CN101532020B

CN101532020B - 一种植物花特异性启动子及其无筛选标记转化载体

Info

Publication number: CN101532020B
Application number: CN2008101016942A
Authority: CN
Inventors: 储成才; 白先权
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2008-03-11
Filing date: 2008-03-11
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2028-03-11
Also published as: CN101532020A

Abstract

本发明公开了一种植物花特异性启动子及其无筛选标记转化载体。该启动子，是如下a)或b)或c)的DNA分子：a)由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸组成的DNA分子；b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交的DNA分子；c)与a)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能调控目的基因在植物的花器官中特异表达的DNA分子。本发明还公开了含有该启动子的重组表达载体。所述重组表达载体为含有该启动子的重组Cre/loxP系统植物表达载体，该重组表达载体可在培育无标记转基因植物中应用，能在单子叶植物中高效去除标记基因。

Description

一种植物花特异性启动子及其无筛选标记转化载体

技术领域

本发明涉及一种植物花特异性启动子及其无筛选标记转化载体。

背景技术

启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，它基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类。诱导型启动子的特征，为该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。例如：激素诱导启动子、化学诱导启动子、光诱导启动子等。组成型启动子的特点是，受其控制的结构基因的表达具有持续性，但不具有时空特异性；RNA和蛋白质表达量相对恒定，不受外界因素的诱导。例如：玉米Ubiqultin启动子和水稻Actinl启动子。器官或组织特异性启动子的特征，是受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，水稻花药特异性启动子Osg6B、PSP1、PRP1、烟草花药绒毡层特异性启动子TA29、玉米花粉特异性基因启动子Zm13、花药特异性启动子等等。

以重组DNA和转基因技术为核心的基因工程研究使人们利用植物的基因资源成为可能，育种周期大为缩短，为培育农作物新品种提供了新的手段，开辟了植物育种的新时代。为了快速有效地获得转基因植株，绝大多数植物转化都是通过利用抗生素或抗除草剂基因作为筛选标记进行转化细胞的筛选。

转基因植物，尤其是转基因食品的安全性从转基因产品一诞生便引起了争论。人们关注的焦点在于转基因植物是否对人类健康及生态环境带来负面影响，他们忧虑，以抗生素为筛选标记的选择标记基因及其产物在食用时是否有毒性或引起过敏反应；其次，它们是否可能向微生物发生水平转移，使病原微生物增加抗性，引起抗生素失效，从而对临床造成不利(Yoder and Goldsbrough，1994；Puchta，2000；Ebinuma et al.，2001；Hohn et al.，2001)。另外，以抗除草剂作为筛选的抗性标记基因的转基因植物扩散到环境中后是否危害其他作物的安全生产；它们是否亦会转移到杂草中，转变为难以控制的超级杂草，而对生态环境造成严重的破坏(Yoder and Goldsbrough，1994)。正是这些忧虑阻碍了转基因植物的商业化进程。去除筛选标记基因无疑有助于消除人们对转基因植物的恐惧，因此，建立一种快速、高效及简单的无标记选择系统，对提高转基因植物的安全性，加速转基因植物产品商业化进程有着十分重要的意义。

进行无标记选择转基因植物的培育，目前主要采取以下几种系统来去除筛选标记基因：Ac转座系统、共转化系统、同源重组系统、位点特异性重组系统。其中，所有位点特异性重组系统都具有两种基本的成分：重组酶及DNA识别位点。它包括噬菌体P1的Cre/loxP系统(Dale and Ow，1990；Odell et al.，1990；Bayley etal.，1992；Russell et al.，1992)，酵母2μ质粒的Flp/frt系统(Lyznik et aL，1993；Lloyd and Davis，1994；Sonti et al.，1995；Kilby et al.，1995；Baret al.，1996)，酵母pSR1的R/RS系统(Onouchi et al.，1991；Onouchi et al.，1995)，噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser and Kahmann，1991)。位点特异性重组系统首先被Cregg和Madden证明可以用来删除选择标记(Cregg and Madden，1989)。在这四种系统中，对Cre/loxP系统研究较多亦最为深入，它已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用。

