CN104928365A

CN104928365A - 一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法

Info

Publication number: CN104928365A
Application number: CN201510258990.3A
Authority: CN
Inventors: 铁双贵; 韩小花; 卢彩霞; 岳润清; 齐建双; 燕树锋; 池海锋; 陈娜娜; 付晓雷; 刘璐
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-05-20
Filing date: 2015-05-20
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2035-05-20
Also published as: CN104928365B

Abstract

本发明公开了一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，该方法步骤如下：1）利用RBSDV病毒S7片段的重组质粒DNA作为标准品，稀释后对获得的梯度标准品进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、Ct值为纵坐标值绘制出标准曲线；2）在玉米苗期周期时间点采集待测玉米品种特定位置叶片并提取RNA；3）对提取的RNA进行荧光定量RT-PCR检测获得不同时间样品的Ct值，再利用标准曲线计算出病毒拷贝数，即可获得该玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图，从而确定抗感性。本发明能够在玉米苗期从分子水平上确定其抗感性，鉴定周期短且可靠性高，具有较大的育种应用价值。

Description

一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，具体地说是一种鉴定周期短、可靠性高的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法。

背景技术

玉米(Maize)在当今社会中发挥的作用越来越大，它不仅仅是重要的粮食作物，也是重要的饲料及工业原料。我国的玉米总产量仅次于水稻产量，在国民经济中占有越来越重要的地位。玉米粗缩病是由水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）或玉米粗缩病病毒（MRDV）引起的一种世界范围的重要病害。2002年，玉米粗缩病在希腊大面积爆发，超过70%的玉米遭受损失。玉米整个生育期都可以感病，苗期是玉米粗缩病的敏感期，发病越早，越易感病，其中5叶期以前易感病，9叶后抗病性增强。玉米粗缩病的典型症状为植株矮小，节间明显缩短，叶面积显著降低，干物质累积显著减少，病情严重时无果穗或有穗不结实，造成严重减产。我国最早于1954年在甘肃西部和新疆南部首次发现该病，其后在全国大部分玉米种植区陆续爆发，不断造成玉米主产区产量下降或者严重减产，成为严重危害玉米生产的重要病害。近年来，随着我国农业种植结构不断调整，暖春天气逐年增多，连续出现适宜粗缩病发生的气候条件，造成玉米粗缩病在黄淮海区域的危害情况逐年加重，各地爆发情况屡见报道，给我国玉米生产和全国的粮食安全带来非常严重的破坏。因此防治该病成为目前玉米生产的主要任务之一。

目前所知的能引起玉米粗缩病的病原有三种，分别为水稻黑条矮缩病毒 (Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)、马德里约柯托病毒(Mal de Rio Cuarto virus，MRCV)和玉米粗缩病毒 (Maize rough dwarf virus，MRDV)，这三种病毒都属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属（Fjivirus）。其中MRDV和MRCV分别能够引起欧洲和南美洲玉米粗缩病。引起我国玉米粗缩病的究竟是何种病原曾经引起过争论。我国玉米粗缩病的病原物分离及测序比对研究确认引起我国玉米粗缩病的病原物为RBSDV，而非MRDV。

玉米粗缩病病毒RBSDV一般不能通过种子、土壤和接触传染，也不能经嫁接、汁液摩擦等传播，只能由灰飞虱刺吸并以持久性方式间歇传播。灰飞虱属温带害虫，广泛分布于东亚、东南亚、欧洲等地，在国内分布则遍及全国各地。灰飞虱能够传播多种病害，如水稻条纹叶枯病、水稻黑条矮缩病、玉米矮花叶病，小麦绿矮病等，危害严重。带毒灰飞虱成虫或若虫在冬小麦、田头地边杂草等场所越冬，第二年3、4月份若虫羽化后成为第一批带毒灰飞虱，随着天气转暖，于4、5月份开始迁飞，5月中旬至6月初平均气温20～25℃，适于灰飞虱活动，田间灰飞虱种群数量达高峰，并在小麦收获前形成迁飞高峰，春、夏播玉米田若在此时遭遇大量带毒灰飞虱则形成大规模病害，造成严重损失。

玉米粗缩病由于其危害严重，可防不可治，且当前生产上推广的玉米品种大部分不抗病，因而急需培育和改良出玉米粗缩病抗性品种，才能从根本上减少该病带来的损失。大规模筛选玉米种质资源是培育抗性品种的基础，对候选种质资源进行抗性鉴定则是重要且必须的措施。

