CN109112128B

CN109112128B - 甘蓝型油菜中一个增强基因表达序列的鉴定及其应用

Info

Publication number: CN109112128B
Application number: CN201810881689.1A
Authority: CN
Inventors: 刘克德; 王晶; 石柳柳
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-08-05
Filing date: 2018-08-05
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2038-08-05
Also published as: CN109112128A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及甘蓝型油菜中一个增强基因表达序列的鉴定及其应用。本发明在甘蓝型油菜qSLWA9基因的上游调控区鉴定到一个3.7‑kb的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列属于不完整的类CACTA(CACTA‑like)转座子，具有增强子功能，能增强基因的表达水平。开发出与增强子是否存在的标记组合，对245份甘蓝型油菜材料进行基因型分析，结合角果长和粒重表型，发现类CACTA转座子存在与否与表型紧密相关。进一步验证表明，类CACTA转座子片段包含增强子元件，在各组织中都能增强基因表达。本发明的类CACTA转座子和标记可用于甘蓝型油菜产量相关性状的改良。

Description

甘蓝型油菜中一个增强基因表达序列的鉴定及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及甘蓝型油菜中一个增强基因表达序列的鉴定及其应用。

背景技术

一个基因编码序列的改变是引起表型变异最重要的分子基础，然而，调控区域序列的改变常影响基因表达水平的改变，进而影响表型变异，也是植物性状改变的重要遗传基础。由调控区序列变异导致的作物产量相关性状变异在水稻(Ishii et al.,2013；Huoet al.,2017)、番茄(Frary et al.,2000)、玉米(Liu et al.,2015)等作物中都有报道，然而在甘蓝型油菜中还未见报道。因此，研究影响油菜产量相关性状基因转录调控区序列的变异将为油菜育种提供新思路。

转座子是进化过程中调控区序列变异的重要来源(Rebollo et al.,2012)。越来越多的研究表明，插入到调控区的转座子可以作为增强子调控基因的表达并影响性状表现(Salvi et al.,2007；Xiao et al.,2008；Studer et al.,2011；Yang et al.,2013)，一个典型的例子是，玉米驯化基因teosinte branched1(tb1)启动子区插入一个作为增强子的转座子(Hopscotch)提高了tb1的表达，抑制了侧生器官的生长，促进了顶端优势，形成了现代栽培玉米的植株形态(Studer et al.,2011)。甘蓝型油菜是异源四倍体物种，转座子是基因组的一个重要组成部分(Chalhoub et al.,2014)，阐明这些转座子是如何影响基因表达和对性状的影响将具有重要意义。

角果长度和粒重是影响甘蓝型油菜产量的重要性状(Yang et al.,2012)。申请人所在的作物遗传国家改良实验室在前期研究中，通过图位克隆的策略分离出一个控制油菜角果长和粒重的基因qSLWA9，并证实了其表达量的升高可促进角果长度和粒重的增加。探索其表达量升高的原因及调控因子的利用将有助于对甘蓝型油菜产量相关性状的遗传育种工作。

发明内容

本发明的目的是提供一个增强甘蓝型油菜角果长和粒重基因qSLWA9表达且位于基因上游调控区的类CACTA转座子片段，该片段含有增强子元件，利用该片段或鉴定该片段的特异性分组标记引物或分子标记组合引物可应用于甘蓝型油菜的性状改良育种中。此外，将增强子序列与其它基因启动子融合，构建表达载体，实现转基因植株中基因的高强度表达，应用于基因功能的研究或转基因育种中。

本发明通过如下技术方案实现：

前期研究中，申请人利用一个具有长角果(10.93±0.72cm)和大粒(4.35±0.29g)的甘蓝型油菜自交系S1和拥有普通角果(4.39±0.41cm)和籽粒(3.46±0.38g)的甘蓝型油菜自交系S2，通过图位克隆的策略分离了一个控制甘蓝型油菜角果长和粒重基因qSLWA9，双亲的比较测序发现亲本S1中qSLWA9基因起始密码子上游3.9‐kb处插入了一段3.7‐kb的DNA片段，并且qSLWA9的在S1中的表达量明显高于S2的。随后，通过一系列的实验，进一步研究了该插入DNA片段的特征及其与qSLWA9表达水平的关系及与油菜角果和粒重表型的关系。

