CN101955932A - 大豆锈菌分子探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大豆锈菌分子探针及其制备方法，以及大豆锈菌分子探针的应用。大豆锈菌分子探针，其特征在于：该探针是上游引物和下游引物进行PCR扩增后形成，该探针的序列是由大豆锈菌基因组中一段序列编码而成，该片段长度为447bp。其制备步骤如下：1)根据已公布的大豆锈菌基因组序列信息，在大豆锈菌基因组JGIAFNA-61H15：Phakopsora pachyrhizi克隆选取447个碱基构成的基因组片段；2)根据上述序列信息设计PCR扩增引物，上、下游引物序列如下：上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’，下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’。本发明具有准确性高、灵敏度高，对取样没有严格限制，不必担心病原交叉感染，早期诊断的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种大豆锈菌分子探针及其制备方法，以及大豆锈菌分子探针的应用，属真菌分子生物学领域。
背景技术
由豆属层锈菌[担子菌纲(Basidomycetes)锈菌目(Urediales)栅锈科(Malampsoraceae)层锈属(Phakopsora)大豆锈菌种(Phakopsora pachyrhizi Sydow)]引起的大豆锈病曾经是热带及亚热带地区大豆生产的主要病害，进入21世纪以来，大豆锈病相继在非洲、美洲大面积流行，每年造成数十万吨的产量损失，在我国，大豆锈病是继孢囊线虫、大豆花叶病毒病之后的第三大病害。对大豆锈病的控制主要是通过化学防治，化学防治的前提是能够准确地预报病情的发展。目前，对大豆锈病的测报主要是通过观察植株的发病症状以及病原菌的生理生化鉴定等常规病理学研究方法做出判断，大豆锈菌在侵染大豆后约1周后才出现侵染病斑，2周后孢子堆破裂才表现出典型的锈菌侵染特征。已有研究表明：大豆锈病主要通过孢子的扩散进行传播，每个孢子经过7-10天的繁殖可产生数以千记的孢子。因此在发病早期对病原做出准确地鉴定，有利于减少病原数量，降低农药使用量，有效控制病情的发展。
分子生物学的研究结果表明：生物的多样性源于它们遗传物质----核酸序列的不同，每个物种均有自身特异的遗传基因即核酸排列顺序。根据每个物种特异的核酸序列设计引物，通过链式聚合反应(PCR)(Gibbs 1990；MμLlis et al.1986)将特异核酸序列在短时间内进行数百万倍的扩增，扩增产物可直观地通过琼脂糖电泳显示出来。基于PCR的分子探针检测方法最大优点在于快速、灵敏，已广泛用于医疗、食品、农业中微生物的快速检测。2002年，美国科学家根据真菌的转录体间隔区ITS区域的序列开发出大豆锈菌分子探针引物，能有效地区分大豆锈菌和细菌性叶斑病，但在早期检测方面，早期开发的探针需接种量为105孢子/mL在接种后第6天才能检测到，而通常在这样的接种强度下，被侵染叶片已出现明显的侵染病斑。
参考文献：
1)Gibbs，R.A.1990，DNA amplification by the polymerase chain reaction.Analytical Chemistry 62，1202-1214。
2)Reid D.Frederick，Christine L.Snyder，Gary L.Peterson，and Morris R.Bonde Polymerase Chain Reaction Assays for the Detection and Discrimination of the Soybean Rust Pathogens Phakopsora pachyrhizi and P.meibomiae，Mycology.Vol.92，No.2，2002 217。
3)Kurt H.Lamour，Ledare Finley，Karen L.Snover-Clift，James P.Stack，Joy Pierzynski，Ray Hammerschmidt，Janette L.Jacobs，Janet M.Byrne，Philip F.Harmon Anne M.Vitoreli，Gail C.Wisler，Carrie L.Harmon，Laurene Levy and Kurt A.Zeller，Christine L.Stone，Douglas G.Luster，Reid D.Frederick，2006，Early Detection of Asian Soybean Rust Using PCR，Plant Management Network。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大豆锈菌分子探针及其制备方法，以及大豆锈菌分子探针的应用，该探针可快速、准确的鉴定大豆锈菌。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：大豆锈菌分子探针，其特征在于：该探针是上游引物和下游引物进行PCR扩增后形成，上游引物、下游引物序列如下：
上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’
下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；
该探针的序列是由大豆锈菌基因组中一段序列编码而成，该片段长度为447bp，核酸序列如下：
caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt 60
ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt 120
gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct 180
atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca 240
gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga 300
ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa 360
ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct 420
actaaattca gtgattcaaa caagaga 447。
上述大豆锈菌分子探针的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：
1).根据已公布的大豆锈菌基因组序列信息，在大豆锈菌基因组JGIAFNA-61H15：Phakopsora pachyrhizi克隆选取447个碱基构成的基因组片段，通过在Genebank上进行序列比对，未发现与之同源的片段，由此推断其为大豆锈菌特异片段，其序列信息如下：
caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt 60
ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt 120
gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct 180
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gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga 300
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ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct 420
actaaattca gtgattcaaa caagaga 447；
2).根据上述序列信息设计PCR扩增引物，上游引物、下游引物序列如下：
上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’
下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；
对上游引物和下游引物进行PCR扩增后，得到大豆锈菌分子探针。
上述大豆锈菌分子探针的应用，其特征在于大豆锈菌分子探针应用于大豆锈菌分子检测，具体步骤如下：
1)大豆锈菌基因组DNA提取：大豆锈病的病原菌为担子菌纲(basidomycetes)锈菌目(Urediales)栅锈科(Malampsoraceae)层锈属(Phakopsora)大豆锈菌种(Phakopsora pachyrhizi Sydow)，其基因组DNA提取方法如下：从田间采集大豆锈病叶片，用毛笔将孢子刷下，将20至100μL孢子收集入直径6CM的研钵中，DNA提取系统采用天根植物DNA提取试剂盒DP321-02，得到大豆锈菌基因组DNA提取液(每20μL锈菌孢子可制得20μL大豆锈菌基因组DNA提取液)，历时约1.5小时；
2)以大豆锈菌基因组为模板，用PCR方法对锈菌特异进行扩增，反应体系25μL，反应体系中各组分为：大豆锈菌基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；
清水做为阴性对照，反应体系中各组分为：清水1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；
3)PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃45s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，历时约3小时，得到PCR产物；
4)PCR产物于1wt％琼脂糖胶进行电泳，琼脂糖胶在凝胶成像系统上进行观察，有大豆锈菌存在的样品中，可见在350-500bp处有一特征带(大豆锈菌DNA提取液的PCR产物电泳后可见在350-500bp处有一特征带)，没有大豆锈菌存在的样品中，则无特征带出现(清水中因不含锈菌，无特征带出现)。
本发明与常规植物病理学检测方法、已有的分子探针相比具有如下优点：
1)准确性高：本发明所述的大豆锈菌分子探针选取核酸片段为大豆锈菌特有，至今尚未在genebank上找到与之同源的序列片段，不必担心与其他豆科锈菌发生混淆。而常规病理学检测需要通过形态和侵染特征区分不同锈菌，容易发生判断错误。
2)操作简单：本发明工艺简单，每个样品只需采集50-100mg即可满足3次以上的PCR鉴定，DNA提取已有商业化的试剂盒，PCR产物观察直观，操作人员稍加培训即可掌握。常规病理学检测要求操作人员具有较强的专业知识，需要通过对菌源的培养、生理生化等多项鉴定才能做出判断。
3)周期短：分子检测从样品DNA提取到获得结果仅需5-8个小时，而常规病理学鉴定完成一个病原的鉴定往往需要几天甚至几周的时间。
4)检测潜伏侵染：PCR检测所用的样品不需要有明显的发病特征，即可检测到侵入寄主体内的病原DNA，鉴定时间比常规病理学鉴定提前5-10天。
5)与已有分子探针相比：源序列来源于基因组DNA高度特异的序列，有极高的灵敏度，可检测的灵敏度为10孢子/mL，在单个孢子接种后第3天即可检测到锈菌的特异DNA。
本发明的有益效果是：
1)准确性高：大豆锈菌分子探针大豆锈菌基因组中高度特异的片段，只有来自大豆锈菌的DNA才能和引物结合形成特异的PCR产物，分子探针的应用使锈菌鉴定更具有准确性。
2)灵敏度高：PCR反应体系的检测灵敏度为10pgDNA模板，相当于几个孢子的DNA数量。在进行检测鉴定时不需要大量取样，通常每个样品仅需采集50-100mg即可满足3次以上PCR反应的模板需要。单个孢子接种后第3天即可检测锈菌的DNA。
3)对取样没有严格限制：分子检测的基础是生物体内核酸序列，同一物种的核酸序列高度稳定，不因环境条件和发育阶段的不同而改变，因此，分子检测取样时，只要保持样品低温、干燥，即可获得很好的结果，样品DNA提取后，可保存数月甚至数年之久，鉴定结果重复性好。常规病理学鉴定在取样则需考虑病原的发育阶段、病原的培养条件，大豆锈菌是专性寄生菌，不能用人工培养，鉴定结果受环境因素限制很大。
4)不必担心病原交叉感染：田间、野外采集的样品常常受到不止一种病原的侵染，由于分子探针的高度特异性，即使样品DNA中混有其他病原的DNA，其也不会与引物结合形成特异的PCR产物。此外，分子检测对样品DNA的质量要求不高，当前通用的DNA提取方法均可满足PCR检测的需要；而常规病理学鉴定时则要求样品尽可能纯，如有其他病原混杂，则会给病原鉴定增加很多难度。