Cre重组酶是由噬菌体P1基因组中1029bp的一段序列编码的蛋白质(causerecombination)，由343个氨基酸组成，分子量为38.5kD(Sternbeg et al.，1986)。它不仅具有催化活性，且同限制酶相似，识别特异的DNA序列并进行特定的剪切和拼接。在水溶液中该酶以单体形式存在，其最适反应温度为37℃，甚至在46℃仍有活性(Buchholz et al.，1996)。Cre重组酶对其底物(两个特定的DNA序列)的识别相当灵活，图1表示了Cre重组酶所识别的DNA序列——loxP(Locus ofcrossing over in P1)。loxP是一段长度为34bp的DNA序列，由两个13bp的反向重复序列和一个8bp不对称间隔区组成。这8bp间隔区是位点中唯一不对称部位，这种非对称性决定了loxP位点具有方向性，从而决定了重组的方向性。在Cre酶的介导下，Cre/loxP特异重组系统在细胞内和离体系统中共有3种工作方式：当两个loxP位点方向相同时，将导致位于loxP位点之间的DNA片段被删除；而当两个loxP位点方向相反时，则使位于loxP位点之间的DNA片段发生倒位；如果两个loxP位点不在同一分子上，比如一个质粒上带有一个loxP位点，而在某个染色体上还有一个loxP位点，这样在重组酶的介导下，质粒便可以定点整合到染色体中loxP所在的位置，即所谓的基因打靶(gene targeting)。两个loxP位点可以位于不同的DNA分子上，也可在同一个DNA分子上。重组底物既可以是线形DNA分子，也可以是环状，还可以是超螺旋的DNA分子。在催化重组反应时，不需要其他蛋白质、DNA等辅助因子和额外能量的参与。仅需nmol量的Cre酶即可与loxP位点结合，以完成体内或体外的DNA重组(Lee and Satio，1998)。正是由于这种高效简单的作用方式，Cre/loxP特异重组系统已成为DNA遗传操作的有力工具。

运用Cre/loxP系统去除标记基因目前主要有以下三种策略：1.再转化，它是将携有Cre(或loxP)的植物表达载体转化含有loxP(或Cre)的转基因植株中，通过后代分离即可获得无标记的转基因植株；2.杂交，将分别带有Cre和loxP位点的转基因植株进行杂交，经后代分离可得到无标记转基因植株；3.自切除，由于前两种方法均需要通过自交分离进一步去掉重组酶基因及转化重组酶基因所引入的另一个筛选标记，使得获得无标记转基因植物的过程较长，这势必造成人力、物力的浪费，同时此系统也不适于无性繁殖植物，尤其是木本植物无标记转基因植物的培育，加之Cre重组酶基因在植物中一直高水平表达会导致植物形态和产量改变(Coppoolse et al.，2003)。因此调控Cre重组酶基因在特定时间表达，即用一步法自动切除筛选标记的研究正是完善上述途径的策略之一。目前主要利用一些诱导型启动子来控制Cre重组酶基因在特定时间表达(Sugita et al.，2000；Zuo et al.，2001)，如烟草花药绒毡层特异性启动子TA29控制Cre的表达来获得无标记的转基因植物，但是它在单子叶植物中去除标记基因效率不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物花特异性启动子及其无筛选标记转化载体。

本发明提供的植物花特异性启动子，名称为Os45，是如下a)或b)或c)的DNA分子：

a)由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子；

b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且能调控目的基因在植物的花器官中特异表达的DNA分子；

c)与a)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能调控目的基因在植物的花器官中特异表达的DNA分子。

所述步骤c)中的启动子，与a)的启动子最好有95％以上的同源性。

上述植物花特异性启动子能调控目的基因在植物的雄蕊和雌蕊中特异表达。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述Os45启动子的重组表达载体。