通过角果生长曲线及不同发育阶段qSLWA9基因表达情况，确定了角果的伸长发育与基因qSLWA9的表达水平紧密相关。

通过扫描电镜观察角果皮细胞，表明角果的伸长主要原因是细胞的伸长。

通过3.7‐kb序列分析，发现其是一段不完整的类CACTA转座子。

通过启动子实验，确定该3.7‐kb的类CACTA转座子具有增强基因表达的增强子的作用。

通过将3.7‐kb的片段连接至mini35S启动子前边驱动GUS报告基因表达，确定该片段含有增强子元件。

通过将这3.7‐kb序列从5’端删除不同长度片段后驱动mini35S GUS表达，确定增强子元件位于3.7‐kb末端的460bp内，且可能有两个增强子元件。

通过3.7‐kb片段的有无开发了特异性分子标记引物组合M1和M2，结合245份甘蓝型油菜材料角果长和粒重的表型，确定了该片段与表型密切相关。

本发明的优点在于：在甘蓝型油菜中鉴定了一个增强基因表达的调控元件并开发出鉴定该元件的特异性标记，为甘蓝型油菜产量相关性状的遗传改良提供了新的技术方案，同时该序列可以应用于基因功能的研究或转基因育种研究中。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明插入qSLWA9基因上游调控区不完整的3.7‐kb的类CACTA转座子的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是SEQ ID NO:1所述序列末端463bp含有增强子元件的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:3是通过分子鉴定有3.7‐kb片段的分子标记引物组合M1的左引物(TE‐F)序列。

序列表SEQ ID NO:4是通过分子鉴定无3.7‐kb片段的分子标记引物组合M2的左引物(TEp‐F)序列。

序列表SEQ ID NO:5是本发明的分子标记引物组合M1，M2共同的右引物(TE‐R)序列

图1、角果动态生长情况及角果不同发育阶段qSLWA9基因的表达水平。附图标记说明：图1中的A图：长角果的S1和中双11(ZS11)开花后一个月角果伸长的曲线。图1中的B图：qSLWA9在亲本S1和S2角果发育各时期的表达情况。

图2、本发明所用亲本S1、S2的角果皮细胞大小。附图标记说明：图2中的A图：扫描电镜观察的S1、S2角果皮的细胞，bar＝50μm；图2中的B图：S1、S2角果皮细胞的长度和宽度的统计图，***表示显著性差异P<0.001，该P值是通过双尾的Student’s t检验获得。

图3、示意图展示插入qSLWA9上游调控区3.7‐kb片段的位置及其结构。附图标记说明：TEa‐F位于S2距离起始密码子3.9‐kb上游12.3‐kb的序列内；TEp‐F位于插入S1调控区的3.7‐kb片段内；TE‐R位于qSLWA9起始密码子上游3.9‐kb共有的序列内；STR：亚末端重复序列；TIR：末端重复序列。

图4、利用启动子实验验证插入S1调控区的3.7‐kb片段具有增强基因表达的作用。附图标记说明：图4中的A图：展示了不同长度启动子驱动LUC基因表达的载体情况，Rluc作为内参基因，黑色填充框代表终止子；图4中的B图：不同载体LUC/Rluc表达量的比较，***表示显著性差异P<0.001，该P值是通过双尾的Student’s t检验获得。

图5、3.7‐kb片段截短的不同长度的片段与mini35S GUS连接构建的载体转化拟南芥植株的GUS组织染色图。附图标记说明：依据片段长度(3.7‐kb,1.1‐kb,660‐bp,460‐bp,200‐bp)构建5个载体(编号从#1‐#5)，GUS染色的组织包括幼苗、花蕾、叶片、茎和角果，bar＝1mm。

图6、3.7‐kb片段截短的不同长度的片段与mini35S GUS连接构建的载体(编号从#1‐#5)转化拟南芥植株的GUS酶活的测定结果。附图标记说明：***表示显著性差异P<0.001，该P值是通过双尾的Student’s t检验获得。