5)早期诊断：分子探针可在锈菌侵染初期作出诊断，此时寄主还没有显示出任何发病症兆，常规病理诊断则等到寄主出现典型的发病特征，鉴定结果比分子诊断晚5-10天。而早期诊断能够做到早期防治，减少损失。
本发明利用已知的大豆锈菌基因组序列信息，重新设计的高度特异的探针。新探针序列高度特异，至今未发现与之同源的序列，能有效地区别大豆锈菌与其他病原，此外，新的探针还具高灵敏度，可检测出10孢子/mL，单孢接种后第3天即可检测锈菌的存在，可以满足大豆锈菌早期诊断的需要。
附图说明
图1是本发明大豆锈菌分子探针特异性检测图。
图2是本发明大豆锈菌分子探针灵敏度的检测图，1-4道：1孢子/mL，5、6、7分别为1000、100、10孢子/mL时的检测结果，8道为清水。
图3是本发明大豆锈菌的早期诊断分子探针电泳结果图：A1.接种1天后；2.接种2天后；3.接种3天后；4.接种4天后；5.接种5天后；6.接种7天后，B.接种3天后的叶片，无病斑。
图4是本发明大豆锈菌分子探针序列图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
大豆锈菌分子探针，该探针是上游引物和下游引物进行PCR扩增后形成，上游引物、下游引物序列如下：
上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’
下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；
该探针的序列是由大豆锈菌基因组中一段序列编码而成，该片段长度为447bp，核酸序列如下：
caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt 60
ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt 120
gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct 180
atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca 240
gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga 300
ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa 360
ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct 420
actaaattca gtgattcaaa caagaga 447。
大豆锈菌分子探针序列见图4。
上述大豆锈菌分子探针的制备方法，它包括如下步骤：
1).根据已公布的大豆锈菌基因组序列信息，在大豆锈菌基因组JGIAFNA-61H15：Phakopsora pachyrhizi克隆选取447个碱基构成的基因组片段，通过在Genebank上进行序列比对，未发现与之同源的片段，由此推断其为大豆锈菌特异片段，其序列信息如下：
caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt 60
ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt 120
gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct 180
atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca 240
gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga 300
ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa 360
ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct 420
actaaattca gtgattcaaa caagaga 447；
2).根据上述序列信息设计PCR扩增引物，上游引物、下游引物序列如下：
上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’
下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；
对上游引物和下游引物进行PCR扩增后，得到大豆锈菌分子探针。
应用实施例1：
大豆锈菌分子探针特异性的检测
1)从田间采集大豆锈病、花生锈菌、花生叶斑病、大豆细菌性叶斑病、大豆花叶病毒病的感染叶片，未感染健康叶片为阴性对照，每个样本取带病斑的叶片100mg，在直径为6CM的研钵中彻底研磨2-5分钟，DNA提取系统采用天根植物DNA提取试剂盒DP321-02，得到样品基因组DNA提取液(每100mg叶片可制得20μL基因组DNA提取液)，历时约1.5小时；
2)以各样品DNA为模板，用大豆锈菌分子探针的引物进行PCR扩增反应，用PCR方法对锈菌特异进行扩增，反应体系25μL，反应体系中各组分为：大豆锈菌感染叶片基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；花生锈菌感染叶片基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP，5U/μL 0.5μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；花生叶斑病感染叶片基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；大豆细菌性叶斑病感染叶片基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；大豆花叶病毒感染叶片基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；以未感病健康叶片DNA为阴性对照，未感病健康叶片基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；
3)PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃45s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，历时约3小时，得到PCR产物；