其中，所述重组表达载体具体可为含有所述Os45启动子的重组Cre/loxP系统植物表达载体，该重组表达载体可在单子叶植物中高效去除标记基因。

所述重组Cre/loxP系统植物表达载体是含有两个loxP序列和一个Cre重组酶编码基因和本发明的Os45启动子的植物表达载体；所述两个loxP序列的方向相同，该两个loxP序列间含有Cre重组酶表达盒和标记基因表达盒；所述Cre重组酶表达盒中，启动Cre重组酶表达的启动子是本发明的Os45启动子。

所述重组Cre/loxP系统植物表达载体还含有外源目的基因的表达盒，所述外源目的基因的表达盒位于所述两个loxP序列之外。

其中，上述表达盒从上游至下游依次包括启动子、目的基因和转录终止子。所述Cre重组酶表达盒中的目的基因是Cre重组酶编码基因，所述标记基因表达盒中的目的基因是标记基因。

含有所述Os45启动子的表达盒或扩增所述Os45启动子全长及其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述重组Cre/loxP系统植物表达载体被转入植物时，能将所述两个loxP序列之间的DNA片段删除，从而去除标记基因。

所述重组表达载体的出发载体为双元载体pCAMBIA0390。

所述重组表达载体具体可为如图8所示的表达载体或将图8所示的表达载体的GUS基因替换为所需的目的基因得到的载体或将图8所示的表达载体的GUS基因替换为所需的目的基因并将花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子替换为所需的启动子得到的载体。

本发明所述Os45启动子和所述重组表达载体可用于培育无筛选标记的转基因植物。

含有所述Os45启动子的重组Cre/loxP系统植物表达载体转入单子叶植物或双子叶植物时，可在单子叶植物或双子叶植物中高效去除标记基因；所述植物优选为水稻。

本发明中克隆到的水稻花特异性启动子Os45在水稻中的时空表达模式表明Os45启动子能启动GUS在水稻花器官中特异性表达，其中主要在雄蕊和雌蕊中表达，而在其它组织器官如愈伤组织、根、茎、叶中没有表达。

本发明的用GUS作为外源目的基因的转基因实验证明，含有Os45的重组Cre/loxP系统植物表达载体，在转基因单子叶植物中，可以控制Cre重组酶在雌蕊和雄蕊特异性表达，这样可以同时得到去除筛选标记的雌、雄配子，在转基因植物后代中便可直接筛选到无选择标记的植物；并且Os45启动子启动GUS不能在愈伤组织中表达，从而避免了在愈伤组织筛选过程中由于Os45启动子启动Cre酶的表达去除了筛选标记基因而导致的得不到转基因植株的结果。

附图说明

图1为Cre重组酶所识别的DNA序列-loxP

图2为与水稻开花相关基因的RT-PCR分析

1∶2-8的等比例混合、2：绿叶、3：黄叶、4：根、5：花、6：种子、7：胚、8：愈伤组织、A：S556、B：S561、C：S525、D：S025、E：S476、F：S557、G：S522、H：S488、I：S367

图3为OsMADS45在不同组织及器官中的表达

1：愈伤组织、2：根、3：茎、4：叶、5：花、6：授粉后7天的花、A：OsMADS45、B：18S RNA

图4为PCR扩增Os45启动子的产物

1：Marker(λDNA，EcoRI+HindIII)；2：PCR扩增Os45启动子的产物

图5为植物表达载体pOs45:1391Z的图谱

图6为不同组织器官及不同发育时期花器官的GUS活性

1：开花前14天、2：开花前7天、3：授粉期、4：授粉后7天、5：种子成熟期

图7为Os45启动子在水稻不同组织及不同发育时期花器官中表达模式

A：小花、B：雄蕊、C：雌蕊、D：未成熟种子、E：种子、F：愈伤组织、G：根、H：茎、I：叶

图8为植物表达载体pOs45:MF的图谱

图9为PCR扩增转pOs45:MF株系T₁代NPTII和GUS的产物

1：转pOs45:MF株系5、2：转pOs45:MF株系13、3：转pOs45:MF株系15、4：转pOs45:MF株系19、5：转pOs45:MF株系36、6：转pOs45:MF株系126、7：转pOs45:MF株系147、8：转pOs45:MF株系246

