CN110468136B - 一种花特异性启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花特异性启动子及其应用。本发明所提供的启动子为如下任一：a)SEQ ID No.4所示的DNA分子；b)与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。本发明通过正反两项融合两个MdAG基因的第二内含子与最小35S启动子建立四个载体，通过实验证明SEQ ID No.4所示的rMdAG2I启动子在烟草和苹果属中的花特异性。本发明的结果表明rMdAG2I启动子在苹果属植物花性状的遗传改良中拥有巨大前景。

Description

一种花特异性启动子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种花特异性启动子及其应用。

背景技术

苹果属植物包含30多个种，具有广泛的观赏和使用价值。隶属于苹果属的海棠，因其花特性的多样例如花色、大小和香气的不同而被广泛应用在园林景观中。苹果通常自花不育，需要通过蜜蜂等昆虫进行杂交，这一点在种植苹果的果实生产中很重要。在授粉过程中，花对于吸引昆虫起了很大作用。因此，苹果属植物的花器官在观赏和授粉方面都发挥着重要的作用。

转基因技术已应用于一系列花卉性状的遗传改良，如花色、品质和抗逆性的提升。但是，许多用于改良花性状的基因的组成型表达会对营养器官造成额外的影响。例如，细胞分裂素可调节花的大小，但细胞分裂素的组成型表达也会影响植物营养生长。花特异性启动子能够在不影响营养器官的情况下，对花性状进行转基因改良，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种花特异性启动子及其应用。

第一方面，本发明要求保护一种具有启动子功能的DNA分子。

本发明要求保护的具有启动子功能的DNA分子具体可为如下任一：

a)SEQ ID No.4所示的DNA分子；

b)与a)限定的核苷酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子；

c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第二方面，本发明要求保护含有前文第一方面所述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌。

进一步地，所述重组载体可为重组表达载体或重组克隆载体。

进一步地，所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子、由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因(如GUS基因)与所述转录终止序列(如tNOS)连接。

第三方面，本发明要求保护前文第一方面所述DNA分子在启动目的基因表达中的应用。

进一步地，所述启动目的基因表达为在植物中启动目的基因(如GUS基因)表达。

更进一步地，所述表达为花特异性表达。

第四方面，本发明要求保护SEQ ID No.2所示DNA片段在使SEQ ID No.3所示的最小35S启动子在植物中具有花特异性表达活性中的应用。

在所述应用中，SEQ ID No.2所示DNA片段的反向互补序列连接于SEQ ID No.3所示的最小35S启动子的5’端，即连接后序列为SEQ ID No.4。

在上述各方面中，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。

在本发明的具体实施方式中，所述双子叶植物为苹果属植物(如海棠或苹果)或烟草(如本生烟)。

更进一步地，所述苹果属植物为西府海棠或金冠苹果；

更加具体地，当所述植物为西府海棠时，所述应用中是采用抽真空渗入转化的方法将含有所述DNA分子(启动子)的重组载体瞬时转化到所述植物中的，瞬时转化是的真空压力为-80kPa，对应处理时间为1.5分钟。

更加具体地，当所述植物为金冠苹果时，所述应用中是采用基因枪转化的方法将含有所述DNA分子(启动子)的重组载体瞬时转化到所述植物中的。

本发明克隆了两种AG基因的第二内含子，进一步将两个第二内含子分别与minimal 35S启动子正向和反向融合，创造出了四个人工启动子，分别命名为fMdAG1I，rMdAG1I，fMdAG2I和rMdAG2I。在烟草中，发现只有rMdAG2I(SEQ ID No.4)展现出花特异性表达，然而其他三个启动子均在营养器官中能够检测到活性。本发明也应用农杆菌介导的瞬时转化方法，在苹果属观赏品种西府海棠中研究了四个启动子的活性。结果跟烟草类似，只有rMdAG2I展现出了花特异性。最后，本发明应用基因枪的方法证实了rMdAG2I在苹果品种金冠也具有花特异性。来源于苹果属的花特异性启动子rMdAG2I，对于改良观赏植物(尤其是那些属于苹果属内的品种)的花性状具有重大的潜力。