图7、本发明转基因所用的基于pCAMBIA3301该造的载体以及基于pCAMBIA2301改造的载体结构示意图。附图标记说明：图7中的A图是由载体pCAMBIA3301改造而成的载体min35S‐GUS；图7中的B图是载体pCAMBIA2301改造而成的载体p2301‐LUC。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步解释本发明。实施例不对本发明做任何形式的限定，本发明的保护范围以权力要求书为准。下述实施例中的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域的常规方法和技术，所使用的实验材料、试剂配方，如无特殊说明，均通过商业途径购得。

实施例1：角果生长曲线绘制及不同发育阶段qSLWA9基因的表达水平

为了便于直观比较甘蓝型油菜整个发育时期角果的生长情况，申请人选取了一个表现普通角果长(约5‐6cm)、千粒重的甘蓝型油菜品种Westar(一个公知公用的品种)和生产上应用较广的长角果、大粒品种中双11号(ZS11)作为参考，在2014年春盛花期于华中农业大学试验田时考察了S1、S2、ZS11、Westar的角果生长动态，标记植株主花序中当天开的花朵，记为0dpa，每个时期每个材料至少测量8个柱头或角果的长度，取其平均长度作为该时期角果的长度并绘制生长曲线。由图1中的A图可以看出，开花当天这些材料的柱头并没有明显差异，但随着角果的发育，长角果材料以大于短角果材料的生长速率生长，短角果材料S2、Westar在开花后第15天左右的时候已基本长足，而长角果材料S1、ZS11在开花后第15天的时候还在快速增长，25天左右才到达平台期，表明角果长度的差异主要受授精后角果的生长速率和角果持续伸长时间的影响。

为了考察此角果的生长动态与基因qSLWA9表达的关系，申请人采用常规的TRIzol提取方法提取亲本S1、S2开花后第5天、第11天、第15天、第20天及第26天角果的RNA，使用含DNase I的试剂盒(ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit，来自ThermoScientific公司,USA)合成cDNA。将各组织的cDNA浓度统一调整为50ng/uL作为qRT‐PCR分析模板。设计qSLWA9的特异引物(正向引物：AACTCGTGACTCGCCTAGC；反向引物：ATCCTAGCAAGAACCCAC)，以油菜Actin BnENTH(Yang et al.,2014)为内参基因，参照ChamQ^TMSYBR Color qRCR Mix(购自Vazyme公司)的说明来配置qPCR的反应体系及扩增程序，使用仪器为CFX96TM Real‐time system(Bio‐Rad)，每个样品设置3次生物学重复和3次技术重复。最后，根据2^‐△△Ct的方法分析结果。随着角果的伸长，基因qSLWA9的表达水平也逐渐升高，在开花后第20天的时候，表达量达到最大值，随后在花后第26天时表达量有所下降，整个过程，qSLWA9的表达水平都是S1显著高于S2的(见图1中的B图)，这与S1、S2的生长曲线的趋势一致，表明角果的伸长确实与qSLWA9的表达水平紧密相关。

实施例2：角果皮细胞扫描电镜分析

当角果不再伸长时，从田间将角果皮切成小块用2.5％戊二醛固定(用0.1M PBS配制)取回实验室，抽真空30分钟，4℃过夜。各级酒精低度脱水，酒精浓度依次为30％、50％、70％各10min，90％、100％各8min，脱水完成后，倒掉酒精，用乙酸异戊酯置换20min，之后对样品进行临界点干燥(CPD 020,Balzers Union)，接着进行样品喷金(Nanotech SEMPrepⅡsputtercoater)，然后用JSM‐6390扫描电子显微镜照相，固定后样品的操作在华中农业大学公共电镜平台进行。通过对S1和S2角果皮细胞扫描电镜的观察，发现S1的细胞长度明显大于S2的细胞长度(见图2中的A图)，t检测表明S1和S2的细胞长度与宽度间的差异均达到及其显著水平(见图2中的B图)，表明S1和S2角果长度的差异主要是由于角果皮细胞长度的差异而非细胞数目的差异造成的。