图10为PCR鉴定以Os45控制Cre/loxP系统发生剪切的模式图

图11为T₁代转pOs45:MF株系以P1及P2为引物的PCR扩增

M：DL2000、1：转pOs45:MF株系5、2：转pOs45:MF株系13、3：转pOs45:MF株系15、4：转pOs45:MF株系19、5：转pOs45:MF株系36、6：转pOs45:MF株系126、7：转pOs45:MF株系147、8：转pOs45:MF株系246

图12为Southern鉴定以Os45控制的Cre/loxP系统剪切的模式图

图13为转pOs45:MF株系的Southern杂交图谱

M：Marker(λDNA/EcoRI+HindIII)、1：阴性植株、2：转pOs45:MF株系5、3：转pOs45:MF株系13、4：转pOs45:MF株系15、5：转pOs45:MF株系19、6：转pOs45:MF株系126、7：转pOs45:MF株系36、8：转pOs45:MF株系147、9：转pOs45:MF株系246

具体实施方式

实施例1、水稻花特异启动子Os45的分离及功能鉴定

1水稻花特异启动子Os45的克隆

a)水稻中一些与开花相关的基因的表达分析

为了能克隆到水稻花特异启动子，通过RT-PCR对9个与水稻开花相关的转录因子进行了表达分析。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果如图2。RT-PCR分析结果表明，S556(OsNAC9)及S561(OsMADs45)基因在水稻花中特异性的表达，而其它7个基因并没有表现出花特异表达的特性。

因此，对OsNAC9及OsMADs45基因作进一步的分析。分别取水稻(日本晴)的愈伤组织、根、茎、叶及不同发育时期(开花期、开花后7天)的花器官进行RT-PCR分析。方法如下：

提取水稻(日本晴)愈伤组织、根、茎、叶及不同发育时期(开花期、开花后7天)的花器官的总RNA反转录成cDNA。通过RT-PCR分析OsMADs45基因的表达，以水稻18S RNA作为内对照。扩增产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离。结果表明OsNAC9基因的转录本仅在水稻的花中检测到，而在其它组织或器官如愈伤组织、根、茎、叶和开花后7天的花器官中均未检测到。OsMADS45基因的转录本在水稻花器官(开花期、开花后7天)都能检测到，其中在开花期表达最高，在授粉后7天其表达量开始降低，在愈伤组织、根、茎及叶中均未检测到。OsMADS45基因在水稻不同组织器官的RT-PCR分析表明，OsMADS45基因在水稻花器官中特异性地表达(图3)。

OsMADS45基因属于AP1家族中AGL4亚家族，在水稻的小穗原基、浆片、发育的雄蕊和雌蕊原基上均有表达。OsMADS45基因对于水稻花芽分生组织的形成，特别是花器官的形态建成起着重要的调控作用。因此，拟克隆OsMADS45基因的启动子。

b)OsMADS45基因启动子的克隆

根据华大基因组的水稻基因组序列，设计一对引物P1和P2，引物序列如下：

P1：5′TTAAGCTTGCTGCCTTAGTTTCAGTAGA3′(划线部分为HindIII识别位点)；

P2：5′AAGTCGACCGATCGATCTCCAGCTGCAA3′(划线部分为SalI识别位点)。

以水稻日本晴基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应程序：94℃C预变性5min；然后94℃变性30sec，60℃退火40sec，72℃延伸2min，共30个循环；再72℃延伸10min。

将得到的PCR产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示，得到一条约2.0kb的特异性条带，其大小与预期相当。回收该约2.0kb的DNA片段，克隆到pMD18-T载体中，获得pMD18-T-Os45载体，测序，测序结果表明，从水稻(日本晴)基因组DNA中扩增到OsMADS45 cDNA 5′端上游约2.0kb序列。将OsMADS45基因cDNA 5′端上游2049bp的序列命名为Os45启动子，其核苷酸序列是序列表中的序列1。