附图说明

图1为烟草和苹果遗传转化的基因载体。35S:花椰菜花叶病毒35S基因的启动子序列。GUS:编码Beta葡萄糖醛酸酶基因的序列。tNos：胭脂碱合成酶终止子。fMdAG1I：苹果属MdAG1基因第二内含子的正向版本。rMdAG1I：苹果属MdAG1基因第二内含子的反向版本。fMdAG2I：苹果属MdAG2基因第二内含子的正向版本。rMdAG2I：苹果属MdAG 2基因第二内含子的反向版本。Min35S：35S基因启动子序列末端60个碱基。

图2为四个载体在转基因烟草中的GUS染色结果。A-C为35S::GUS载体作为阳性对照的GUS表达。所有器官均被染成蓝色。D为空载作为阴性对照的GUS表达。整个植株均没有染成蓝色。E为fMdAG1I::GUS载体在转基因烟草组织中的GUS表达。F为rMdAG1I::GUS载体在转基因烟草组织中的GUS表达。G为fMdAG2I::GUS载体在转基因烟草组织中的GUS表达。花，叶片和茎端都呈现出不同程度的蓝色。H-I为rMdAG2I::GUS转基因烟草只有花被染成蓝色的两种类型。

图3为西府海棠瞬时转化GUS染色结果。A为35S::GUS转化的花(阳性对照)，茎段和花被染成蓝色。B为没有染成蓝色的非转化的花(阴性对照)。C-D为fMdAG2I::GUS与rMdAG2I::GUS转化的花被染成蓝色。

图4为rMdAG2I::GUS通过基因枪法转化金冠的GUS染色。A为被染成蓝色的花器官。RE：花托；SE:花萼；PE：花瓣；ST：雄蕊；PI：雌蕊。B为没有被染成蓝色的茎段。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、花特异性启动子的获得

一、MdAG基因第二内含子的克隆

用CTAB方法提取金冠苹果叶片的DNA。接近200ng/μl的DNA作为模板用于扩增两个MdAG基因的第二内含子。

MdAG1基因的第二内含子用正向引物F1和反应引物R1来扩增，条件为：95℃5min，接下来35个循环的94℃30s，58℃30s，72℃4min，最后在72℃下延伸7min。

F1：5’-CGCCTCTATGAGTATGCCAAC-3’；

R1：5’-CTTCTTGTACCTCTCAATTGTTCCT-3’。

MdAG2基因的第二内含子用正向引物F2和反向引物R2来扩增，条件为：95℃5min，接下来35个循环的94℃30s，58℃30s，72℃4min，最后在72℃下延伸7min。

F2：5’-GAGTATGCCAACAACAGGTAAT-3’；

R2：5’-TGCTTTAACACTGCACATATGG-3’。

扩增的片段被插入到pEASY-Blunt克隆载体上，10-12个克隆子被测序，以便确认序列的准确性。

结果显示：MdAG1基因的第二内含子序列如SEQ ID No.1所示；MdAG2基因的第二内含子序列如SEQ ID No.2所示。

二、四个人工启动子的获得

通过正向和反向的方式分别融合MdAG1基因的第二内含子(SEQ ID No.1)或MdAG2基因的第二内含子(SEQ ID No.2)序列与60bp的最小35S启动子序列(SEQ ID No.3)，我们构建了四个复合启动子，分别命名为fMdAG1I，rMdAG1I，fMdAG2I和rMdAG2I。

fMdAG1I启动子：自5’端到3’端序列组成为SEQ ID No.1+SEQ ID No.3；

rMdAG1I启动子：自5’端到3’端序列组成为SEQ ID No.1的反向互补序列+SEQ IDNo.3；

fMdAG2I启动子：自5’端到3’端序列组成为SEQ ID No.2+SEQ ID No.3；

rMdAG2I启动子：自5’端到3’端序列组成为SEQ ID No.2的反向互补序列+SEQ IDNo.3，即rMdAG2I启动子的序列为SEQ ID No.4。

实施例2、花特异性启动子的功能鉴定

一、重组载体的构建

将实施例1获得的四个人工启动子利用infusion无缝克隆的方法插入pBin19载体GUS上游分别创造四个重组载体：fMdAG1::GUS、rMdAG1::GUS、fMdAG2::GUS与rMdAG2::GUS(图1)。

另外，也选用了一个组成型35S启动子驱动GUS基因的载体作为对照(记作35::GUS)(记载于“Li,Wei,et al.An AGAMOUS intron-driven cytotoxin leads toflowerless tobacco and produces no detrimental effects on vegetative growthof either tobacco or poplar.Plant Biotechnology Journal 14.12(2016):2276-2287.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)。

