CN1423701A - 在转基因植物中激活和除去转基因的诱导型位点特异性重组 - Google Patents

在转基因植物中激活和除去转基因的诱导型位点特异性重组 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与位点特异性重组系统结合的诱导型启动子系统,其允许(i)在特定的时间特异地激活转基因或(ii)从转基因植物中切除和除去转基因(例如,抗生素抗性标记)。这些“自杀”基因表达盒,包括重组系统本身,一旦它们的功能已经发挥,可以从植物基因组中收回。该系统基于时空诱导CRE重组酶的表达,该重组酶随后结合位于所述的转基因侧翼的直接重复的lox位点,导致精确切除基因表达盒。本发明还公开了激活倒置的所以是沉默的转基因的方法,其是将两个lox位点以相反方向放置于转基因的侧翼。这导致了在存在CRE重组酶时间插DNA片段倒置。这样的激活可以通过将CRE重组酶置于诱导型启动子的控制下来按预定时间进行。

Description

在转基因植物中激活和除去转基因的 诱导型位点特异性重组
发明背景
转基因技术已经变成在多细胞生物体中解决重要生物问题的有力工具，尤其是在植物领域。许多传统遗传学不可能完成的方法现在通过转基因技术已经实现，包括在植物中导入同源或异源基因，所述基因功能得以修饰并且表达方式得以改变。这样的技术的成功经常是依赖于利用鉴定转基因植物的标记和控制转基因表达的启动子。
在植物转化中广泛利用了可选择标记。在历史上，这样的标记经常是编码抗生素或除草剂抗性的显性基因(Yoder和Goldsbrough，1994)。虽然这样的标记用途很广，它们确实有一些缺点。用于选择转化细胞的抗生素和除草剂通常对增殖和分化具有负作用，并且可能在转化过程中延迟不定枝的分化(Ebinuma等人，1997)。同时，一些植物种类对这些选择试剂是不敏感的或有耐受性的，因此分离转化的和未转化的细胞或组织是困难的(Ebinuma等人，1997)。另外，这些基因是组成性地表达的，在生长于实验室外的植物中插入这样的组成性表达的基因时，有环境和健康方面的问题(Bryant andLeather，1992；Gressel，1992；Flavell et al.，1992)。
只在期望的时间内沉默或除去这样的标记基因或其它基因或表达它们的系统是非常有用的。将这样的基因放置于可诱导的或特异于组织的启动子的控制下已经完成。例如，已经将在热休克(Medford etal.，1989)，光(Redig et al.，1996)，铜(McKenzie et al.，1998)，四环素(Redig et al.，1996；Faiss et al.，1997；Gatz et al.，1992)或地塞米松(Kunkel等人1999)诱导型启动子的控制下的ipt基因的转基因植物用于研究细胞分裂素的生物效应。其它可诱导系统包括热诱导表达系统(Lyznik等人，1995)，乙醇可诱导系统(Caddick等人，1998)，蜕皮激素系统(Martinez等人，1999)，和TGV地塞米松/四环素系统(Bohner等人，1999)。
虽然发生的频率非常低，并且出现在长期的培养后，但是利用可转座元件Ac切除标记基因已经进行(Ebinuma等人，1997)。切除基因的另一个方法将利用Cre/lox系统。噬菌体P1 Cre/lox位点特异性重组系统(Dale和Ow，1990；Odell等人，1994)包括两个成分：(I)重组酶(CRE)和(ii)重组酶作用的重组位点(lox)。CRE基因编码能够在没有任何其它因子的情况下催化两个lox位点之间的重组的38Kda的重组酶。Lox位点包括对称的8bp的间隔子分开的两个倒置的13bp重复，其中每个倒置的重复是CRE的结合位点。8bp的间隔子的对称特性给出了lox位点的方向性，确定了重组事件的类型。两个倒置的lox位点的存在导致了干扰DNA序列的倒置，而两个直接重复的lox位点的存在导致能够切除干扰DNA序列。
