麻耐湿性状的主效基因位点qWHCHL09在芝麻种质资源耐湿性状筛选及早期预测中的应用。
按上述方案，所述的芝麻耐湿性状的主效基因位点qWHCHL09在芝麻种质资源耐湿性状筛选及早期预测中的具体应用方法为：用所述的ZM428分子标记扩增芝麻种质资源叶片总DNA，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，如果获得520bp-540bp的扩增片段，则表明存在权利要求1所述的芝麻耐湿性状主效基因位点，预测该芝麻种质资源具有较好的耐湿性。
本发明所述的芝麻耐湿性状的主效基因位点是通过以下步骤筛选的：
（1）利用芝麻耐湿品种中芝13（湿害后存活株率84%）和敏感种质宜阳白（湿害后存活株率31%）进行杂交，获得F1种子，F1植株自交产生F2代种子，F2植株自交产生F3代种子，F3代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F6代分离群体，即重组自交系（RIL）群体；
（2）提取亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA；
（3）利用已报道的AFLP、SRAP和SSR标记引物以及自主开发的SSR标记引物对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色及带型统计，筛选亲本间有多态性的引物；
4）将筛选得到的多态性引物对重组自交系（RIL）群体进行基因型分析和遗传图谱的构建，结合其耐湿性数据进行QTL定位，检测到芝麻第9连锁群具有一个主效基因位点qWHCHL09，贡献率17.19%，加性效应3.9394，与其紧密连锁（遗传距离0.7cM）的分子标记为SSR标记ZM428，其序列为：
ZM428F： AGGATGATGATGTGATGAGAG（5’—3’）
ZM428R： CTGCTACTCCTTTTGTCTCTG（5’—3’）
本发明的优点在于：
本发明首次定位了1个位于芝麻第9连锁群上影响耐湿性状的主效基因位点（QTL），可解释耐湿表型17.19%的变异，同时发现了一个与其紧密连锁的分子标记ZM428，使得芝麻耐湿性状主效基因位点的定位工作居于同领域前列。
提出了芝麻耐湿性状主效基因位点的分子标记鉴定方法，可以预测芝麻耐湿性的强弱，进而可以快速筛选耐湿株系或种质资源用于芝麻耐湿育种或芝麻种质资源耐湿性状筛选及早期预测，辅助耐湿性选择目标明确，成本较低。传统育种方法中，芝麻耐湿性状表型鉴定费时费力，且受环境影响较大，准确性低。本发明中耐湿主效基因位点的检测方便快速，不受环境影响，可以在苗期进行筛选和淘汰，大大提高了选择效率，节约了生产成本。
附图说明
图1为芝麻RIL群体湿害后存活株率分布图。
图2为第9连锁群图谱。图中*号所示为耐湿性状主效基因位点qWHCHL09在连锁群上的位置，与其紧密连锁的分子标记为ZM428。
图3为分子标记ZM428在（中芝13×中芝7号）F2群体1-20号单株中扩增后聚丙烯酰胺凝胶电泳的胶板照片示意图。
具体实施方式
下述实施例中按照《芝麻种质资源描述规范和数据标准》（张秀荣等，北京：中国农业出版社，2007）的方法鉴定耐湿性，按照《分子克隆实验指南》（第三版）（黄培堂等译，北京：科学出版社，2002）所述的条件进行DNA提取、PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。实验过程中涉及的所有试剂成分均可从商业途径获得，并按照实验手册中的条件或所用试剂制造厂商所建议的条件使用。
实施例1芝麻耐湿性状主效基因位点的发掘
（1）构建耐湿/敏感芝麻重组自交系（RIL）群体并鉴定耐湿性
利用芝麻耐湿品种中芝13（湿害后存活株率84%）和敏感种质宜阳白（湿害后存活株率31%）进行杂交，获得F1种子，F1植株自交产生F2代种子，F2植株自交产生F3代种子，F3代开始按株行种植并自交产生种子，每个株行只收获1个单株的种子，种植成为下一代的1个株行，以此类推，最终获得F6代分离群体，即重组自交系（RIL）群体；