二、烟草中rMdAG2I::GUS的花特异性表达

1、烟草的稳定转化

将步骤一构建的四个重组载体和一个对照载体分别导入到农杆菌EHA105中，然后被用于烟草(Nicotiana benthamiana)的遗传转化。烟草的叶盘(0.5cm×0.5cm)在农杆菌(OD₆₀₀＝0.6)中接种20min，然后被移到不加任何激素和抗生素的MS培养基中共培养两天。两天之后，叶盘被转移到含有3mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、300mg/L头孢与50mg/L卡那的再生培养基中。推定的抗性芽被转移到含有300mg/L头孢和20mg/L卡那的生根培养基中，生根的烟草被转移到温室的土壤中。

2、GUS染色试验

叶盘、茎段和花芽在37℃下，被培养在X-gluc溶液(配方：10mM EDTA，100mMNaH₂PO₄H₂O，0.5mM K₄Fe(CN)₆₃H₂₀，0.1％Triton X-100和1mM X-gluc)中。24h以后，样本用酒精脱色3-5次后随即进行拍照。

3、结果

分别获得了28个fMdAG1I::GUS株系，23个rMdAG1I::GUS株系，31个fMdAG2I::GUS株系和20个rMdAG2I::GUS株系。同时获得了8个35::GUS的转基因烟草株系作为对照。使用组织化学染色法，测定转基因烟草植株和非转基因对照植株的叶、茎、花组织中GUS活性。在8个35::GUS的株系中，所有组织均表现出了GUS的活性(图2中A、B、C；表1)，然而在非转基因植株中没有组织表现出GUS活性(图2中D)。在MdAG1基因的第二含子序列的正反向启动子载体中，GUS染色活性与35S::GUS表现一致。然而，fMdAG1I::GUS相较于rMdAG1I::GUS表现出了很强的GUS活性，说明内含子的方向可能会影响启动子的活性(图2中的E、F)。MdAG2基因的第二含子序列的正向启动子在营养器官和花器官上均表现出了GUS活性(图2中的G)，然而，反向启动子的GUS活性仅在花器官中表达，而在营养器官中无法检测(图2中的H、I)，说明rMdAG2I在苹果属植物中有启动目的基因花特异性表达的潜力。两种正反向内含子不同的表达模式，说明了它们的启动子活性受方向影响。方向的改变可能影响顺式作用元件与转录起始位点距离的改变，因此引起不同的表达模式。

有趣的是，rMdAG2I::GUS的株系在花器官中表现出两种表达模式(表1)。在20个株系中，11个株系(类型I)在全部花器官中表现出GUS活性(萼片、花瓣、雄蕊和心皮)，然而，9个株系(类型II)仅在雄蕊和心皮中表现GUS活性。这两种表达类型可能是由于不同株系中，拷贝数和转基因插入位点不同导致的。这两种表达模式均可使用在实际生产中，例如，当需要将启动子与毒性基因融合产生无花植株时，我们可以应用类型I花特异性启动子，在所有花器官中表达。然而，如果想要获得拥有正常花瓣但不育的观赏植株，可以使用类型II启动子。

表1各重组载体转基因烟草花特异性表达特征

注：“+”：被探测到具有GUS活性的组织；“-”：被探测到没有GUS活性的组织。

三、西府海棠中rMdAG2I::GUS的花特异性表达

1、农杆菌介导的苹果花瞬时转化条件的优化

本发明进一步在苹果植物中检测四种启动子的活性。在大多数苹果属植物中，农杆菌介导的稳定转化方法已经被建立，但本发明应用农杆菌介导的瞬时转化方法来检测四种启动子活性。瞬时转化的方法相较于稳定转化有一些优点(如更加简便、快捷)。在拟南芥和本氏烟草中，农杆菌介导的瞬时转化常用于基因功能的亚细胞定位。在苹果属植物尤其是苹果中，农杆菌介导的瞬时转化方法已广泛应用在改良果实性状中，因为苹果童期较长，农杆菌介导的瞬时转化可快速验证与果实性状相关的基因功能。虽然农杆菌介导的瞬时转化系统已经在苹果属植物的果实中广泛建立，但在不同物种中效果不同。因此，本发明首先对农杆菌介导的花瞬时转化系统进行了优化。