实施例3：插入长角果亲本S1基因qSLWA9上游调控区3.7‐kb的序列分析

亲本的比较测序表明，S1的qSLWA9起始密码子(ATG)上游3.9‐kb处插入了一个3.7‐kb的DNA片段，将该序列放到NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及RepeatMasker网站上(http://www.repeatmasker.org/)分析，发现该序列是一段不完整的类CACTA转座子序列，其含有右侧的末端重复序列(TIR)(TGTTTCTTGTAGTG)、一个转座酶家族(Transposase_24)基因和亚末端重复序列(STR)(CGTAAAT)(见图3)。

实施例4：3.7‐kb片段插入与基因表达水平的关系

为了验证qSLWA9启动子3.7‐Kb片段的插入是否引起了该基因表达量的升高，本发明利用双荧光素酶报告系统稳定转化拟南芥，在转基因植株中考察萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase/LUC)与海肾荧光素酶(Renilla Luciferase/Rluc)相对表达量的比值，以表示启动子的活性强度。首先，从pGreenⅡ0800‐LUC的载体中扩增LUC基因到Rluc基因的片段克隆进双元载体pCAMBIA2301的多克隆位点SacⅠ和PmlⅠ处，构建含双荧光素酶报告基因的双元载体p2301‐LUC(见图7中的B图)。从亲本S1和S2中利用引物(正向引物：AGAACTGCAGATAATATAAAAGACTATATAAACGGACAGATG和反向引物：GTATCCCCCGGGGGAAGCAGAGAAAGAGATAAAAAAAGGT)扩增出qSLWA9等位的3.9‐kb启动子序列，扩增产物经过回收纯化后经PstⅠ/SmaⅠ酶切并插入到p2301‐LUC载体的PstⅠ/SmaⅠ酶切位点处分别建成载体p3.9S1::LUC和p3.9S2::LUC(见图4中的A图)，然后再将S1该基因启动子中插入的3.7Kb片段利用引物(正向引物：CCCAAGCTTTTATCTTGGCTCTCTCAATGGTGCCAAAT和反向引物：AGAACTGCAGTACTATATACACTACAAGAAAACATATTTTTTACGAGG)通过酶切位点HindⅢ/PstⅠ插入到重组质粒p3.9S1::LUC中构建成p7.6::LUC载体(见图4中的A图),p3.9S1::LUC、p3.9S2::LUC、p7.6::LUC载体中同时含有35S驱动的REN报告基因，校准LUC报告基因的表达量，以上检测成功的融合载体转化农杆菌GV3101，再通过蘸花法稳定转化野生型拟南芥Col‐0，同时将考察T2代株系中阳性株转基因株叶片的LUC/Rluc的相对表达水平。来源于S1和S2含qSLWA9启动子等位的3.9‐kb的LUC/Rluc相对表达水平相近，无明显差异，而来源于S1的含插入的3.7‐Kb片段和3.9‐kb等位序列的LUC/Rluc相对表达水平却极显著的高于不含有3.7‐kb片段的表达水平(见图4中的B图)，表明3.7‐Kb片段的插入确实能提高基因的表达量。

实施例5：插入的3.7‐kb片段含有增强子作用的元件

为了验证插入的3.7‐kb片段中是否含有增强子作用的元件，本发明将minimal35S序列(正向引物：TAGAGTCGACCTGCAGGATATCTCCACTGACGTAAG和反向引物：AGTCCCAAGCTTCGTGTTCTCTCCAAATGAAATG扩增出的99bp)通过酶切位点Pst I和Hind III插入到p3301‐GUS(本室前期改造)载体的GUS报告基因前，构建验证增强子的min35S‐GUS载体(见图7中的A图)，然后将插入的3.7‐kb片段连接到minimal 35S GUS报告基因前构建重组质粒(见图5中的#1)，测序正确的质粒转化农杆菌GV3101后稳定转化野生型拟南芥Col‐0，同时将只有min35S‐GUS空载体作为阴性对照，p330‐GUS载体作为阳性对照转化Col‐0，。取T3代转基因植株的幼苗、茎、花蕾、角果等组织，用GUS染液进行组织化学染色。从图5可以看出，含有3.7‐kb片段融合载体的转基因植株幼苗期的幼苗、叶片都可以检测到GUS较强的表达，生殖期的花蕾、茎、角果也都可以观察到较强的GUS染色，而只转化min35S‐GUS空载体的阴性对照的幼苗、叶片、花蕾、茎、角果却没有检测到GUS表达，表明该3.7‐kb的片段发挥着增强子的作用，且是一个普遍型的增强子，不具有组织特异性。