除了叙述的噬菌体P1 Cre/lox系统，有几个位点特异性重组系统已经显示能在植物中工作，这些包括：(i)来自啤酒酵母的FLP-FRT系统(O’Gorman等人，1991)，(ii)来自噬菌体Mu的GIN/gix系统(Maeser and Kahmann，1991)和(iii)来自Zygosaccharomyces rouxii的R/RS系统(Onouchi等人，1991)。
来自啤酒酵母的FLP-FRT重组系统是基于FLP重组酶在FLP重组靶位点(FRT)上的位点特异性重组。FRT包括两个倒置的13碱基对重复和FLP重组酶作用的8碱基对间隔子。通过插入两个侧接靶基因的方向性重复FRT位点，在FLP重组酶的作用下，通过位点特异回收切除干扰DNA片段是可能的。FLP重组酶介导的切除也已经显示是可逆的，提供了在哺乳动物染色体的特异位点中导入DNA的方法(O’Gorman等人，1991)。
噬菌体Mu编码的Gin倒置酶催化了噬菌体中的G区段的位点特异倒置。重组位点(gix)在长度上是34个碱基对，两个位点包括两个交叉区隔开的两个逆向的半位点。GIN通过与两个半位点结合作用于gix位点，介导了DNA交换，和由此的DNA倒置。
来自Zygosaccharomyces rouxii的pSR1的R基因编码介导两个重组位点(RS)之间的位点特异性重组的重组酶。在pSR1上的RS位点含有一对959个碱基对的倒置重复序列，它们含有重组位点(58个碱基对)。根据RS位点的方向性，没有任何其它因子，RS重组酶仍然可以催化大DNA片段(约200,000个碱基对)的切除(方向重复)或倒置(相反方向)。
本文利用的公开物和其它材料说明了本发明的背景或提供关于本方法的其它细节，都引入作为参考，为了方便，归结在附加的参考文献列表中。
发明概述
本发明涉及诱导型启动子系统和位点特异性重组系统的结合应用，使(i)在特定的时间特异地激活转基因和(ii)从曾经利用并且不再需要的转基因植物中切除和除去转基因(例如，抗生素抗性标记)。这些“自杀”基因盒包括重组系统本身，所以能够在一旦发挥作用后，从植物的基因组中赶出。
该系统基于在时间和空间上诱导CRE重组酶的表达的能力，然后重组酶与正讨论的转基因侧接的直接重复lox位点结合，导致准确地切除基因表达盒。为了测试这一系统，利用萤火虫萤光素酶(LUC)报道基因作为重组标记设计允许在植物中检测准确切除事件的构建体。
附图的简要说明
图1是表示pGVG-Cre/lox-luc和诱导型位点特异性重组和原理和干扰填充片段的收回的图解。G1090：启动三-杂合体转录因子GVG的启动子(Ishige等人，1999)；3A-ter：rbcs 3A polyA附加序列；6xUAS：GVG的6x结合位点；CaMV-ter：CaMV polyA附加序列；NOS-ter：胭脂碱合酶polyA附加序列；E9-ter：rbcs E9 polyA附加序列。
图2A-B表示了来自两个独立的转基因拟南芥品系的DEX处理的和非DEX处理的叶子，表示了可诱导的位点特异性重组和“填充片段”的收回。用萤光素酶活性表示了阳性重组部分。
图3是表示干扰转基因的可诱导的位点特异倒置的原理。G1090：驱动三杂合体转录因子GVG的启动子；3A-ter：rbcs 3A polyA附加序列；6xUAS：GVG的6X结合位点；CaMV-ter：CaMV polyA附加序列；NOS-ter：胭脂碱合酶poly附加序列；E9-ter：rbcs E9 polyA附加序列。
图4是能够组成性地表达标记转基因，接着可诱导地切除DNA盒的二元载体的图解说明。X表达盒：编码需要的遗传特性的转基因；G1090：驱动三杂合体转录因子GVG的启动子；3AT：rbcs 3A polyA附加序列；6xUAS：GVG的6X结合位点；NOST：胭脂碱合酶polyA附加序列；E9T：rbcs E9 polyA附加序列；NOS：胭脂碱合酶启动子。