向寄主细胞中导入T-DNA片段的效率是影响农杆菌瞬时转化的重要因素。据报道，真空渗透法可以增强农杆菌细胞对目标植物组织的渗透能力，因此能有效地提高拟南芥、棉花和小麦等植物的农杆菌侵染效率。本发明将真空渗透法和农杆菌瞬时转化系统相结合，通过用35S::GUS载体，对代表性观赏苹果——西府海棠进行转化。由于细胞壁厚度和细胞间隙的不同，不同的植物材料对真空压力的耐受程度不一致：短时间的真空渗透不能达到预期效果，而长时间的真空渗透会伤害植物组织。为了获得适合花组织的真空压力，设计了抽真空时间的梯度：2分钟、3分钟和4分钟，分别对应-70kPa，-80kPa，-85kPa。另外，真空压力的处理时间也会影响瞬时转化。因此，对同一样品在同一真空压力下进行四个时间的处理：1.0分钟，1.5分钟，2.0分钟，3.0分钟。

具体操作：将含有四个启动子质粒的农杆菌EHA105活化到OD＝1.0，西府海棠的花浸泡在农杆菌悬浮液中，然后被放到抽真空的泵中。如上3个抽真空时间和4个浸泡时间，共计12个处理用于此正交试验中。处理以后，样本被培养在MS培养基中2天，之后进行GUS染色(见步骤二2)。

结果如表2所示，随着真空压力的增加，花的损伤越来越重，85kPa会对花造成非常严重的伤害。同样地，较低的真空压力下(-70kPa)，处理时间加长可以提高染色效率。然而，当真空压力相对较高(-80kPa)时，延长处理时间会损伤组织。通过比较，我们发现-80kPa的真空压力和1.5分钟的处理时间是后续试验的理想条件。利用改良的实验条件，同样可以在茎中检测到35S::GUS的活性，这说明除了在花器官中，该方法也可以应用到茎段中。

表2农杆菌介导的瞬时转化系统针对苹果属植物的条件优化

真空时长(min)	浸泡时长(min)	花处理结果
			2.0	1.0	无损伤，无GUS活性
2.0	1.5	无损伤，有GUS活性
			2.0	2.0	无损伤，有GUS活性
2.0	3.0	无损伤，有GUS活性
			3.0	1.0	无损伤，无GUS活性
3.0	1.5	无损伤，有GUS活性
			3.0	2.0	伴有轻微损伤
3.0	3.0	损伤
			4.0	1.0	损伤
4.0	1.5	损伤
			4.0	2.0	损伤
4.0	3.0	损伤

2、西府海棠中rMdAG2I::GUS花特异性的表达

利用步骤1所获得的农杆菌瞬时表达体系的最佳实验条件，以西府海棠为试材，验证四种载体的花特异性(GUS染色步骤见步骤二2)。结果显示，图3中A为35S::GUS转化的花(阳性对照)，茎段和花被染成蓝色；图3中B为没有染成蓝色的非转化的花(阴性对照)。当转化fMdAG1I::GUS时，发现可以在营养器官(茎)和花器官(萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊)中同时检测到GUS活性，这与在烟草中的结果一致。在转入rMdAG1I::GUS载体的花中，同样在茎中检测到了GUS活性，但是，我们未在萼片、花瓣和雌蕊中检测到(表3)。基于烟草转化的结果，fMdAG1I::GUS比rMdAG1I::GUS的活性更高一些。因此，一些花器官中未检测出rMdAG1I::GUS的活性，可能是整体活性较低导致的。对于fMdAG2I::GUS来说，茎和花器官中都有其表达活性，这与fMdAG1I::GUS表达模式一致(图3中C和表3)。在茎中都能检测到这三种载体的GUS活性，因此它们均不能在苹果属植物中用作花特异性启动子。有趣的是，本发明同样在花托中检测到了fMdAG1I::GUS，fMdAG2I::GUS和rMdAG2I::GUS的活性(表3)，rMdAG1I::GUS未表现出GUS活性可能由于整体表达量较低所致。对于rMdAG2I::GUS载体，在茎中未检测到GUS活性，同时，在所有花器官(萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊)中检测到了GUS活性(图3中D和表3)。因此，rMdAG2I::GUS很有可能在苹果属植物中具有花特异性。