为了进一步确定这3.7‐kb序列内增强子功能元件的位置和序列，将这3.7‐kb序列从5’端删除不同的片段后获得的剩余的连续核苷酸序列获得1.1‐kb(‐6.34～‐3.92kb)片段、660‐bp(‐5.24～‐3.92kb)片段、460‐bp(‐4.58～‐3.92kb)片段、200‐bp(‐4.12～‐3.92kb)片段(翻译起始密码子ATG中的A为+1)，这些片段分别通过Pst I和Hind III酶切位点与min35S‐GUS连接构建为重组质粒(见图5中的#2，#3，#4，#5)，转化拟南芥后，对转基因T3代株系进行GUS组织化学染色分析。结果表明，1.1‐kb、660‐bp和460‐bp驱动的minimal35S GUS转基因株系的幼苗、叶片、花蕾、茎、角果中都可以检测到GUS表达，且蓝色颜色的深度与全长3.7‐kb的深度并无明显差异，200‐bp驱动的minimal 35S GUS转基因株系的幼苗(主要是叶脉和根)、叶片(主要是叶脉)、花蕾、茎、角果中也可以检测到GUS表达，但强度要明显弱于1.1‐kb、660‐bp和460‐bp片段的转基因株系。扩增3.7‐kb、1.1‐kb、660‐bp和460‐bp片段所用的引物序列(右引物是共有的)如表1所示。

表1扩增3.7‐kb、1.1‐kb、660‐bp和460‐bp片段所用的引物序列

引物名称引物	引物序列(5’-3’)
		S1-minGUS-R	AGAA<u>CTGCAG</u>TACTATATACACTACAAGAAAAC
S1-3.7minGUS-F	CG<u>GGATCC</u>TTATCTTGGCTCTCTCAATGGTGCCAAAT
		S1-1.1minGUS-F	CG<u>GGATCC</u>TGCATCTGAGAAACTCGCTCAAGC
S1-660minGUS-F	CG<u>GGATCC</u>ACAGCCGAGCAACCCCACC
		S1-460minGUS-F	CG<u>GGATCC</u>ATATTTGAGGTTAAAAACAATATTC
S1-200minGUS-F	CG<u>GGATCC</u>TTTACGACGAATATCTGCCCT

本实施所用的GUS染液包括、0.5mM的亚铁氰化钾、0.5mM的铁氰化钾、0.1M的磷酸缓冲液(PH＝7.2)、0.1％Triton X‐100及显色底物2mM X‐Gluc(新鲜配制)。染色步骤为：将组织放入含90％丙酮离心管中冰上固定20min；之后用灭菌的ddH₂0清洗3遍；加入适量的GUS染液37℃过夜培养；70％酒精脱色3次，每30min一次。

另外申请人对这些载体的转基因植株叶片取样，定量检测GUS酶活性，3.7‐kb片段、1.1‐kb片段、660‐bp片段、460‐bp片段驱动的minimal 35S GUS转基因植株的GUS酶活性相互间差异不显著，而200‐bp的转基因株的GUS酶活却极显著低于其他序列的转基因株的(见图6)，这与染色的结果基本一致。以上结果表明，3.7‐kb片段中可能含有2个增强子作用的功能元件，位置分别位于‐4.58～‐3.92kb和‐4.12～‐3.92kb间，且第一个增强子的元件的增强效果要强于第二个。该增强子不仅在油菜中也在转基因拟南芥中具有增强基因表达的作用，表明，该增强子还可以与其他基因启动子结合去增强基因表达，从而分析基因的功能或用于转基因育种。