目前对玉米粗缩病进行种质资源鉴定主要有田间自然鉴定法和室内人工接种鉴定法两种。自然鉴定法是长久以来长久应用的方法，但因其受到自然条件的制约，不同年份、不同地点的鉴定结果差异较大，且自然鉴定法无法有效控制诸如灰飞虱带毒率、接虫量、接种时间等的一致性，因而使得鉴定结果不准确。如王桂跃等人通过自然鉴定结果认为丹340表现出较强的粗缩病抗病性，而路银贵等人的自然鉴定研究结果认为丹340属于高感自交系。人工接种鉴定法是在借鉴自然鉴定法基础上建立起来的接种鉴定方法。对于玉米粗缩病而言，包括室内灰飞虱饲养和人工接种鉴定两个方面。室内人工饲养灰飞虱和人工接种玉米粗缩病病毒的方法能够保证鉴定使用的灰飞虱带毒率和接虫数量的稳定性，能够保证鉴定结果重复性好、可信度高。目前室内鉴定均采用苗期接虫，待植株抽雄后通过观察感病症状来确定其抗病性。

科学技术发展日新月异，目前用于检验鉴定植物病毒的方法包括以下几种：生物学方法、血清学方法、电子显微镜法、芯片检测法和分子生物学方法。

生物学方法是通过病毒在病毒特定寄主上接种病毒后，依据寄主上表现出来的局部或系统症状，可以初步确定病毒的种类和归属。该方法的优点在于其操作简单易行，缺点是工作量大，耗时长，而且受季节性限制，准确性不高。目前只有部分实验室仍在采用此种方法，应用不广泛。

血清学方法是利用抗体和其对应抗原的体外特异性结合检测植物病毒。免疫学方法能够较大量的检测鉴定植物病毒。然而对于一些分离纯化比较困难的病毒，应用此方法检测则有一定难度。除了抗体制备的难度大以外，免疫学方法还受到以下几个因素的制约：（1）免疫学检验植物病毒的方法是建立在利用病毒外壳蛋白的抗原性，然而有些植物在某种情况下不含有外壳蛋白，而且类病毒并没有外壳蛋白，这使得该方法的应用受到了限制。（2）某些植物的生殖生长周期制约着该方法的应用。例如，藜属的叶、花、果实中可以检测出CMLV病毒，而在树木休眠后的木本部分却难以用ELISA方法检测。

电子显微镜鉴定法较形态学鉴定方法可以准确直观地观察到植物病毒粒体的形态、大小、表面微细结构和存在部位等信息，结合免疫学检测的电镜检测法则可以更进一步的研究病毒在细胞内的复制和装配、判断血清学关系等。

芯片技术是近年国际上发展迅速的一项高新技术，可以分为基因芯片和蛋白质芯片技术，是植物病毒快速检测技术的重要发展方向。基因芯片技术是将荧光标记技术与DNA 杂交技术相结合的一种基因水平检测法，以其灵敏度高和特异性强等特点，在细菌、病毒等病原鉴定和检测方面发挥着重要作用。其基本原理是将各种不同病毒样品的特征基因片段点样，制成基因芯片，再使荧光标记的待检样品核酸与芯片杂交，杂交信号通过激光共聚焦显微扫描技术进行灵敏、实时、准确的检测，经计算机软件分析并进行结果判断。蛋白质芯片又称蛋白质微阵列，是继基因芯片之后又发展起来的一项具有高灵敏度、高特异性、高质量且微型化的分析蛋白质的新技术。目前，荧光染料标记法是蛋白质芯片检测中应用最广的一种方法，其原理简单，优点是敏感性高、适用安全，并具有良好的分辨率。在蛋白质芯片的基础上，发展出了基体辅助激光解吸电离飞行时间等质谱技术，其基本原理是用生物学或化学的方法将生物制剂或者探针固定在载体上，形成了一个个芯驰矩阵。该方法使用范围较为广泛，是一种特异性强、灵敏度高的快速检测生物分子的技术，在植物病毒的检测和鉴定上有着较好的应用前景。

分子生物学方法主要是通过提取病毒的核酸（DNA 、RNA）来检测病毒的种类和存在。目前主要应用的定性检测分子生物学方法包括病毒核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术和多聚酶链式反应（PCR）技术，定量检测主要是指实时荧光定量PCR技术。此种方法灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作过程也比较简便、可用于大量样品检测。由于分子生物学鉴定方法有无可替代的优点，从而使此方法在植物病毒鉴定中得到迅速而广泛的应用。荧光定量PCR在植物病毒检测与鉴定方面，能够定量检测病毒拷贝数。应用荧光定量PCR检测未知样本时，对模板定量检测可以采用两种方法：相对定量法和绝对定量法。相对定量检测方法用来比较一个目标基因在不同处理下的不同表达水平，指的是在目标基因之间做比较，这些基因具有不同的表达水平，分别来自经过各自处理的样品中。它们分别与非调控的参考基因相比。然后根据△△C_T方法计算出其表达水平。

绝对定量检测方法是应用符合要求的标准品做出标准曲线，通过检测未知样品的Ct值在标准曲线上计算出该样品的核酸拷贝数。实时荧光定量PCR方法相比其他定量方法和普通PCR方法特异性更强、准确性高、灵敏度高、线性关系广（荧光信号的产生与产物扩增呈一一对应关系）、操作简单安全，样品的污染较底（样品的扩增和检测在同一管内进行），且不需要后期处理。由于荧光定量PCR法对检测未知样品含量的优越性，已经在诸多领域如植物病理机制研究，转基因研究中的目标基因表达水平和医学临床检测方面得到了广泛和成熟的应用。