4)PCR产物于1wt％琼脂糖胶进行电泳，琼脂糖胶在凝胶成像系统上进行观察，电泳结果显示仅大豆锈病病叶的DNA提取液中可扩增出特异性条带，而其他样品以及未感病健康叶片的DNA提取液中均无该条带出现，表明大豆锈菌分子探针具有高度特异性(图1)。本实验重复三次，锈菌检测准确率达到100％。
图1说明：图1为电泳图谱，自左向右检测样品顺序为：DNA分子量标记，大豆健康叶片DNA、大豆病毒病叶片DNA、大豆叶斑病叶片DNA、花叶锈病叶片DNA、花生叶斑病叶片DNA和大豆锈病叶片DNA，大豆锈菌分子探针仅在大豆锈病叶片DNA中能扩增出约450bp的特异片段，在其他样品中没有扩增出相应的特异片段，表明大豆锈菌分子探针具有高度的特异性。
应用实施例2：大豆锈菌分子探针灵敏度的检测
1)将大豆锈菌制成105孢子/mL的孢子悬浮液，取1mL孢子悬浮液，12000rpm离心2分钟，去上清液，锈菌孢子沉于离心管底部，采用植物基因组DNA试剂盒提取锈菌孢子基因组DNA提取液20μL，将总DNA分别稀释至10、100、1000、10000、100000倍，相当于每mL含10000、1000、100、10和1孢子/mL；
2)分别以各稀释度DNA提取液为模板，用大豆锈菌分子探针的引物进行PCR扩增反应，清水做为阴性对照，反应体系25μL，反应体系中各组分为：大豆锈菌基因组DNA提取液10倍稀释液1μL，10pmol/μL上、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl22.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；大豆锈菌基因组DNA提取液100倍稀释液1μL，10pmol/μL上、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl22.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；大豆锈菌基因组DNA提取液1000倍稀释液1μL，10pmol/μL上、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl22.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；大豆锈菌基因组DNA提取液10000倍稀释液1μL，10pmol/μL上、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；大豆锈菌基因组DNA提取液100000倍稀释液1μL，10pmol/μL上、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；清水为阴性对照，清水1μL，10pmol/μL上、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；
3)PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃45s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min；
4)PCR产物于1wt％琼脂糖胶进行电泳，琼脂糖胶在凝胶成像系统上进行观察，电泳结果显示：当105孢子/ml锈菌基因组DNA提取液稀释度为100、1000、1000时，均可扩增出350-500bp的锈菌特异性条带，稀释度为105时，则扩增条带不稳定，由此推断大豆锈菌分子探针可检测的灵敏度为10孢子/mL(图2)，清水中不含锈菌，没有特征带出现。本实验重复三次，准确率为100％。
图2说明：图2为电泳图谱，自左向右检测样品顺序为：DNA分子量标记、1、2、3、4泳道为单个孢子DNA；5泳道为1000个孢子/ml的DNA量；6泳道为100个孢子/ml的DNA量；7泳道为10个孢子/ml的DNA量；8泳道为清水空白对照。采用大豆锈菌分子探针可以在5、6、7泳道中均能扩增出450bp左右的特异片段，在清水中没有特异片段出现，在检测单个孢子DNA时亦没扩增出特异片段，表明大豆锈菌分子探针的灵敏度可以达到10个孢子/ml，尚不能检测到单个孢子的存在。
应用实施例3：大豆锈病的早期诊断
1)菌孢子制成103/mL悬浮液，接种于健康大豆叶片上，每个叶片接种1μL，即1个孢子，未接种叶片对阴性对照。接种后，每天提取叶片DNA提取液，DNA提取采用天根植物DNA提取试剂盒DP321-02，得到大豆叶片基因组DNA提取液(每100mg叶片可制得20μL大豆叶片基因组DNA提取液)，历时约1.5小时；2)DNA为模板，用大豆叶片基因组DNA提取液进行PCR扩增反应，反应体系25μL，反应体系中各组分为：接种大豆锈菌的大豆叶片基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上、下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL，以未接种健康叶片DNA提取液为阴性对照，反应体系中各组分为：未接种大豆锈菌的大豆叶片基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上、下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；
3)PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃45s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min；
4)PCR产物于1wt％琼脂糖胶进行电泳，琼脂糖胶在凝胶成像系统上进行观察，电泳结果显示：从接种后第3天起，从叶片总DNA中均能扩出大豆锈菌特异条带，而此时叶表面没有任何发病症状，接种叶片在第10天后才显出侵染病斑。由此推断：大豆锈菌分子探针可在单孢接种后第3天检测到锈孢子的存在。大豆锈菌分子探针能在被侵染叶片没有表现任何发病症状时做出早期诊断(图3)。本实验重复三次，准确率为100％。