GUS蛋白酶活性的定量检测如下：转基因拟南芥株的叶片于液氮中研磨成粉末后取适量加入3倍体积的GUS抽提液(Na₂HPO₄,NaH₂PO₄,β‐ME，Na₂‐EDTA.2H₂o，Triton‐X 100)，充分混匀，置冰上30min，10,000g 4℃离心15min，上清即总蛋白粗提液。Bradford法(Bradford 1976)测定粗蛋白浓度，取10‐100μg总蛋白粗提液加入200μL含有1mM底物4‐MUG(4‐甲基伞型酮‐β‐葡萄糖醛酸苷)的GUS抽提液(反应液应提前预热)，于37℃反应，在第40min,80min,120min时各取出40μL加入160μL 0.2M Na₂CO₃终止反应；以4‐MU(4‐甲基伞型酮)为标准品，使用多功能酶标仪Tecan Infinite M200PRO(Tecan Group Ltd.,Switzerland)测定荧光强度(激发光：365nm，发射光：455nm)，根据标准曲线计算反应生成的4‐MU浓度，最终GUS活性以pmol 4‐MU/μg总蛋白/min表示。

实施例6：插入的3.7‐kb片段对油菜角果长、粒重的影响

依据图3的序列分析，申请人针对油菜基因组中是否插入3.7‐kb序列开发了特异性标记，右引物TE‐R(CGTTTTTGAAATTCACATCTTTC)位于S1、S2等位的3.9‐kb启动子序列上，左引物TEp‐F(CGTGTCATTTACGACGAATA)位于插入S1启动子的3.7‐kb片段上，与右引物TE‐R结合成3.7‐kb片段插入基因组的特异性标记M1；左引物TEa‐F(TGCATGAACCTACCTATACG)位于S2距离起始密码子3.9‐kb上游12.3‐kb的序列内，与共同的右引物TE‐R结合成鉴定3.7‐kb片段没有插入基因组中的特异性标记M2，两种标记可以组合成3种基因型：M1M1基因型是鉴定3.7‐kb存在的纯合基因型，M1M2基因型是鉴定3.7‐kb存在的杂合基因型，M2M2基因型是鉴定3.7‐kb不存在的纯合基因型。提取245份甘蓝型油菜材料(来自本实验室收集、四川省农科院及四川农业大学)的基因组DNA，用这两个标记PCR扩增的产物进行基因分型。此外，在成熟期时考察这些材料的角果长和千粒重性状，性状考察的方法参考Yang(Yang etal.,2012)。这245份油菜品系的角果长的范围是3.91‐12.56cm，千粒重的范围是2.31‐5.32g，基因型检测鉴定出25份油菜材料含有3.7‐kb片段的插入，其中有一份材料是杂合基因型，这些材料的角果长范围是7.14‐12.56cm，平均长度是9.06cm，千粒重的范围是3.82‐5.32g，平均大小是4.42g，与没有插入该3.7‐kb片段的油菜的角果长(平均5.52cm)和千粒重(平均3.47g)存在明显差异(见表2)。

表2甘蓝型油菜中角果、粒重的表型与3.7‐kb片段的关联分析

结果表明，3.7‐kb片段的插入与甘蓝型油菜长角果和大粒的表型紧密相关。本发明开发的特异性标记将有助于甘蓝型油菜产量相关性状的改良。

主要参考文献

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序列表

<110> 华中农业大学

<120> 甘蓝型油菜中一个增强基因表达序列的鉴定及其应用

<141> 2018-08-05

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3684

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3684)