研究证明对玉米植株接种RBSDV，不管是抗病还是感病玉米植株体内，均检测到RBSDV病毒，以上各种方法只能检测病毒的有无，无法对其繁殖动态进行定量观察。另外玉米植株苗期感染RBSDV病毒之后，症状不凸显，不能确定其抗病性，需要等到植株抽雄才能确定其抗病性。因此本申请利用荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后的玉米幼苗体内的RBSDV积累情况进行定量检测，通过观察其繁殖动态曲线，从而快速确定玉米的抗感性。

发明内容

本发明的目的是针对现有玉米粗缩病室内鉴定周期长等缺点，提供一种鉴定周期短、可靠性高的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：该快速检测鉴定方法包括以下步骤：

1）荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线：利用RBSDV病毒S7片段的重组质粒DNA作为标准品，经10倍稀释后对获得的梯度标准品进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为纵坐标值，绘制出标准曲线；

2）玉米样品RNA获取：在玉米苗期周期时间点采集待测玉米品种特定位置叶片并提取RNA；

3）玉米样品病毒拷贝数获取及抗性鉴定：对步骤2）中提取的RNA进行荧光定量RT-PCR检测获得不同时间样品的Ct值，再利用步骤1）中的标准曲线计算出相应的病毒拷贝数，以取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的病毒拷贝数的对数值为纵坐标值，即可获得该玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图，从而快速确定该玉米品种的玉米粗缩病种质抗性。

所述步骤1）中的荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线的具体过程如下：

1.1）标准品制备：利用引物RBSDV-F：5’-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3’和RBSDV-R：5’-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3’扩增RBSDV病毒的S7片段，并回收连接于pMD18-T载体，经测序确认为该S7片段的重组质粒DNA后作为标准品，用Nano drop 2000测得标准品的质粒浓度并计算出标准品起始拷贝数；

1.2）制备梯度标准品：将步骤1.1）获得的标准品作为标准品Ⅰ，对标准品Ⅰ进行10倍稀释获得标准品Ⅱ，并依次进行10倍稀释，最终获得梯度标准品溶液：标准品Ⅰ、标准品Ⅱ、标准品Ⅲ、标准品Ⅳ、标准品Ⅴ，标准品Ⅵ、标准品Ⅶ和标准品Ⅷ；

1.3）对步骤1.2）获得的梯度标准品皆采用引物RBSDV-R和RP：5’-GCT CCT ACT GAG TTG CCT GTC-3’进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为纵坐标值，绘制出标准曲线。

所述步骤1.3）中和所述步骤3）中的荧光定量PCR反应体系每20μL中含：10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH₂O以及0.8μL的10μM引物RBSDV-R和RP；荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s。

对步骤3）中获得的取样时间点、与取样时间点相对应的病毒拷贝数进行进一步鉴定处理的步骤如下：

3.1）以饲毒后周期取样时间点为横坐标值、病毒拷贝数为纵坐标值，对上述数据先进行逻辑斯谛方程拟合，适合逻辑斯谛方程拟合的即为感病品种，进一步根据具体品种的生长极限值和最大生长速度点大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分；

3.2）对不适合逻辑斯谛方程拟合的数据进行直线回归拟合，进一步根据具体品种的斜率大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分。

所述步骤3.1）中的抗性等级划分为：生长极限值为1×10⁸或者最大生长速度点小于33的确认为高感品种；生长极限值为1×10⁷或者最大生长速度点大于43的确认为感病品种；所述步骤3.2）中的抗性等级划分为：斜率小于30的确定为高抗品种，斜率大于30的确定为中抗品种。

所述步骤2）中的玉米苗期周期时间点为RBSDV传毒后3-35天内均匀分布的3-5个时间点；待测玉米品种特定位置为顶部第一个叶片。

所述步骤2）中的待测玉米品种为人工带毒玉米植株，该人工带毒玉米植株的培育过程为：

2.1）无毒灰飞虱继代繁殖：春季采集灰飞虱成虫，而后饲养在小麦幼苗上并产卵，收集刚孵化的1龄若虫即为无毒灰飞虱，之后在小麦幼苗进行人工饲养继代繁殖；

2.2）RBSDV毒源：从田间采集症状表现为绿矮病的小麦病株，带回实验室检测证明小麦病株体内寄生病毒为RBSDV并将带毒的小麦病株作为RBSDV毒源小麦，而后利用无毒灰飞虱在毒源上饲毒而后传毒于麦苗上进行毒源繁殖；