鉴定亲本及RIL各株系盛花期耐湿性，统计RIL分离群体湿害后存活株率，结果见图1，统计分析表明湿害后存活株率表现分布呈连续性分布，变异分布呈正态分布，且变异范围很宽，证明耐湿性属于数量性状。
（2）亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA的提取
利用CTAB法提取叶片基因组总DNA，具体步骤如下：
A.将各亲本及RIL分离群体叶片适量放入超低温冰箱-70℃存放，备用。使用时，自超低温冰箱（-70℃）取适量叶片样品，立即放入冰冻处理的研钵中，加入液氮研磨成粉状；快速装入50ml离心管中，加入在65℃的水浴锅中预热过的CTAB提取液（2%CTAB，0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，pH7.5），混合均匀，放入65℃的水浴锅中水浴40min；
B.取出离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇按体积比为24:1混合的混合液，缓慢上下颠倒离心管30-50次，使充分混匀，1300g离心10min；
C.取离心后的上清于另一离心管中，重复B步骤一次。然后再取上清加入0.6倍体积冰冷异戊醇中，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结为止。然后置于-20℃静置30min，挑出沉淀，用75%（体积比）酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解；
D.再次重复B步骤一次，取上清，向其中加入0.1倍体积的NaAc（3mol/L，PH5.2），混匀后缓慢加入2倍体积的冰冷无水乙醇，静止5min后缓慢转动离心管直至絮状沉淀出现，挑出沉淀转入1.5ml离心管中，75%（体积比）酒精漂洗2-3次，干燥后加无菌水溶解，于-20℃冰箱中保存备用，即得各亲本及RIL分离群体叶片基因组总DNA。
（3）引物的开发及多态性的筛选
利用已报道的256对AFLP（Voss et al.,Nucleic Acids Research,1995,23:4407–4414）、400对SRAP（Li et al.,Theoretical and Applied Genetics,2001,103:455–461）和25对SSR（张鹏等，作物学报,2007,33(10):1696–1702）标记引物以及利用芝麻转录组测序结果自主开发的114对SSR标记引物进行亲本间多态性筛选。筛选结果表明，有113对引物在双亲间有差异。多态性筛选程序如下：
A.自父母本中各随机选择5株的DNA等量混合，总浓度调整至20ng/ul，用作筛选引物的DNA模板。
B.PCR扩增反应。具体反应体系及扩增程序如下：
PCR反应体系：
PCR扩增程序：
（4）PCR扩增产物凝胶电泳测试获得多态性筛选结果
将以上获得的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以获得双亲多态性筛选结果，具体步骤如下：
胶板制备：
玻璃板用10%（质量比）NaOH溶液浸泡24小时，洗净，晾干。短胶板用餐巾纸均匀涂抹硅烷化剂（AMMRESCO），长胶板涂抹1ml反硅烷化剂，放置5min后，将玻璃装好，并以边条隔开，四周用制胶夹夹紧。准备就绪后用注射器将6%（质量比）聚丙烯酰胺胶液60ml缓慢注入玻璃间的缝隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部，注意避免产生气泡。小心插入梳子不带齿的一边，并用夹子夹牢，聚合2小时以上。
反硅烷化剂：500ml稀释液（95%无水乙醇，0.5%冰醋酸，4.5%ddH2O）中加1-2ml亲和硅烷；
6%（质量比）聚丙烯酰胺胶液:5.7%（质量比）丙烯酰胺，0.3%（质量比）N,N’-甲叉二丙烯酰胺，42%（质量比）尿素，1×TBE缓冲液。灌胶前每60ml胶液加入10%（质量比）过硫酸铵390ul和TEMED39ul；
电泳：