为了研究Os45启动子在水稻中的表达模式，用HindIII和SalI双酶切载体pMD18-T-Os45，回收约2kb片段，插入pCAMBIA1391Z(具有不带启动子的GUS报告基因)(购自Cambia，澳大利亚，

http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)的HindIII和SalI位点，使Os45启动子与GUS基因融合，构建得到植物表达载体pOs45:1391Z(图5)。用农杆菌介导法将pOs45:1391Z表达载体转入水稻(日本晴)中，获得10个独立来源的转pOs45:1391Z株系，移栽大田以作下一步分析。

c)Os45启动子在水稻中的时空表达模式

从转pOs45:1391Z水稻开始孕穗到种子成熟，分别取各个转pOs45:1391Z株系的根、茎、叶、花和种子等材料进行GUS活性定量检测。GUS活性定量检测按Jefferson等人的方法进行(Jefferson et al.，1987)。GUS活性＝单位时间内反应生成的MU/蛋白量(pmol MUmg^-1min^-1)。用0.2mol/L Na₂CO₃配制1mmol/L MU(4-甲基伞型酮)，逐级稀释为500、250、125、62.5、31.25和15.625nmol/L，以此制作标准曲线；用Tecan GENios荧光分光光度计(激发光波长为365nm，发射光为455nm)测定每个样品的荧光强度，计算反应生成的MU的量；用Tecan多功能酶标仪Genios Pro(购自瑞士TECAN集团)测定样品中蛋白含量；蛋白含量按照Bradford等的方法进行(Bradford，1976)。

结果如图6所示，表明在转pOs45:1391Z水稻开花前14天(小穗长约5cm)，花器官中GUS已有表达，其活性达到2266.9±78.4pmol MUmg^-1min^-1，明显地高于其它器官根、茎及叶中的活性(都低于500pmol MUmg^-1min^-1)，且随着花的发育，花器官中GUS活性也逐渐升高，至开花时达到最大，达4700.8±334.5pmolMUmg^-1min^-1。此后随着种子的成熟，花器官中GUS活性开始降低，到种子成熟时其活性已回落到与其它器官的活性值相当。在整个花发育时期转pOs45:1391Z水稻的根、茎、叶中GUS活性没有变化，基本处于本底水平。这表明了Os45启动子能启动GUS在水稻花器官中特异性表达。图6中的数据为10个转pOs45:1391z株系的平均值±标准差。

同时，检测了Os45启动GUS在转pOs45:1391z水稻花器官中的具体表达部位。方法如下：在GUS活性测定的同时定期取各转pOs45:1391Z株系的不同组织器官进行GUS组织化学染色。GUS组织化学染色按Jefferson等人的方法进行(Jeffersonet al.，1987)。

结果如图7所示，表明当小花形成时，GUS已开始在其基部表达(图7A)。在开花期，花器官中雄蕊着色较深，颖壳几乎没有蓝色或着色非常浅；雌蕊在其基部被染成蓝色，在柱头上亦有较为浅的蓝色，GUS表达量不如雄蕊高，但在其发育后期有升高的趋势(图7B、C)。在灌浆期，未成熟种子有部分被染成蓝色，但在种子成熟时，GUS几乎不表达(图7D、E)。其它组织器官如愈伤组织、根、茎、叶中在各个时期均未被染成蓝色(图7F、G、H、I)。这一结果与GUS活性测定的变化趋势基本一致，进一步说明水稻Os45启动子能启动GUS在水稻花器官中特异性地表达，其中主要在雄蕊和雌蕊中表达。

转pOs45:1391Z株系不同组织器官及不同发育时期花器官的GUS活性定量测定和GUS组织化学染色的结果综合表明，Os45启动子在水稻中是一花芽分化特异性启动子，其中主要参与雄蕊和雌蕊分化，即在雄蕊和雌蕊中特异性表达。