2.3）带毒灰飞虱获得：将室内人工饲养的无毒灰飞虱，置于RBSDV毒源小麦上，饲毒处理后移除毒源，将灰飞虱转移到新鲜健康小麦幼苗上饲养度过循回期即为带毒灰飞虱；

2.4）带毒灰飞虱传毒接种：玉米幼苗长至一叶一心期后在25℃室温下进行传毒接种，三天后移除带毒灰飞虱；

2.5）待测玉米植株取样及RNA提取：移除带毒灰飞虱后开始计算，按周期采集待测玉米品种植株上部第一个叶片并提取RNA。

所述步骤2.4）中的带毒灰飞虱在开始传毒接种前，需要随机抽取一定数量的带毒灰飞虱进行RT-PCR检测RBSDV以计算带毒灰飞虱的带毒率；带毒灰飞虱传毒接种时，按照每株玉米幼苗接种10-15头灰飞虱，并采用80目尼龙网封口的透明玻璃圆筒罩上玉米幼苗。

所述步骤1）中的RBSDV病毒来源于步骤2.2）中的RBSDV毒源。

所述步骤2.3）中的灰飞虱饲毒后的循回期为25-30天。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明的快速检测鉴定方法与以往鉴定方法相比，能够在玉米苗期确定其抗感性，大大缩短了鉴定周期；与利用发病病症确定抗感性的方法相比，玉米苗期RBSDV病毒积累动态曲线从分子水平上确定其抗感性，可靠性高，具有较大的育种应用价值。

附图说明

附图1为本发明的实施例中获得的绝对定量的标准曲线图；

附图2为本发明的实施例中的灰飞虱带毒率检测结果示意图；

附图3为本发明的实施例中C7-2、P138、丹340、478、XH6、Mo17、郑58和郑单958玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。

一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，该快速检测鉴定方法包括以下步骤：1）荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线：利用RBSDV病毒S7片段的重组质粒DNA作为标准品，经10倍稀释后对获得的梯度标准品进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为纵坐标值，绘制出标准曲线；2）玉米样品RNA获取：在玉米苗期周期时间点采集待测玉米品种特定位置叶片并提取RNA；3）玉米样品病毒拷贝数获取及抗性鉴定：对步骤2）中提取的RNA进行荧光定量RT-PCR检测获得不同时间样品的Ct值，再利用步骤1）中的标准曲线计算出相应的病毒拷贝数，以取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的病毒拷贝数的对数值为纵坐标值，即可获得该玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图，从而快速确定该玉米品种的玉米粗缩病种质抗性。

其中步骤1）中的荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线的具体过程如下：1.1）标准品制备：利用引物RBSDV-F：5’-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3’和RBSDV-R：5’-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3’扩增RBSDV病毒的S7片段，并回收连接于pMD18-T载体，经测序确认为该S7片段的重组质粒DNA后作为标准品，用Nano drop 2000测得标准品的质粒浓度并计算出标准品起始拷贝数；1.2）制备梯度标准品：将步骤1.1）获得的标准品作为标准品Ⅰ，依次按照下述稀释方法稀释：1v原液（标准品Ⅰ）+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅱ；1v标准品Ⅱ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅲ；1v标准品Ⅲ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅳ；1v标准品Ⅳ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅴ；1v标准品Ⅴ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅵ；1v标准品Ⅵ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅶ；1v标准品Ⅶ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅷ；最终获得梯度标准品溶液：标准品Ⅰ、标准品Ⅱ、标准品Ⅲ、标准品Ⅳ、标准品Ⅴ，标准品Ⅵ、标准品Ⅶ和标准品Ⅷ；1.3）对步骤1.2）获得的梯度标准品皆采用引物RBSDV-R和RP：5’-GCT CCT ACT GAG TTG CCT GTC-3’进行荧光定量RT-PCR扩增，以各梯度浓度标准品的模板拷贝数的对数值为横坐标值、以各梯度浓度标准品测得的Ct值为纵坐标值，绘制出标准曲线。且在步骤1.3）中和步骤3）中的荧光定量PCR反应体系每20μL中含：10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH₂O以及0.8μL的10μM引物RBSDV-R和RP；荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s。荧光定量PCR反应在Eppendorf Mastercycler实时荧光定量PCR仪中进行。

对步骤3）中获得的取样时间点、与取样时间点相对应的病毒拷贝数进行进一步鉴定处理的步骤如下：3.1）以饲毒后周期取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的病毒拷贝数为纵坐标值，利用SPSS16.0软件，对上述数据先进行逻辑斯谛方程拟合，适合逻辑斯谛方程拟合的即为感病品种，进一步根据具体品种的生长极限值（A值）和最大生长速度点（TmaxG）大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分；3.2）同时利用SPSS16.0软件，对不适合逻辑斯谛方程的数据进行直线回归拟合，进一步根据具体品种的斜率大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分。具体来说，步骤3.1）中的抗性等级划分为：A值为1×10⁸或者TmaxG小于33的确认为高感品种；A值为1×10⁷或者TmaxG大于43的确认为感病品种；步骤3.2）中的抗性等级划分为：斜率小于30的确定为高抗品种，斜率大于30的确定为中抗品种。