去掉制胶夹，取出胶板，小心的取出梳子，冲洗并擦净玻璃外侧，固定于电泳槽上，上下槽各加500ml1×TBE缓冲液，以恒功率75W电泳30min直到电压回升，用注水器冲洗凝胶的上表面以冲走析出的尿素和碎胶，插上梳子。在PCR产物中加入0.5倍体积的上样缓冲液，95℃变性5min，冰浴冷却3min以上，每个点样孔点样5ul，1800伏恒压电泳约80min，当二甲苯青FF到达2/3胶板时停止电泳。取下胶板，用自来水冲洗降温。
1×TBE：Tris-base108g，硼酸55g，0.5M EDTA（PH8.0）40ml，定容至1000ml即成10×TBE，使用时稀释10倍即为1×TBE工作液；
上样缓冲液：98%（体积比）去离子甲酰胺,10mmol/L EDTA,0.005%（质量比）二甲苯青FF,0.005%（质量比）溴酚蓝。
银染法染色：
将两块玻璃板分离开来，长玻璃板连同凝胶用蒸馏水漂洗3次，每次3min，放入染色液（含0.15%的AgNO3）中染色10min，用蒸馏水快速漂洗5-6s。放入显影液（含0.2%的NaOH，0.04%的甲醛，35℃）中显影，至带型清晰，然后在蒸馏水中漂洗1次，室温下自然晾干，拍照保存。观察胶板上各引物在双亲中的扩增带型，双亲带型有差异的引物即为多态性引物。（5）上述筛选得到的多态性引物在RIL群体中的分析及耐湿性基因定位
将上述筛选得到的多态性引物在RIL群体中进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色及带型统计，得到群体基因型数据，根据连锁交换规律，利用软件Joinmap3.0构建遗传连锁图谱（图2为第9连锁群图谱），最小LOD值设为2.5。然后利用RIL群体的206个株系的耐湿性数据、基因型数据及遗传连锁图谱数据，运行WinQTL cart4.0软件进行基因定位分析。结果发现1个影响耐湿性状的主效基因位点qWHCHL09，位于第9连锁群，可解释耐湿表型17.19%的变异（即贡献率17.19%），加性效应3.9394，与其紧密连锁（遗传距离0.7cM）的分子标记为SSR标记ZM428，其序列为：
ZM428F： AGGATGATGATGTGATGAGAG（5’—3’）
ZM428R： CTGCTACTCCTTTTGTCTCTG（5’—3’）
实施例2上述主效基因位点qWHCHL09紧密连锁的分子标记ZM428在芝麻耐湿育种中的应用
利用中芝13与另一敏感品种中芝7号杂交后获得265个F2单株，另，由于不能对F2单株进行耐湿性鉴定，所以种植265个F2单株获得其对应的265个F2:3家系，F2:3家系的耐湿性代表F2单株的耐湿性。在苗期对F2单株进行分子鉴定，具体步骤包括叶片总DNA的提取（具体如实施例1中的DNA提取方法）和利用耐湿主效基因位点qWHCHL09紧密连锁的分子标记ZM428进行分子鉴定，即经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳测试及带型统计（具体如实施例1中的PCR扩增、凝胶电泳及带型统计方法），保留扩增可得到520bp-540bp条带的F2单株（即含有耐湿主效基因位点qWHCHL09的单株）共93个，其中F2群体1-20号单株凝胶电泳后染色得到的胶板照片见图3，其中，第3、5、11、14、15、18号单株（扩增可得到520bp-540bp条带）就是分子标记ZM428鉴定出来的含有耐湿主效基因位点qWHCHL09的单株。另将所有265个F2单株对应的265个F2:3家系于盛花期进行湿害后存活株率测定试验，结果表明：通过分子标记辅助选择得到的93个F2单株对应的F2:3家系中，湿害后存活株率超过265个F2:3家系群体均值（59%）的株系占70%（见表1，共65个）。与常规育种方法相比，利用分子标记ZM428鉴定辅助选择耐湿株系，其选择效率可提高45个百分点。由此，通过鉴定上述主效基因位点来预测芝麻育种后代的耐湿性，可大大提高芝麻耐湿品种的育种效率。
表1湿害后存活株率超过群体均值的65个株系
| 株系编号 | 湿害后存活株率（%） | 株系编号 | 湿害后存活株率（%） |
| 79 | 90.50 | 122 | 67.58 |
| 70 | 86.69 | 167 | 67.39 |