实施例2、含有Os45启动子的Cre/loxP系统重组表达载体的构建

1.Os45控制下的Cre/loxP系统载体pOs45:MF的构建

a)JoxP序列的设计及合成

根据loxP的序列(Guo et al.，1999)，设计一段长108bp的双链DNA：

此序列由上海博亚公司合成并克隆到pMDl8-T载体(购自北京莱博菲尔生物技术公司)中，得到载体pMDl8-T-loxP。该片段中含有两个同向的loxP位点(序列中斜体示)，在两个位点之间包含有EcoRI和HindIII识别位点(下划线示)，在序列两端还有XhoI及SamI识别位点(下划线示)。

b)Cre/loxP系统载体pOs45:MF的构建

(1)表达载体pBinAR-nptII的构建

XhoI酶切pCAMBIA2300(购自Cambia，澳大利亚，http://www.cambia.org/dai sy/cambia/home.html)，回收nptII片段，将其插入到pBinAR(购自北京莱博菲尔生物技术公司)中CaMV 35S启动子和OCS终止子之间的SalI位点，判断方向，使nptII阅读的方向与CaMV 35S启动的方向一致，获得载体pBinAR-nptII。

(2)pBluSK-loxP-nptII的构建

用BamHI与SalI双酶切pMD18-T-loxP，回收100bp左右的loxP片段，插入到pBheScriptSK(-)(购自Stratagene公司，http://www.stratagene.com)的BamHI与SalI位点之间，获得pBluSK-loxP载体。

EcoRI和HindIII双酶切pBinAR-nptII，回收CaMV35S-nptII-ocs(约1.4kb)并将其插入pBluSK-loxP载体的EcoRI和HindIII位点之间，获得pBluSK-loxP-nptII载体。

(3)构建pC0390-GUS

首先用SmaI和XmnI(两个均为平端酶)酶切pCAMBIA0390(购自Cambia，澳大利亚，http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)，以去除BamHI、HindIII、PstI、SalI及SmaI等一些常用的酶切位点，连接使其重新环化，得到重组载体pC0390。

以EcoRI和BstEII双酶切pCAMBIA1304(购自Cambia，澳大利亚，http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)，回收CaMV35S-GFP-GUS片段，将该片段插入上述pC0390的EcoRI和BstEII位点之间，得到pC0390-GUS载体。

(4)构建pC0390-loxP-nptII-GUS

用SacI与SalI双酶切载体pBluSK-loxP-nptII，回收1.8kb左右的loxP-CaMV35S-nptII-ocs-loxP结构，插入到pC0390-GUS载体的SacI与SalI位点之间，获得pC0390-loxP-nptII-GUS载体。

(5)构建pBluSK-Cre-nos

设计两条引物，引物序列如下：5’TAGTCGACTCTAGCCTCGACATGTC 3’和5’AGCTCGAGTTACTAATCGCCATCTTCC3’。以噬菌体P1DNA为模板扩增Cre重组酶基因片段，然后克隆到pMD18-T载体(购自北京莱博菲尔生物技术公司)中并测序，用SalI和XhoI酶切出的Cre片段，插入到pBlueScriptSK-(购自Stratagene公司，http://www.stratagene.com)的SalI位点，获得载体pBluSK-Cre。

(6)构建pBluSK-Os45

SalI酶切载体pMD18-T-Os45后，DNA末端经Klenow部分补平(只加dATP和dGTP)，琼脂糖凝胶电泳回收Os45启动子，插入pBlueScriptSK-(购自stratagene公司，http://www.stratagene.com)的同样经Klenow部分补平(只加dCTP和dTTP)的BamHI位点，得到载体pBluSK-Os45。

(7)构建pC1300-Os45

SalI酶切pCAMBIA1300(购自Cambia，澳大利亚，http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)后，经Klenow补平使其平端化，重新环化以使载体的SalI位点消失，得到重组载体pC1300。KpnI与SpeI双酶切pBluSK-Os45载体，得到约2.0kb的Os45启动子片段，将该片段回收后插入到pC1300的KpnI及XbaI(与SpeI同尾)位点之间，获得pC1300-Os45，这样可以用HindIII将Os45启动子切出。

(8)构建pC0390-loxP-nptII-Cre-GUS

用HindIII和SacI双酶切pBluSK-Cre-nos，回收得到1.7kb的Cre-nos片段，将其插入到载体pC0390-loxP-nptII-GUS的HindIII和SacI位点，即获得pC0390-loxP-nptII-Cre-GUS载体。