另外步骤2）中的玉米苗期周期时间点为RBSDV传毒后3-35天内均匀分布的3-5个时间点；待测玉米品种特定位置为顶部第一个叶片。具体来说，步骤2）中的待测玉米品种为人工带毒玉米植株，该人工带毒玉米植株的培育过程为：2.1）无毒灰飞虱继代繁殖：春季采集灰飞虱成虫，而后饲养在小麦幼苗上并产卵，收集刚孵化的1龄若虫即为无毒灰飞虱，之后在小麦幼苗进行人工饲养继代繁殖；2.2）RBSDV毒源：从田间采集症状表现为绿矮病的小麦病株，带回实验室检测证明小麦病株体内寄生病毒为RBSDV并将带毒的小麦病株作为RBSDV毒源小麦，而后利用无毒灰飞虱在毒源上饲毒而后传毒于麦苗上进行毒源繁殖，且标准品制备过程中采用的RBSDV亦来源于此；2.3）带毒灰飞虱获得：将室内人工饲养的无毒灰飞虱，置于RBSDV毒源小麦上，饲毒处理后移除毒源，将灰飞虱转移到新鲜健康小麦幼苗上饲养25-30天度过循回期即为带毒灰飞虱；2.4）带毒灰飞虱传毒接种：带毒灰飞虱在开始传毒接种前，需要随机抽取一定数量的带毒灰飞虱进行RT-PCR检测RBSDV以计算带毒灰飞虱的带毒率；玉米幼苗长至一叶一心期后，按照每株玉米幼苗接种10-15头灰飞虱，并采用80目尼龙网封口的透明玻璃圆筒罩上玉米幼苗在25℃室温下进行传毒接种，三天后移除带毒灰飞虱；2.5）待测玉米植株取样及RNA提取：移除带毒灰飞虱后开始计算，按周期采集待测玉米品种植株上部第一个叶片并提取RNA。

实施例

本实施例首先说明待测玉米品种植株的带毒培育过程，然后再对该快速检测鉴定方法进行说明。

首先待测玉米品种植株的带毒培育过程为：a）无毒灰飞虱继代繁殖：2014年春季从郑州郊区田间麦苗和杂草中采集灰飞虱成虫，而后饲养在小麦幼苗上并产卵，收集刚孵化的1龄若虫即为无毒灰飞虱，之后在小麦幼苗进行人工饲养继代繁殖。灰飞虱人工大量饲养在专用养虫室内进行，养虫室内保持25℃恒温，利用加湿器调节室内湿度值为灰飞虱适宜湿度，大概80%左右；养虫室内放置三层培养架，长宽高为1.2m×0.8m×1.2m，层高0.4m，每层五排日光灯，保证足够光强，每天光照12h；灰飞虱饲养材料用周麦22小麦幼苗，每钵种60株左右，用透明玻璃圆筒罩上，80目尼龙网封口；一般5-7天换一次幼苗，每钵苗饲养500头灰飞虱。b）RBSDV毒源保存：从田间采集症状表现为绿矮病的小麦病株，带回实验室检测，证明小麦病株体内寄生病毒为RBSDV，以该发病小麦作为RBSDV毒源，用实验室繁殖的无毒灰飞虱饲毒3d，度过循回期后传毒于小麦上，表现绿矮症状的病株即为感染RBSDV，保存于25℃温室中，利用无毒灰飞虱在毒源上饲毒而后传毒于麦苗上进行毒源繁殖。c）带毒灰飞虱获得：将室内人工饲养的无毒灰飞虱，置于RBSDV毒源小麦上，饲毒处理48h后移除毒源，将饲毒灰飞虱转移到新鲜健康小麦幼苗上饲养28天度过循回期即为带毒灰飞虱，用作饲喂带毒灰飞虱的小麦幼苗5-7天更换一次，确保带毒灰飞虱寄主新鲜、健康，减少灰飞虱死亡率，灰飞虱饲毒和度过循回期过程均在25℃温室中进行。d）灰飞虱传毒接种：在带毒灰飞虱在开始传毒接种前需要测试带毒率，经过饲毒的灰飞虱度过28天循回期后则成为有效带毒虫态，每饲毒处理随机取30头灰飞虱，提取单头灰飞虱RNA用RP和RBSDV-R引物进行RT-PCR扩增检测后，经1%琼脂糖凝胶电泳查看灰飞虱的带毒情况：30头灰飞虱中，有7头扩增出339bp大小的片段，其余23头未扩增出目的条带，计算出灰飞虱的带毒率为23.3%，而琼脂糖凝胶电泳检测结果则如图3所示，电泳图谱中所用Maker为Solarbio的D2000 DNA Ladder，谱带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；带毒率测定后，选取C7-2、P138、丹340、478、XH6、Mo17、郑58和郑单958共八种玉米品种作为待测玉米品种进行传毒接种，当待测玉米品种的幼苗长至一叶一心期后开始传毒接种，每株幼苗接种10头灰飞虱，用透明玻璃圆筒罩上，80目尼龙网封口，在25℃室温下进行传毒接种，三天后移除带毒灰飞虱。e）待测玉米植株取样及RNA提取：移除带毒灰飞虱后开始计算，第7d、14d、21d、28d、35d分别采集每个玉米植株上部第一个叶片，并提取RNA进行荧光定量RT-PCR检测。