图5是能够可诱导地表达标记转基因，接着可诱导地切除DNA表达盒的二元载体的图解说明。X表达盒：编码需要的遗传特性的转基因；G1090：驱动三杂合体转录因子GVG的启动子；3AT：rbcs3A polyA附加序列；6xUAS：GVG的6X结合位点(高亲和力)；1XUAS：GVG的1X结合位点(低亲和力)；NOST：胭脂碱合酶polyA附加序列；E9T：rbcs E9 polyA附加序列；NOS：胭脂碱合酶启动子。
发明详细说明
本发明证明了将GVG可诱导系统与噬菌体P1 Cre/lox位点特异性重组系统结合使用可以从转基因拟南芥植物位点特异性地切除DNA片段(美国专利申请系列编号09/014,592，引入本文作为参考，Aoyama和Chua，1997)。产生的构建体pGVG-Cre/lox-luc包括驱动CRE的表达的GVG诱导型启动子系统(Aoyama和Chua，1997)和驱动LUC表达的CaMV 35S启动子，它受到干扰DNA表达盒，一个含有侧接NOS polyA附加序列的两个直接重复lox位点的“填充片段”的转录封闭(图1)。
该系统的工作如下：(I)给转基因植物添加化学诱导物，本发明的实施例中的类固醇激素地塞米松(DEX)导致三杂合体转录因子GVG的构象的变化和“激活”，这一转录因子能够结合6XUAS启动子序列和启动CRE的转录。(ii)产生的CRE重组酶与直接重复lox位点结合，产生位点特异性重组和导致NOS终止子的切除。(iii)在NOS终止子的重组和除去后，CaMV 35S启动子能够驱动标记的重组部分的LUC表达。
我们已经在Arabidopsis thaliana中转化了pGVG-Cre/lox-luc，并且分析了DEX处理之前和之后发生的位点特异性重组事件。在温室条件下生长含有GVG-Cre/lox-luc转基因的拟南芥植株2个星期，接着应用DEX。在来自各种转基因幼苗的一个标记叶子上应用(涂)20微摩尔/升的DEX溶液。然后将幼苗移回温室6-12小时。然后，从幼苗上与邻近的非DEX处理叶子一起切下标记的DEX处理叶子，放置于培养皿上，接着用萤火虫萤光素酶底物荧光素。然后，利用冷却的CCD相机检测所有叶子的LUC活性。
虽然利用GVG可诱导系统成功地证明了我们的系统，如所述的实施例，任何可诱导的或去阻遏的表达系统将能有效地工作。其他可诱导的系统包括，但不限于热可诱导表达系统(Lyznik等人，1995)，乙醇可诱导系统(Caddick等人，1998)，蜕皮激素系统(Martinez等人，1999)，和TGV地塞米松/四环素系统(Bohner等人，1999)。
除了所述的噬菌体P1 Cre/lox系统，存在几个位点特异性重组系统，已经显示能在植物中工作，他们包括(I)来自啤酒酵母的FLP-FRT系统(O‘Gorman et al.，1991)，(ii)来自噬菌体Mu的GIN/gix系统(Maeser and Kahmann，1991)和(iii)来自Zygosaccharomycesrouxii的R/RS系统(Onouchi et al.，1991)。虽然我们已经证明了利用Cre/lox系统的回收，所有上面的重组系统也可以用于可诱导或去阻遏转基因收回，或利用诱导型启动子驱动所述重组酶的表达的激活。
所述的位点特异性重组的例子包括允许沉默转基因的激活的填充片段的收回。当将lox位点相反方向放置时，通过干扰DNA片段的位点特异的逆转，激活基因也是可能的。
可诱导或去阻遏系统与重组系统结合使用允许特定地收回任何放置于选定的重组位点之间的单个转基因。利用‘两个成分’系统也是可能的，其中利用了两个可诱导系统。这允许利用一个诱导物可诱导地激活讨论中的转基因(例如，抗生素抗性标记)，接着一旦转基因(例如，抗生素抗性标记)完成它的功能，利用第二个诱导物收回完整的转基因，包括重组系统。或者，具有不同诱导物亲和力的诱导型启动子可以用于选择性地激活一个转基因，而不是其它依赖于讨论中的诱导物的浓度的转基因。利用Cre-催化切除生物学从植物基因组收回转基因(例如，抗生素抗性标记)已经有报道(Daleand Ow，1991；Odell et al.，1994)。但是，这些事件依赖于基因转移，转基因随后的切除，让重组转基因与第二个标记基因连接，仍然存在于植物基因组中。