(9)构建pOs45:MF植物表达载体

HindIII酶切载体pC1300-Os45，回收2kb的Os45片段，插入到载体pC0390-loxP-nptII-Cre-GUS的HindIII位点(载体需脱磷处理)，判断方向使Os45启动的方向与Cre酶表达的方向一致，这样即可获得由Os45控制Cre的Cre/loxP系统植物表达载体pOs45:MF(图8)。

2.无标记转基因植物的获得与分子验证

a)转pOs45:MF水稻的获得及T₁代分析

用农杆菌介导法将植物表达载体pOs45:MF转化水稻(日本晴)，共获得8个独立来源的转pOs45:MF水稻株系，移栽大田收获T₁代种子。将8个转pOs45:MF水稻株系的T₁代种子(每个株系至少30粒种子)播在温室中育苗，在苗期取各个转pOs45:MF株系中每个单株的叶片进行GUS组织化学染色，GUS组织化学染色采用实施例1中的方法。GUS组织化学染色结果用以统计T₁代的分离比，结果见表1。

表1转pOs45:MF T₁代株系GUS组织化学染色

株系编号	植株总数	着色数	未着色数	分离比
					5	22	14	8	1.6∶1
13	19	16	3	5.3∶1
					15	27	21	6	3∶1
19	32	15	17	？

36	28	22	6	3.7∶1
					126	25	20	5	4∶1
147	24	16	8	2∶1
					246	30	27	3	9∶1

从表中可以看出，8个株系中除19、246株系明显偏离3∶1的分离比外，其它6个株系基本上符合3∶1的后代遗传分离比，说明这些株系中T-DNA插入可能为单位点插入。

b)无标记转基因植物的分子鉴定

(1)PCR鉴定无标记转基因植物

首先通过扩增抗性基因NPTII鉴定无标记转基因植物。根据nptII基因序列，设计引物1和2，引物序列如下：

引物1(正向序列)：5′-TCG GCT ATG ACT GGG CAC AAC AGA-3′；

引物2(反向序列)：5′-AAG AAG GCG ATA GAA GGC GAT GCG-3′。

此外，又对8个转pOs45:MF株系同时进行了GUS的PCR扩增。

报告基因gusA的检测，根据其基因序列，设计引物3和4，引物序列如下：

引物3(正向序列)：5′-GGA TCC ATC GCA GCG TAA TGC TCT-3′；

引物4(反向序列)：5′-TCT AGA GGT TAA AGC CGA CAG CAG CA-3′。

选取8个转pOs45:MF株系中GUS表达的各个单株，提取基因组DNA作为模板。PCR反应体系为：10×Buffer 2μl、dNTP(10mmol/L)0.4μl、引物(20μmol/L)各0.2μl、Taq酶0.5unit、模板DNA(0.01μg/μl)1μl、H₂O 14.6μl总体积为20μl。扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30sec，60℃退火40sec，72℃延伸90sec，共进行30个循环；最后72℃延伸10分钟，终止反应；PCR产物进行1.2％琼脂糖电泳检测扩增产物。

结果如图9所示，表明在5、15和126株系的GUS表达的各个单株(1、3、6泳道)中均未检测到抗性标记基因NPTII只扩增出GUS，而其它5个株系的GUS表达的各个单株同时扩增出NPTII和GUS基因产物。这一结果说明Cre/loxP系统在13、19、36、147和246五个株系的GUS表达的各个单株中可能没有去除筛选标记，而在5、15和126三个株系的GUS表达的各个单株中则有可能发生了剪切。