<400> 1

gagcaaatat ggtcactcct tcaatggttt gattttgaca actttgattg ctacttgtct 60

gaatcataga tctactttat tacattgtgt accagaaaga tacaagtggc tatatggtca 120

tgattgtcac ctatgtattt cacacgagga tttacctttc acacatacga gtatgggaga 180

catcgggcaa cgagtaacta cggaatatgt gtgaaaggtg aaacagactt ttacgggata 240

ttgcaggaga ttattgaagt ggaatttccg gggttattga agctaaaatg cgtgctcttc 300

aaatgtgaat ggttcgatcc tgttgtgaac cgcgggattc ggtataacaa atttggtgtt 360

gtggatgtca attttgggag aagatacaac aaatttgagc ctttcatttt agcttcacaa 420

gccgagcaag ttagcttcct tccttatcct cggcttcgaa cttccgggat aaactgggta 480

actgctatca aagttacacc tcgtggacgc attgtcgttg gagaagaacc gcccttgcaa 540

gaagaagacg ctatcactga agttgaggta ccagaacaac caactgatga aatccttttg 600

atcgacccgc aaaactttca atatgaagat attcccgaag atgcgacaga tgaagcacgt 660

gaagacgagt tcgagagaag cgacgatgat gattgtaatg atagtgatga gaacgaaaac 720

gatttagagt gatgtaatat atgtatcaaa tgttggattt ctctattgta acattttcta 780

aaagaaagag taagaagtag tatgatataa gatatgatgt tagatgatat gtcactttgg 840

ggtttaggga tttcattctc ggtgtttagg gttaagcgtc gtaatttcgt cgtaaatgga 900

aaaacgcggg cctggtaatt tcgtcgtaac acgaaaaaca cgggcctggt aaattcgtcg 960

taaacggaaa aacacgggcc tggtaaattc gtcgtaaatg gaaaaacgcg ggcctggtaa 1020

attcgtcgta aatggaaaaa cgcgggcctg gtaaattcgt cgtaaatgga aaaacgcggg 1080

cctggtaaat tcgtcgtaaa tggaaaaacg cgggcctggt aaattcgtcg taaatttacg 1140

tcgattttac gacgaatcct aatctatata aggggacgcc gagagcgagg ctgcctcgct 1200

cattcctccc aaactccttt gctctctcta aggtaaactc tctcttctct ctcttttttt 1260

ttttttaaat tagtttaggt gattagttag gtaacggaat tagtttaggt gattagttag 1320

gtaattagtt taggtgatta gttaggtaac ggaataatat ttttattatg ttgtaactga 1380

taaaatttat tttaattttt tttagatggc tcctagaaga aaatccagag cacctagtta 1440

tagagatttg tttggcgacg atggttccgg tacatcttct tccggtccat cgtcttctgg 1500

tccatcatcc tccaccgcag ttccagactc tcagccttct cagagagttg cttggagtcc 1560

tcctccaccg cagatgcctc caccgcaaat gcctccaccg catatgcctc cacctcctcc 1620

tccagcggct gcacctgagc ctgtcccaga aggtgcagtt catccggatt tgcgtgtgcc 1680

ttcatatgcc ccattcgcga gatatacggt agaggatttg cttgcccagc ccggacgaga 1740

gggtttggat gttctagacc ccgatagacc ccgaggaact tattggtaag ttattgattt 1800

ttattacata aaaatttaaa atatttttat tttctaacgg ttaaattgtt ttcctttcag 1860

gtttggggct aataaccgtg ttggccggag cgtttcgaaa acgattaagg gttactacga 1920

cggggcatat ccgaactgga gcaagactcc aaatcacgtt aagatcacgt ggtttaaaat 1980

gtttgcggta agatttttaa atttaattaa attttaactt ttaaatatgt atatattttt 2040

taaatattat tattaattgt aattttttca aattttttgt gtttcagcaa aagtggcatt 2100

ggtctttggg aatcaccgag atggtgaagg cggaattcgt tgcaaaagca aagatccgcc 2160

tctgcaacac agtctccgat tggaaggaca agtgggagct cgacgggtat gagggaaagc 2220

ccactgagct cacgaaggat gtgtgggatg gcctcatcgc ctattggaag cacccgtctt 2280

cgatcaaaaa ggccaattcg tgctcggctt ctcgaagaac gaaggataaa gatggtaatt 2340

tgcccatgct tcacagaacc ggccaaaaac cacatgcagg catccgtcta gacgttgtaa 2400

gttttgtttt taaatattta ttttaaaata ttcaattaat ataactttta atattttttt 2460