虽然所述的系统是在Arabidopsis thaliana中测试的，在这一目的中可以利用任何可转化的植物种类。
特定地从转基因植物除去转基因的能力提供了在没有潜在地对环境不安全的转基因如抗生素抗性标记的情况下在作物种类中工程化需要的遗传特性的方法。通过除去“填充”片段或将沉默的转基因倒置成用于功能表达正确的方向也可以利用该系统激活沉默转基因。所述的位点特异性重组系统具有实现这些目的的能力，并且这些可以分成两大类：A)通过切除或倒置时间性地激活沉默基因和B)在利用后收回组成性表达的基因。
参考下面的实施例描述本发明，它们是以举例的方式提供的，不以任何方式限制本发明。使用本领域已知的标准技术，或下面具体描述的各种技术。
                     实施例1
        通过切除或倒置时间性地激活沉默转基因
A)除去“填充”片段
这一实施例明确地证明了可以暂时激活沉默转基因。该原理的基础是当放置于启动子和讨论中的转基因之间时，终止子序列具有从组成性启动子废除转基因的功能表达的能力(图1)。通过将两个方向lox位点放置于终止子序列(这里是NOS-ter)的侧翼，由可诱导的重组酶表达切除终止子序列导致功能性转基因表达是可能的。将萤火虫萤光素酶(LUC)报道基因用作用于功能重组和随后的转基因激活的标记。地塞米松的加入诱导了CRE的表达，这将切除两个lox位点之间的终止子区。在没有地塞米松时，在35S启动子和萤光素酶基因之间NOS-ter的存在阻止了萤光素酶的表达。在加入地塞米松后，诱导切除NOS-ter的CRE，LUC基因是CaMV 35S启动子控制的，并且得以表达。这一基因甚至在没有地塞米松时也表达。本文利用的LUC基因只是一个例子，因为它的表达容易观察到。它可以用任何其它需要的基因替代，在加入地塞米松之前同样是沉默的，但在加入地塞米松后启动了，并且在地塞米松撤除后仍然是启动状态。
正如从图2A-B可以看到，利用DEX在转基因拟南芥幼苗的叶子中诱导了位点特异性重组。同样明确的是该系统没有显示非特异诱导，正如在非处理叶子中缺乏萤光素酶活性所证实的。在实际应用中，LUC基因可以简单地利用任何转基因替代。下面给出了叙述的实施例。
在拟南芥中花的同源异型基因的表达依赖于分生组织特性基因如LEAFY的作用，该基因编码确定分生组织产生花而不是叶子和茎的转录因子。LEAFY参与了同源异型基因的作用，这些基因在花的特定区表达(Busch等人.，1999)，并且已经显示，LEAFY的异位表达导致在转基因白杨中诱导了花(Weigel和Nilsson，1995)。
利用已开发的位点特异性重组系统，在转基因的树中产生时间性的激活LIAFY是可能的，这些树显示了需要的特性，如在几年后在田间快速地生长。处理的树将开花并且长种子，可以立即用于体细胞胚胎发生的繁殖。
B)转基因倒置
将两个lox位点相反方向放置导致了干扰DNA片段的倒置。利用位点特异性重组系统，通过时间性地倒置所述的转基因激活沉默的转基因是可能的(图3)。在组成性启动子后面以反义方向放置转基因导致转基因的非功能性表达。时间性地表达重组酶导致转基因位点特异地倒置成有意义方向导致转基因的激活。虽然可行，但这一途径的缺点是由于在重组后连续地存在两个重组位点，重组事件是可逆的。在效果上，这意味着干扰DNA片段在存在重组酶时，可以前后翻转。
                     实施例2
            在使用后收回组成性表达基因
A)组成性表达标记转基因之后可诱导地切除