该快速检测鉴定方法的过程为：1）荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线：1.1）标准品制备：利用引物RBSDV-F：5’-AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG-3’和RBSDV-R：5’-TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG-3’扩增RBSDV病毒的S7片段，并回收连接于pMD18-T载体，经测序确认为该S7片段的重组质粒DNA后作为标准品，用Nano drop 2000测得标准品的质粒浓度并计算出标准品起始拷贝数为2.98×10⁸copy/μl；1.2）制备梯度标准品：将步骤1.1）获得的标准品作为标准品Ⅰ，依次按照下述稀释方法稀释：1v原液（标准品Ⅰ）+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅱ；1v标准品Ⅱ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅲ；1v标准品Ⅲ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅳ；1v标准品Ⅳ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅴ；1v标准品Ⅴ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅵ；1v标准品Ⅵ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅶ；1v标准品Ⅶ+9v稀释缓冲液，得标准品Ⅷ；最终获得三个重复的梯度标准品溶液：标准品Ⅰ、标准品Ⅱ、标准品Ⅲ、标准品Ⅳ、标准品Ⅴ、标准品Ⅵ、标准品Ⅶ和标准品Ⅷ，且标准品Ⅰ、标准品Ⅱ、标准品Ⅲ、标准品Ⅳ、标准品Ⅴ、标准品Ⅵ、标准品Ⅶ和标准品Ⅷ的拷贝数分别为：2.98×10⁷copy/μl、2.98×10⁶copy/μl、2.98×10⁵copy/μl、2.98×10⁴copy/μl、2.98×10³copy/μl、2.98×10²copy/μl、2.98×10copy/μl；1.3）对步骤1.2）获得的梯度标准品皆采用引物RBSDV-R和RP：5’-GCT CCT ACT GAG TTG CCT GTC-3’进行荧光定量RT-PCR扩增，由于标准品Ⅷ的扩增结果不稳定,故在绘制标准曲线时弃用标准品Ⅷ，以标准品Ⅰ、标准品Ⅱ、标准品Ⅲ、标准品Ⅳ、标准品Ⅴ、标准品Ⅵ、标准品Ⅶ的模板拷贝数的对数值为横坐标值、以标准品Ⅰ、标准品Ⅱ、标准品Ⅲ、标准品Ⅳ、标准品Ⅴ、标准品Ⅵ、标准品Ⅶ测得的Ct值为纵坐标值，绘制出标准曲线如图1所示，故本实验的检测灵敏度为298copy/μl，说明本申请提供的快速检测鉴定方法的灵敏度非常高。图1中标准曲线的线性回归方程为：y= -3.17x+39.38（R²=0.997），其中y代表所测样品的Ct值，x代表标准品起始拷贝数的对数值；由图1得知标准曲线的相关系数为0.997，即该标准曲线符合线性计算要求的准确度；将测得的未知样品的Ct值代入标准曲线线性公式即可得到未知样品中的具体核酸拷贝数。2）玉米样品RNA获取：移除带毒灰飞虱后开始计算，第7d、14d、21d、28d、35d分别采集每个玉米植株上部第一个叶片并提取RNA。3）玉米样品病毒拷贝数获取及鉴定：对步骤2）中提取的RNA进行荧光定量RT-PCR检测获得不同时间样品的Ct值，再利用步骤1）中的标准曲线计算出相应的病毒拷贝数，以取样时间点为横坐标值、与取样时间点相对应的病毒拷贝数的对数值为纵坐标值，即可获得不同玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线图如图3所示，其中带实心菱形符号的曲线为玉米品种478体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带实心矩形符号的曲线为玉米品种XH6体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带实心三角形符号的曲线为玉米品种郑单958体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带叉形符号的为玉米品种Mo17体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带星形符号的为玉米品种郑58体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带圆圈符号的为玉米品种C7-2体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带空心矩形符号的为玉米品种丹340体内的RBSDV病毒积累动态曲线、带空心三角形符号的为玉米品种P138体内的RBSDV病毒积累动态曲线，简单来说，当特定玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线位于该RBSDV病毒积累动态曲线图上方时则该玉米品种为感病品种，当特定玉米品种体内RBSDV病毒积累动态曲线位于该RBSDV病毒积累动态曲线图下方时则该玉米品种为抗病品种，从而快速确定该玉米品种的玉米粗缩病种质抗性。从图3能够看出，荧光定量RT-PCR表明RBSDV病毒在不同抗性玉米材料中增殖曲线明显分为两大类，第一类是感病类，植株体内病毒含量远高于第二类，其病毒呈现出直线增长趋势，第二类是抗病类，植株体内病毒含量低，病毒增长缓慢而且存在平台期。5个病毒增殖较快的感病类材料中玉米品种478、Mo17和XH6的病毒量最高，因此鉴定为高感，玉米品种郑58和郑单958病毒含量次之，鉴定为感病；3个抗病类玉米品种中P138病毒含量最低且增殖最为缓慢，鉴定为高抗， C7-2和丹340病毒含量稍高于P138，鉴定为中抗。这个鉴定结果和陈永坤、路银贵、薛林和谢社香等人所在的四家单位的大田多年多点鉴定结果相吻合。因此利用荧光定量RT-PCR检测玉米植株体内病毒含量并绘制病毒增殖曲线能够准确的区分玉米不同种质的抗感性，故该指标能够作为评价玉米抗感能力的一个新的指标。