图3说明：图3的A为电泳图谱，自左向右检测样品顺序为：DNA分子量标记，1泳道为单孢接种后1天叶片DNA检测结果；2泳道为单孢接种后2天叶片DNA检测结果；3泳道为单孢接种后3天叶片DNA检测结果；4泳道为单孢接种后4天叶片DNA检测结果；5泳道为单孢接种后5天叶片DNA检测结果；6泳道为单孢接种后6天叶片DNA检测结果，大豆锈菌分子探针在接种后第3天即可从接种的叶片DNA中扩增出大豆锈菌的特异片段。图B大豆叶片接种后第三天，叶片上未显示任何可见病症。图3结果表明大豆锈菌分子探针可以用于锈菌的早期诊断。
Claims (3)
1.大豆锈菌分子探针，其特征在于：
该探针是上游引物和下游引物进行PCR扩增后形成，上游引物、下游引物序列如下：
上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’
下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；
该探针的序列是由大豆锈菌基因组中一段序列编码而成，该片段长度为447bp，核酸序列如下：
caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt 60
ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt 120
gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct 180
atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca 240
gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga 300
ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa 360
ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct 420
actaaattca gtgattcaaa caagaga 447。
2.如权利要求1所述大豆锈菌分子探针的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：
1).根据已公布的大豆锈菌基因组序列信息，在大豆锈菌基因组JGIAFNA-61H15：Phakopsora pachyrhizi克隆选取447个碱基构成的基因组片段，通过在Genebank上进行序列比对，未发现与之同源的片段，由此推断其为大豆锈菌特异片段，其序列信息如下：
caatatgcca tcagcaagca gtacaaaggg cgctccacac caatctcttt gtaaactgtt 60
ttaagagatt tgagggaaac agaagcaaca ctagattttg catttttacc ttttcctatt 120
gaacttggtg ttgaagtggt gtcttgactt tttctatggg cttgaaccat atttaatgct 180
atgagtacgt gaatgattct gtcaagaaat tcatcaagat ttttgaaagt atccatggca 240
gagtttttct gggtattttc atttccttca acgccctcta tagatagtat tgatttttga 300
ttcttgttga aagaaaagca agatgccaaa aatcctgcta aagcacattc aatagataaa 360
ggattttctg aagtaacttt ttctggccta aattgaactg gagctataat atccctggct 420
actaaattca gtgattcaaa caagaga 447；
2).根据上述序列信息设计PCR扩增引物，上游引物、下游引物序列如下：
上游引物：5’GTTATCAGCAAGCAGTACAA-3’
下游引物：5’GGGCCAATCTCTTGTTTGAA-3’；
对上游引物和下游引物进行PCR扩增后，得到大豆锈菌分子探针。
3.如权利要求1所述大豆锈菌分子探针的应用，其特征在于大豆锈菌分子探针应用于大豆锈菌分子检测，具体步骤如下：
1)大豆锈菌基因组DNA提取：大豆锈病的病原菌为担子菌纲(basidomycetes)锈菌目(Urediales)栅锈科(Malampsoraceae)层锈属(Phakopsora)大豆锈菌种(Phakopsora pachyrhizi Sydow)，其基因组DNA提取方法如下：从田间采集大豆锈病叶片，用毛笔将孢子刷下，将20至100μL孢子收集入直径6CM的研钵中，DNA提取系统采用天根植物DNA提取试剂盒DP321-02，得到大豆锈菌基因组DNA提取液；
2)以大豆锈菌基因组为模板，用PCR方法对锈菌特异进行扩增，反应体系25μL，反应体系中各组分为：大豆锈菌基因组DNA提取液1μL，10pmol/μL上游引物、10pmol/μL下游引物各1μL，25mM MgCl2 2.5μL，10×Taq buffer 2.5μL，10mM/LdNTP 0.5μL，5U/μL taq酶0.3μL，加水16.7μL；
3)PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃45s，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，历时约3小时，得到PCR产物；
4)PCR产物于1wt％琼脂糖胶进行电泳，琼脂糖胶在凝胶成像系统上进行观察，有大豆锈菌存在的样品中，可见在350-500bp处有一特征带，没有大豆锈菌存在的样品中，则无特征带出现。
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| CN104164502A (zh) * | 2014-08-04 | 2014-11-26 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一个与大豆抗锈病基因位点紧密连锁的分子标记及应用 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN1888886A (zh) * | 2006-07-31 | 2007-01-03 | 西北农林科技大学 | 小麦条锈病菌分子检测方法 |
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