为了鉴定已经利用转基因成功地转化的个体，任何植物种类的转化需要选择标记。这通常是利用抗生素抗性标记基因如nptII和hptII或作为转基因表达盒的一部分与需要的遗传特性一起整合进植物基因组的编码茎再生特性如异戊烯基转移酶的基因(Kunkel等人，1999)。一旦转化植物已经再生，所述的可诱导的重组系统可以除去“标记”基因，并选择用于成功的转基因整合只留在需要的转基因之后(遗传特性)。原理如下：构建的植物转化二元载体在整合序列的左和右边界之间含有如下成分(图4)：(i)需要的基因(X表达盒)，(ii)组成性表达标记基因，例如在图4中表示的NOS启动子控制下的卡那霉素或CKIl，和(iii)可诱导地表达重组酶，例如利用在6XUAS启动子控制下的CRE结合的GVG系统，如图4中所示。内部的序列顺序并不必需如图4所示。含有标记基因和重组酶的表达盒与两个直接重复的重组位点侧接。
在用载体转染时，通过组成性表达的标记可以鉴定转染的植物或细胞。在选择转染植物或细胞后，用结合GVG的DEX处理选择的植物或细胞，这一复合物依次结合诱导CRE的6XUAS，CRE然后切除两个lox位点之间的完整载体区，从而留下RB，X表达盒，一个拷贝的lox和LB。这个系统允许通过标记基因选择，接着通过位点特异性重组应答诱导物收回标记基因再生含有需要的基因的转基因植物。
B)可诱导地表达标记转基因，接着可诱导地切除
可以操作诱导型启动子系统使其对诱导物的亲和力改变。在这一方面，构建位点特异性重组系统是可能的，其中标记基因和重组酶都在同一诱导型启动子的控制下，但对讨论中的诱导物具有不同的亲和力。原理如下：构建的植物转化二元载体在整合序列的右边界和左边界含下面成分(图5)(i)需要的基因(X表达盒)，(ii)利用高亲和力启动子(本文，6xUAS)诱导性地表达的标记基因(例如，卡那霉素或CK11)，和(iii)利用低亲和力启动子(本文，1xUAS)诱导性表达重组酶(例如，CRE)。内部序列的顺序并不必需如图5所示。含有标记基因和重组酶的表达盒与两个直接重复的重组位点(在本实施例中是lox)侧接。
为了利用这一系统，用该载体转染植物或细胞。附加低水平的诱导物(在本实施例中是DEX)诱导了在高亲和力(6xUAS)启动子而不是低亲和力(1XUAS)启动子的控制下的基因。在本实施例中，低水平的DEX诱导了可以用于选择转染细胞或植物的卡那霉素或CKI1。在选择转染细胞或植物后，用高水平的诱导物处理，然后结合足够的GVG以便在足够高的浓度时结合1XUAS诱导CRE的合成。然后在两个lox位点，CRE切除载体区，只留下作为整合的核酸的RB，X表达盒，一个拷贝的lox和LB。
这一系统允许利用低浓度的诱导物诱导标记基因再生转基因植物，接着用高浓度的诱导物收回标记基因。利用只区别在于诱导物亲和力的诱导型启动子激活标记基因和重组酶具有可控制的标记基因激活的附加的优点，这在利用编码参与茎再生或发育方式的蛋白质的标记基因时可能是重要的。
这一系统的其他方面的改进是利用了对重组酶的亲和力较低的突变重组位点。显示对CRE具有较低的亲和力的突变lox位点已经被证实(Albert等人，1995)并且保证在提高诱导物的浓度之前，即由于遗漏了CRE的表达而没有发生转基因的收回。
                 实施例3
    叶绿体编码的转基因的可诱导收回或激活
来自转基因植物的通过花粉的外源核编码的基因，特别是可选择标记基因如抗生素抗性基因的水平基因转移是与环境有关系的。克服这一潜在的问题的方法是在质体中包含外源基因，因为花粉不转移质体编码的基因。在烟草中已经显示了有高频质体转化(Svab和Maliga，1993)，并且对大量的植物种类中可以进行。克服通过花粉转移水平基因的潜在危险的一个方法是在成功选择后将质体转化与叶绿体定位的可选择标记基因表达盒的可诱导收回偶联。该系统的原理是与所述的实施例2基本相同，只有下面的修改。含有组成性选择标记基因如抗生素抗性标记的转基因表达盒与直接重复的lox位点侧接，并存在于质体的基因组中。在正选择转基因植物后，如前面所述诱导了CRE，但是，在这时，CRE的重组酶基因已经工程化，含有特别的编码用于靶击叶绿体的N末端转运肽的DNA序列(Schnell，1995)。在加入诱导物后，产生了CRE重组酶，并转位到质体，在那里它作用于lox位点，并除去了可选择标记基因。也可以应用实施例1的原理，可以将这一系统用于通过适当放置lox位点可诱导地收回或激活任何叶绿体编码转基因。