在上述直观、快速检测鉴定的基础上，将得到的数据进一步通过数学统计方法对玉米品种抗性等级进行更加精准的判断划分。将实施例获得的数据以饲毒后周期取样时间点为横坐标值、以病毒拷贝数为纵坐标值，利用SPSS16.0软件，对获得的数据先进行逻辑斯谛方程拟合，适合逻辑斯谛方程拟合的即为感病品种，进一步根据具体品种的A值和TmaxG大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分，其中A值为1×10⁸或者TmaxG小于33的确认为高感品种、A值为1×10⁷或者TmaxG大于43的确认为感病品种；同时利用SPSS16.0软件，对不适合逻辑斯谛方程的数据进行直线回归拟合，进一步根据具体品种的斜率大小评价各待测玉米品种抗性水平并进行抗性等级划分，其中斜率小于30的确定为高抗品种，斜率大于30的确定为中抗品种。下表一和下表二则为采用SPSS16.0软件分别进行逻辑斯谛方程拟合获得的相关参数和直线回归拟合获得的斜率值。

	478	XH6	郑单958	Mo17	郑58
						A	9.69E+06	6.93E+06	2.66E+07	1.04E+08	8.14E+07
TmaxG	33.01	33.12	43.99	48.46	46.73

表一 SPSS16.0软件进行逻辑斯谛方程拟合获得的相关参数表。

	C7-2	丹340	P138
				斜率值	54.45	85.23	9.56

表二 SPSS16.0软件进行直线回归拟合获得的斜率值。

由表一和表二得出的数值能够得出，采用SPSS16.0软件分析得出的结果与RBSDV病毒积累动态曲线图的结果一致，既表明了RBSDV病毒积累动态曲线图能够在苗期准确判断玉米品种的种质抗性，同时亦通过统计学参数值进一步将玉米品种抗性等级进行更加精准的判断划分。

本发明的鉴定新方法与以往鉴定方法相比，能够在玉米苗期确定其抗感性，大大缩短了鉴定周期；与利用发病病症确定抗感性的方法相比，玉米苗期RBSDV病毒积累动态曲线从分子水平上确定其抗感性，可靠性高，具有较大的育种应用价值。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