根据载体序列在两个loxP位点外侧设计了一对引物P1和P2(图10)。引物P1和P2序列为：

引物P1(正向序列)：5′GCC GCT CTA GAA CTA GTG GAT C3′；

引物P2(反向序列)：5′TCA GAT CTA CCA TGG TCA AGA GTC3′。

PCR反应体系为：10×Buffer 2μl、dNTP(10mmol/L)0.4μl、引物(20μmol/L)各0.2μl、Taq酶0.5unit、模板DNA(0.01μg/μl)1μl、H₂O 14.6μl总体积为20μl。扩增程序：94℃预变性5分钟；94℃变性30sec，60℃退火40sec，72℃延伸90sec，共进行30个循环；最后72℃延伸10分钟，终止反应；PCR产物进行1.2％琼脂糖电泳检测扩增产物。

在载体中引物P1和P2之间的距离为6.39kb，若Os45控制的Cre/loxP系统未发生剪切，用非长片段Taq酶扩增，延伸时间在不超过1分钟的条件下，很难扩增出6.39kb的片段。若Cre/loxP系统发生剪切，则引物P1和P2之间的距离为800bp左右，用一般的Taq酶，延伸时间在40秒左右便可扩增出800bp左右的片段(图10)。结果如图11所示表明，在5、15和126株系的GUS表达的各个单株(1、3、6泳道)中均扩增到800bp左右的片段，5、15和126三个株系的GUS表达的各个单株中可能发生了自动剪切。

(2)Southern杂交鉴定无标记转基因植物

为了进一步证明5、15和126三个株系的T₁代植株确实发生了抗性基因的自动剪除，以GUS片段作为探针，对8个转pOs45:MF株系中GUS表达的各个单株的基因组DNA进行了Southern杂交。按照分子克隆的方法对转基因水稻进行Southernblot分析。用限制性内切酶SacI和BstEII酶切转pOs45:MF株系中GUS表达的各个单株的基因组DNA。若Os45控制的Cre/loxP系统未发生剪切，以SacI和BstEII双酶切的基因组DNA，用GUS片段作探针杂交时，应该杂出一6.47kb的条带；而当Cre/loxP系统自动去除了筛选标记，则杂交出来的片段应为3.3kb(图12)。

Southern杂交结果如图13所示，表明5、15和126株系中GUS表达的各个单株在以GUS片段作探针杂交时，仅杂出一条3kb左右的带(2、4、6泳道)，13、147和246株系中GUS表达的各个单株(3、8和9泳道)杂出了6kb左右的条带，此外，株系19和36中GUS表达的各个单株(5、7泳道)不仅杂出了6kb左右的条带，同时还有一3kb左右的带(该带位置与2、4、6泳道中带的位置相当)，说明Cre/loxP系统在株系19和36的GUS表达的各个单株中极有可能发生了部分剪切。

上面一系列的分子验证结果表明，以Os45启动子控制的Cre/loxP系统的8个转pOs45:MF水稻株系中有三个株系发生了完全的自动剪切，其去除筛选标记基因的效率为38％，而在另两个株系中则发生了部分剪切，再经过一代的筛选可以从中获得无标记转基因植物，因此以Os45控制的Cre/loxp系统发生自动剪切频率可达60％。这与许多研究者利用Cre/loxP系统在双子叶植物中去除标记基因的效率相当。

序列表

Claims

1.一种植物花特异性启动子，是由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子。

2.含有权利要求1所述的植物花特异性启动子的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为含有权利要求1所述的植物花特异性启动子的重组Cre/loxP系统植物表达载体。

4.根据权利要求2或3所述重组表达载体，其特征在于：所述重组Cre/loxP系统植物表达载体是含有两个loxP序列、一个Cre重组酶编码基因和权利要求1所述的植物花特异性启动子的植物表达载体；所述两个loxP序列的方向相同；所述两个loxP序列间含有Cre重组酶表达盒和标记基因表达盒；所述Cre重组酶表达盒中，启动Cre重组酶表达的启动子是权利要求1所述的植物花特异性启动子。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组Cre/loxP系统植物表达载体还含有外源目的基因的表达盒；所述外源目的基因的表达盒位于所述两个loxP序列之外。

6.根据权利要求5所述重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为双元载体pCAMBIA0390。

7.权利要求3-6中任一所述的重组表达载体在培育无标记转基因植物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻。

10.含有权利要求1所述的植物花特异性启动子的表达盒。