                   实施例4
               定位激活或收回
上面公开的位点特异性重组系统和利用所述重组的任何变化和可诱导的或去阻遏的启动子系统可以用于在植物中的组织特异位置永久性地激活转基因。
拟南芥ttg突变缺乏毛状体和花色素苷色素(Lloyd等人，1994)。这一突变表现型可以用玉米调节R的表达来逆转(这需要第二个调节子C1)，这在玉米的花色素苷的表达中是需要的。R蛋白质含有酸性的和碱性的HLH区，与哺乳动物MYC转录调节子的HLH区域具有强同源性。利用所述的可诱导位点特异性转基因激活系统产生可以激活R基因表达和由此的在将在植物的生命循环中组成性地表达的特异区域的花色素苷生产的转基因ttg植物。
在野生型拟南芥和其他植物如烟草或番茄中R基因的过度表达可以引起花色素苷的生产。所以，我们可以利用Cre/lox系统和选择性地利用诱导物，利用模板如叶产生表达花色素苷的特异模式。
尽管在本申请中已经参考本发明的优选的实施方案公开了本发明，可以理解本公开物是用于解释而不是限制，因为不脱离本发明的精神和附加的权利要求的范围，本领域的技术人员可以进行修改。
参考文献
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Claims (73)

1.一种载体，其含有编码转录因子的第一个基因，可诱导的第二个基因，组成性启动子，第三个基因和位于终止子侧翼的两个重组位点。
2.权利要求1所述的载体，其中所述的转录因子与诱导物一起诱导所述的第二个基因的表达。
3.权利要求1所述的载体，其中第二个基因编码在所述的两个重组位点裂解的重组酶。
4.权利要求1所述的载体，其中当所述的第二个基因受到诱导时，它的基因产物切除所述的终止子。
5.权利要求1所述的载体，其中在切除所述的终止子时，所述第三个基因在所述的组成性启动子的控制下。
6.权利要求1所述的载体，其中所述的转录因子是糖皮质激素受体。
7.权利要求1所述的载体，其中所述的第二个基因编码CRE，FLP，GIN或R。
8.权利要求1所述的载体，其中所述的重组位点是lox，FRT，gix或RS。
9.权利要求1所述的载体，其中所述的第三个基因编码LEAFY。
10.权利要求1所述的载体，其中所述的第二个基因编码包含用于定向于叶绿体的N末端转运肽的蛋白质。
11.一种载体，其含有诱导型启动子，在所述的诱导型启动子控制下的第一个基因，组成性启动子，位于终止子侧翼的两个重组位点，和第二个基因。
12.权利要求11所述的载体，其中所述的诱导型启动子选自包括热休克启动子，光诱导型启动子，铜诱导型启动子，四环素诱导型启动子，乙醇诱导型启动子，蜕皮激素诱导型启动子和糖皮质激素诱导型启动子的组。
13.权利要求11的载体，其中所述的第一个基因编码在所述的两个重组位点裂解的重组酶。
14.权利要求11所述的载体，其中当所述的第一个基因受到诱导时，它的基因产物切除所述的终止子。
15.权利要求11所述的载体，其中在所述的终止子被切除时，所述的第二个基因在所述的组成性启动子的控制下。
16.权利要求11所述的载体，其中所述的第一个基因编码CRE，FLP，GIN或R。
17.权利要求11所述的载体，其中所述的重组位点是lox，FRT，gix或RS。
18.权利要求11所述的载体，其中所述的第二个基因编码LEAFY。
19.权利要求11所述的载体，其中所述的第一个基因编码含有用于定向于叶绿体的N末端转运肽的蛋白质。
20.一种载体，其含有编码转录因子的第一个基因，可诱导的第二个基因，组成性启动子，第三个基因，和侧接所述的第三个基因的两个重组位点。
21.权利要求20所述的载体，其中所述的转录因子和诱导物一起诱导所述的第二个基因的表达。
22.利要求20所述的载体，其中所述的第二个基因编码在所述的两个重组位点裂解的重组酶。