| 36 | 86.08 | 202 | 67.22 |
| 191 | 84.86 | 3 | 67.18 |
| 120 | 84.52 | 64 | 66.70 |
| 65 | 82.75 | 98 | 66.16 |
| 67 | 82.72 | 201 | 65.96 |
| 100 | 82.23 | 185 | 65.91 |
| 15 | 78.76 | 129 | 65.55 |
| 192 | 78.32 | 195 | 65.54 |
| 55 | 77.26 | 189 | 65.45 |
| 193 | 76.22 | 54 | 65.02 |
| 73 | 75.67 | 66 | 64.73 |
| 60 | 74.95 | 14 | 64.50 |
| 78 | 74.72 | 176 | 64.42 |
| 72 | 73.47 | 164 | 64.30 |
| 96 | 73.10 | 132 | 63.67 |
| 99 | 72.80 | 169 | 63.10 |
| 47 | 72.41 | 91 | 62.69 |
| 58 | 72.38 | 121 | 62.46 |
| 119 | 72.25 | 117 | 62.12 |
| 131 | 72.05 | 194 | 61.97 |
| 57 | 71.77 | 154 | 61.32 |
| 59 | 71.68 | 150 | 60.98 |
| 18 | 71.05 | 101 | 60.64 |
| 197 | 70.67 | 5 | 60.61 |
| 198 | 69.81 | 123 | 59.68 |
| 90 | 69.77 | 134 | 59.67 |
| 45 | 69.62 | 69 | 59.62 |
| 26 | 69.46 | 196 | 59.53 |
| 11 | 68.58 | 130 | 59.47 |
| 25 | 68.40 | 179 | 59.32 |
| 104 | 68.21 |
实施例3上述主效基因位点qWHCHL09紧密连锁的分子标记ZM428在芝麻种质资源耐湿性状筛选及早期预测中的应用
种植186份芝麻核心种质资源，在苗期提取各材料DNA（具体如实施例1中的DNA提取方法），利用耐湿主效基因位点qWHCHL09紧密连锁的分子标记ZM428进行分子鉴定，即经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳测试及带型统计（具体如实施例1中的PCR扩增、凝胶电泳及带型统计方法），并于盛花期对186份芝麻种质资源进行耐湿性鉴定，结果表明：通过分子标记辅助选择得到的芝麻核心种质资源中，有62%的资源湿害后存活株率超过186份资源群体均值（43%）。此外，方差分析结果表明，根据扩增标记ZM428得到的两种基因型所划分的两组资源间在湿害后存活株率上存在显著差异（P=0.0163）。由此，通过在苗期鉴定芝麻种质资源耐湿主效基因位点可进行耐湿性状的早期预测，可提高种质资源筛选的效率和准确性。
Claims (4)
1.一种与芝麻耐湿性状主效基因位点紧密连锁的分子标记ZM428的引物，其特征在于：所述的主效基因位点qWHCHL09位于第9连锁群，与其紧密连锁的分子标记ZM428的引物序列为：
ZM428F：5’-AGGATGATGATGTGATGAGAG-3’
ZM428R：5’-CTGCTACTCCTTTTGTCTCTG-3’。
2.芝麻耐湿性状主效基因位点的分子标记鉴定方法，其特征在于：用权利要求1所述的ZM428F和ZM428R扩增芝麻叶片总DNA，可扩增获得520bp-540bp的扩增片段，则表明存在芝麻耐湿性状主效基因位点qWHCHL09，预测该芝麻具有较高的耐湿性。
3.根据权利要求1所述的分子标记ZM428的引物在芝麻耐湿育种中的应用。
4.根据权利要求1所述的分子标记ZM428的引物在芝麻种质资源耐湿性状筛选及早期预测中的应用。
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