tttttgtagt tggagaagac gggagtctta ccatctctgt ctgacctatt caagatgact 2520

cacgccacat ccgacggagt ttttgtggat cctgcatctg agaaactcgc tcaagcagtg 2580

gctactcgga ttgaagaacg ggagacgcaa ctaactcagg agtctcccga tggattaccc 2640

gtcacattgt ccaccgaaga agccgaccga atcttcgaag aggtagtaca actaaatttt 2700

ttttttttca ttatttttaa taactatatt aatatatgtt ttaattttat agctggctcc 2760

tagaaagaag ggccgaatag tcggtatagg ctccgttaac caagttgcaa gggcaacttc 2820

gtcatacact tcgagacggg atgaagagac ttctcagatg aaagctcgaa tggatagcca 2880

gcaggttcgt ttagactctc ttgaggattt gctagacgtg atggccgtgg gaaacccggt 2940

tatgcagaga atgttgagtc agagacgagc cgctcttggg ttgccagtac gagatcccca 3000

agagtccgat ccaacccgtc aacagccgag caaccccacc gactacttcg atgatatgta 3060

gtttttttaa tattttcggt ttgtattatg aatttaaata ttatgacttt taaatgcttt 3120

tttatatatg ttttttattt tcatatttcg ttttaaaatt taatttattt aaaattaaaa 3180

ttatttaaaa ttctgaattt taaataaatt caaattataa tatatttgag gttaaaaaca 3240

atattcaaaa tatattataa aacgaaacgt cgatgtaggc tcgacgtaaa catttacaac 3300

taattaccgt cgaaatgatt tacgagtctt ttacatcgaa gatttcacgt ggtctttaca 3360

tcgaaatttt acgtggagtt tacatcgaaa catttacgag ggtgttacaa cgaaacaatt 3420

tacgtgtgct ttacatcgaa tccattacgt ggagtttacc acgaaatttt acgtgtcatt 3480

tacgacgaat atctgccctg cgctttacga ggaatatatt tcgtcgtaaa cgtaacaagt 3540

catttacgac gaatcgtcgg ttacgacggg cgttttacga cgaaacgtgt ttcgaagttc 3600

attcgtcgta acactccgtt tacgacgaag ttacaacgta tattgccctc gtaaaaaata 3660

tgttttcttg tagtgtatat agta 3684

<210> 2

<211> 463

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(463)

<400> 2

atatttgagg ttaaaaacaa tattcaaaat atattataaa acgaaacgtc gatgtaggct 60

cgacgtaaac atttacaact aattaccgtc gaaatgattt acgagtcttt tacatcgaag 120

atttcacgtg gtctttacat cgaaatttta cgtggagttt acatcgaaac atttacgagg 180

gtgttacaac gaaacaattt acgtgtgctt tacatcgaat ccattacgtg gagtttacca 240

cgaaatttta cgtgtcattt acgacgaata tctgccctgc gctttacgag gaatatattt 300

cgtcgtaaac gtaacaagtc atttacgacg aatcgtcggt tacgacgggc gttttacgac 360

gaaacgtgtt tcgaagttca ttcgtcgtaa cactccgttt acgacgaagt tacaacgtat 420

attgccctcg taaaaaatat gttttcttgt agtgtatata gta 463

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 3

cgtgtcattt acgacgaata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(20)

<400> 4

tgcatgaacc tacctatacg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(23)

<400> 5

cgtttttgaa attcacatct ttc 23

Claims

1.具有增强子功能的类CACTA转座子，其核苷酸序列选自：

1）序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

2）与1）中所述SEQ ID NO:1序列的3’末端463bp 含有增强子元件的核苷酸序列。

2.一种鉴定权利要求1所述的类CACTA转座子上任一序列及侧翼序列的分子标记组合

M2、M1,其特征在于，所述的分子标记引物组合的核苷酸序列如下所示：

分子标记引物组合M2的左引物TEa-F: TGCATGAACCTACCTATACG；

分子标记引物组合M1的左引物:TEp-F: CGTGTCATTTACGACGAATA；

分子标记引物组合M1和M2共同右引物TE-R:CGTTTTTGAAATTCACATCTTTC。

3.权利要求2所述的分子标记组合M2、M1在甘蓝型油菜角果长和粒重性状改良中的应用。

4.如权利要求3所述的分子标记组合M2、M1的应用，其特征在于，包括在鉴定M1M1和M1M2基因型中的应用，其中M1M1是鉴定3.7-kb的纯合基因型，M1M2是鉴定3.7-kb的杂合基因型。