<110> 申请人河南省农业科学院

<120> 一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法

<160> 4

<210> 1

<211> 2193

<212> DNA

<213> 小麦

<220>

<223> RBSDV的S7部分

<400> 1

aagttttttt tcgacctgtc tggaccagta cataaaggaa catggataga cctgctcgag 60

aacatttaaa attcagtaaa gcaaacacca aaaacgaaat tagagaaatg agaatttaca 120

aagatgatac tgctgatgga ttatgtttta gcgaaatcaa tgttggatgc acctcctcca 180

ccccgaaaat gtcactctct gattatttta gctcagttag ttgctctttt gatggcgaaa 240

tgcgtatacc tgacgtgcct ttgaagatgt atggcgatct ccacttccac gaacaattca 300

ctaatgacgt agatttagat ttattatgtt ggcaattgct tagttcaaat caagattcac 360

gagcattgtg cgtcaatatc ttacgaatgg ttacttcact ctctcttggt aacgctttca 420

tatctgaagg tagatatcat tatgctattg acacaaccga acaaactagt gctgaagatg 480

ctgatgcttt aaggtttcta gctcgcattg caaaaatagt aatcaaaaat gacgttgaga 540

aaactgattt agtagccgcc caacaaacat tgatttatta ctattttgga aatagttatc 600

aaggaattca tttaaattgg gattctaaat ctagtcaaca gagtattcat ggttactcta 660

cttctgaagt ttgtcttgat cactacattc gcatgaaaat cgatcttttc aaaggtcttc 720

gttccaaaaa tctcgtttat ggtggtaatt accaactagt atatcaagct ttattttatt 780

attatattgt tacaaatggt agattttcaa gtggttttaa cgttcgtaaa gatagtatta 840

aaagttattt tgtccccaat gatgatccca gtgtttgtaa tgttactccc cgtaagccaa 900

gtttaagttt aatgtttatc agagctcttc tagtcatcgc gttgattaaa gattacagtc 960

cagtaaaaga aatacccaga taccttcgac aattagaagt agaaaatccc ttgaataata 1020

cttgtttaat cactgacaat ggcttgagat cagaagttcc aattaatgca aattcttcta 1080

gcacagctgc tcctactgag ttgcctgtct tttcatctcc ttctgcttaa tcttgttttc 1140

cttcgctttt attcgcaatt aaaattccaa aatttgtttt aaatgaatta cactttaagt 1200

gatcattacg cttcgatgta tcgttctgct cctttagaat ttgatcctca tgaccccgaa 1260

attaatcttg tcaatcaaga gtttgatgaa gatgattata cagacttaga tgtgaattta 1320

ctatctgatg accttagctg tttgaatcta atcgctacta gaattaaaaa cgctcctgaa 1380

tacactgctg aaatttttga ttcattcgac gttcctttac cttttgctga gttgcttgat 1440

caggagatag gagaagagtg gtgtgacact agtaatttca tggatttacg cattgttgaa 1500

gatgaaaatg attttgaatt tgtaagctca catatcactc gtcatttgct aatagtttta 1560

aattctaatc ctaatgtctt atggacatct acttgtctat tagcgaagtt gtctttaata 1620

caacatgtta ataactttga tgttattaat tactgggaag caatgaacag aaggtgggaa 1680

ttaatcactg atgaacttaa aatgggtttt gtttttagag cttttaatct taaaagtaac 1740

caattcgaag ttgttactaa attattaagt gacagccttt tttgtcctgg aattagtgtt 1800

attggaaaat taagtatgat acccatgctc actgttcact ctattcctga atatttggat 1860

cattggtttc aaacagacga tttttctagt gataactttt tgtctttcat tcggtttgga 1920

gaaatcactg ttcctaaatg gaaaaaggta gttgtgcaat tttatttgag gcaagttttt 1980

agcagagtta ggactaaagt gttaatagct aatactgatg tagattattg gtattctctg 2040

tttatgcgaa ctttgatatt taagagtatg ttacgaacaa aaactttgat caaaaagata 2100

ctgaattctt aatgtctcgt cggggtggtc tttcatgttc ttattgtagg tggaatctca 2160

gacatgtgtc aaggtcgaaa tgcagctgat gtc 2193

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RBSDV-F

<400> 2

AGA GCT CTT CTA GTT ATT GCG 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RBSDV-R

<400> 3

TCA GCA AAA GGT AAA GGA ACG 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物RP

<400> 4

GCT CCT ACT GAG TTG CCT GTC 21

Claims

1.一种玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：该快速检测鉴定方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所述步骤1）中的荧光定量PCR反应获取RBSDV病毒含量标准曲线的具体过程如下：

3.根据权利要求1或2所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所述步骤1.3）中和所述步骤3）中的荧光定量PCR反应体系每20μL中含：10μL的2×qPCR master mix (Promega)、1.0μL的cDNA模板、8.2μL的ddH₂O以及0.8μL的10μM引物RBSDV-R和RP；荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环；95℃变性15s，60℃退火1min，95℃变性15s。

4.根据权利要求1所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：对步骤3）中获得的取样时间点、与取样时间点相对应的病毒拷贝数进行进一步鉴定处理的步骤如下：

5.根据权利要求4所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所述步骤3.1）中的抗性等级划分为：生长极限值为1×10⁸或者最大生长速度点小于33的确认为高感品种；生长极限值为1×10⁷或者最大生长速度点大于43的确认为感病品种；所述步骤3.2）中的抗性等级划分为：斜率小于30的确定为高抗品种，斜率大于30的确定为中抗品种。

6.根据权利要求1所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所述步骤2）中的玉米苗期周期时间点为RBSDV传毒后3-35天内均匀分布的3-5个时间点；待测玉米品种特定位置为顶部第一个叶片。

7.根据权利要求1或6所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所述步骤2）中的待测玉米品种为人工带毒玉米植株，该人工带毒玉米植株的培育过程为：

8.根据权利要求7所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所述步骤2.4）中的带毒灰飞虱在开始传毒接种前，需要随机抽取一定数量的带毒灰飞虱进行RT-PCR检测RBSDV以计算带毒灰飞虱的带毒率；带毒灰飞虱传毒接种时，按照每株玉米幼苗接种10-15头灰飞虱，并采用80目尼龙网封口的透明玻璃圆筒罩上玉米幼苗。

9.根据权利要求7所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所述步骤1）中的RBSDV病毒来源于步骤2.2）中的RBSDV毒源。

10.根据权利要求7所述的玉米粗缩病种质抗性的快速检测鉴定方法，其特征在于：所述步骤2.3）中的灰飞虱饲毒后的循回期为25-30天。