23.权利要求20所述的载体，其中当所述的第二个基因得到诱导时，它的基因产物引起所述的第三个基因的倒置。
24.权利要求20所述的载体，其中在所述的第三个基因倒置时，所述的第三个基因是在所述的组成性启动子的控制下。
25.权利要求20所述的载体，其中所述的转录因子是糖皮质激素受体。
26.权利要求20所述的载体，其中所述的第二个基因编码CRE，FLP，GIN或R。
27.权利要求20所述的载体，其中所述的重组位点是lox，FRT，gix或RS。
28.权利要求20所述的载体，其中所述的第三个基因编码LEAFY。
29.权利要求20所述的载体，其中所述的第二个基因编码含有用于定向于叶绿体的N末端转运肽的蛋白质。
30.一种载体，其含有诱导型启动子，在所述的诱导型启动子控制下的第一个基因，一个组成性启动子，侧接第二个基因的两个重组位点。
31.权利要求30所述的载体，其中所述的诱导型启动子选自包括热休克启动子，光诱导型启动子，铜诱导型启动子，四环素诱导型启动子，乙醇诱导型启动子，和蜕皮激素诱导型启动子和糖皮质激素诱导型启动子的组。
32.权利要求30所述的载体，其中所述的第一个基因编码在所述的两个重组位点裂解的重组酶。
33.权利要求30所述的载体，其中当所述的第一个基因得到诱导时，它的基因产物引起所述的第二个基因的倒置。
34.权利要求30所述的载体，其中在所述的第二个基因倒置时，所述的第二个基因在所述的组成性启动子的控制下。
35.权利要求30所述的载体，其中所述的第一个基因编码CRE，FLP，GIN或R。
36.权利要求30所述的载体，其中所述的重组位点是lox，FRT，gix或RS。
37.权利要求30所述的载体，其中所述的第二个基因编码LEAFY。
38.权利要求30所述的载体，其中所述的第一个基因编码含有用于定向于叶绿体的N末端转移肽的蛋白质。
39.一种载体，其含有感兴趣的基因，编码转录因子的基因，标记基因，编码重组酶的可诱导基因和两个重组位点，其中所述的重组位点位于所述的编码转录因子的基因，所述的标记基因和所述的可诱导基因的侧翼。
40.权利要求39所述的载体，其中所述的转录因子和诱导物一起诱导所述的可诱导基因的表达。
41.权利要求39所述的载体，其中所述的重组酶引起所述的编码转录因子的基因、所述的标记基因和所述的可诱导基因的删除。
42.权利要求39所述的载体，其中所述的转录因子是糖皮质激素受体。
43.权利要求39所述的载体，其中所述的可诱导基因编码CRE，FLP，GIN或R。
44.权利要求39所述的载体，其中所述的重组位点是lox，FRT，gix或RS。
45.权利要求44所述的载体，其中所述的lox位点是突变的，并且对CRE的亲和力比野生型lox低。
46.利要求39所述的载体，其中所述的标记基因是在强启动子的控制下的，所述的可诱导基因是在弱启动子的控制下的，其中所述的强启动子被低浓度的诱导物诱导，所述的弱启动子被高浓度的所述诱导物诱导。
47.权利要求39所述的载体，其中所述的重组酶含有用于定向于叶绿体的N末端转运肽。
48.一种载体，含有感兴趣的基因，标记基因，编码重组酶的可诱导基因，两个重组位点，其中所述的重组位点位于标记基因和所述的可诱导基因的侧翼。
49.权利要求48所述的载体，其中所述的重组酶导致所述的标记基因和所述的可诱导基因的删除。
50.权利要求48所述的载体，其中所述的可诱导基因编码CRE，FLP，GIN或R。
51.权利要求48所述的载体，其中所述的重组位点是lox，FRT，gix或RS。
52.权利要求51所述的载体，其中所述的lox位点是突变的并且其对于CRE的亲和力比野生型lox低。
53.权利要求48所述的载体，其中所述的标记基因是在强启动子的控制下的，所述的可诱导基因是在弱启动子的控制下的，其中所述的强启动子被低浓度的诱导物诱导，所述的弱启动子被高浓度的所述诱导物诱导。
54.权利要求48所述的载体，其中所述的重组酶含有用于定向于叶绿体的N末端转移肽。
55.在特定时间，在转基因植物或植物细胞中表达基因的方法，包括如下步骤：
a)用权利要求1所述的载体转染所述的植物或植物细胞；和
b)加入诱导物诱导所述的载体的所述的第二个基因，
其中所述载体的所述的第二个基因表达能从所述的载体切除所述的终止子的产物，从而使所述载体的所述第三个基因置于所述载体的所述组成性启动子的控制下，导致在加入所述的诱导物后表达所述的第三个基因。
56.在特定的时间，在转基因植物或植物细胞中表达基因的方法，包括如下步骤：
a)用权利要求11的载体转染所述的植物或植物细胞；和
b)加入诱导物诱导所述载体的所述第一个基因，
其中所述载体的所述第一个基因表达能从所述的载体切除所述的终止子的产物，从而使所述载体的所述第二个基因置于所述载体的所述组成性启动子的控制下，导致在加入所述的诱导物后表达所述的第二个基因。
57.在特定的时间，在转基因植物或植物细胞中表达基因的方法，包括如下步骤：
a)用权利要求20的载体转染所述的植物或植物细胞；和
b)加入诱导物诱导所述的载体的所述的第二个基因，
其中所述载体的所述第二个基因表达导致所述载体的所述第三个基因倒置的产物，从而使所述的第三个基因置于所述载体的所述组成性启动子的控制下，导致在加入所述的诱导物后表达所述的第三个基因。
58.在特定时间在转基因植物或植物细胞中表达基因的方法，包括如下步骤：
a)用权利要求30所述的载体转染所述的植物或植物细胞；和
b)加入诱导物诱导所述载体的所述的第一个基因，
其中所述的第一个基因表达导致所述载体的所述第二个基因倒置的产物，从而将所述的第二个基因置于所述载体的所述组成性启动子的控制下，导致在加入所述的诱导物后表达所述的第二个基因。
59.从转基因植物或植物细胞的基因组中切除标记基因的方法，包括如下步骤：
a)用权利要求39所述的载体转染植物或植物细胞，形成所述的转基因植物或植物细胞；和
b)加入诱导物诱导所述的可诱导基因，
其中所述的可诱导基因产生从所述的基因组除去所述的标记基因的重组酶。
60.权利要求59所述的方法，其中所述的转基因植物或植物细胞是在加入诱导物之前选择的。
61.从转基因植物或植物细胞切除标记的方法，包括步骤：
a)用权利要求48所述的载体转染植物或植物细胞，形成所述的转基因植物或植物细胞；和
b)加入诱导物诱导所述的可诱导基因，
其中所述的可诱导基因产生从所述的基因组除去所述的标记基因的重组酶。
62.权利要求61所述的方法，其中所述的转基因植物或植物细胞是在加入诱导物之前选择的。
63.制备具有一设计，一个字(word)或多个字的转基因植物的方法，其中所述的方法包括如下步骤：
a)制备含有载体的转基因植物，载体含有在化学诱导型启动子控制下的编码重组酶以及在所述重组酶在所述的载体内裂解之前是沉默的调节因子R的核酸，和
b)将诱导所述的化学诱导型启动子的化学物以所希望的设计，一个字或多个字的模式放置在转基因植物上；
从而所述的植物将以化学诱导型启动子放置于所述的转基因植物上的模式产生花色素苷。
64.权利要求63所述的方法，其中所述的转基因植物含有权利要求1所述的载体，其中所述的第三个基因编码调节因子R。
65.权利要求63所述的方法，其中所述的转基因植物含有权利要求11所述的载体，其中所述的第二个基因编码调节因子R。
66.权利要求63所述的方法，其中所述的转基因植物含有权利要求39所述的载体，其中所述的感兴趣的基因编码调节因子R。
67.权利要求63所述的方法，其中所述的转基因植物含有权利要求48所述的载体，其中所述的感兴趣的基因编码调节因子R。
68.含有权利要求1所述的载体的植物或植物细胞。
69.含有权利要求11所述的载体的植物或植物细胞。
70.含有权利要求20所述的载体的植物或植物细胞。
71.含有权利要求30所述的载体的植物或植物细胞。
72.含有权利要求39所述的载体的植物或植物细胞。
73.含有权利要求48所述的载体的植物或植物细胞。
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