表3各重组载体在西府海棠上的表达特征

茎

萼片

花瓣

雄蕊

雌蕊

花托

35S::GUS

+

+

+

+

+

+

fMdAG1I::GUS

+

+

+

+

+

+

rMdAG1I::GUS

+

-

-

+

-

-

fMdAG2I::GUS

+

+

+

+

+

+

rMdAG2I::GUS

-

+

+

+

+

+

注：“+”：具有GUS活性的组织；“-”：没有GUS活性的组织。

四、金冠苹果中rMdAG2I::GUS的花特异性表达

本发明进一步在苹果品种“金冠”中利用步骤三改良的瞬时转化方法，但不幸的是，发现并不适用，这说明农杆菌瞬时转化法的效果与品种和材料非常相关。当更换新材料时，需要进一步改良方法。基因枪介导的农杆菌转化是瞬时转化的另一种方法，虽然成本较高，但有显著的优点，比如它不受品种和样品类型的限制。因此，本发明尝试用基因枪的方法检测rMdAG2I::GUS在“金冠”中的花特异性活性，并以35S::GUS作为对照。

操作如下：为了准备金粉悬浮液，金粉和酒精的混合物(60mg:1ml)被震荡1分钟，然后10000转/分离心10S，随即被悬浮到无菌水中。每一枪使用10μl的金粉-DNA复合体悬浮液。每个样本进行六次重复。在GUS染色之前样本于MS培养基中培养两天。

结果：对于35S::GUS来说，可以在营养器官(叶和茎)和花器官(萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊和花托)中检测到GUS活性(表4)。然而，在rMdAG2I::GUS的株系中，茎和叶片中没有检测到GUS表达，相反，在所有的花器官中都可以检测到GUS活性(图4和表4)。这些结果进一步证明了rMdAG2I::GUS在苹果属中的花特异性。

表4 rMdAG2I在金冠苹果上的活性特征

注：“+”：有GUS活性的组织；“-”：没有GUS活性的组织。

综上，本发明通过正反两项融合这两个MdAG基因的第二内含子与最小35S启动子建立四个载体。接下来，通过烟草稳定转化的方法验证了rMdAG2I启动子的花特异性，并进一步通过农杆菌介导的瞬时转化和基因枪介导的瞬时转化在苹果属中验证了其花特异性。本发明的结果表明rMdAG2I启动子在苹果属植物花性状的遗传改良中拥有巨大前景。

<110> 中国农业大学

<120> 一种花特异性启动子及其应用

<130> GNCLN191889

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4239

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gtaatattat tgcttcaatt tacttgctaa attttcctct tcttgttctt cgtttaattt 60

tttaatgaaa gaattttaga aaatatttca gacccaagtt ttgttcattt taaatttacc 120

ttttaataca agttctttgt tcttgttaaa gttcttttct ttttctttct tcttttgtgc 180

aaattttggt cacaaattta gcatttcaaa aagttattgg tgtttcagtc ctcaagattt 240

tttgctgtga gatagatctt taagtggata taatcaggaa gaacataatc attgttatgg 300

tactcagttg agttgaaatt gagttctctc tctctctctc ccccctctcg ttctctctat 360

ctctctatat aacttataag attcactttc ttgtgttttg ttttttttcc tcgtatgtgc 420

ttttgttggg catttttttt ttaaatttaa tttttctttt ctgtttatga tcattttctt 480

agctcttggt ttggtggaaa catagatctg gtgtaataga tagaaaaaag tagtggtttt 540

tgggaatgta tgcaggcttc tgagatcagc tccttaccct ccctccctcc attgctgtta 600

attttctgtt cccctttctc tgttttattt ctctctctct ctctctctct ctacatgact 660

ctctttgtca tctatgaagc taagcaggct tttaacacac aagctgtcat ccccccatta 720

gccaagcccc ccatctcttt gacacttcct taatagcacg tcagttgtag acatcacgaa 780

cgtaaagtac aattttaata taaaaaaaaa gaattaaata aatgtattga caggacctct 840

ctgcaaaata agcacaaatt agggtttcaa gacacccaaa tgtgttttgc ttgaaatatg 900

aaacaaactt ccctgtagat ccatatctgg ctacaaccac caaaacccag aagctaaaat 960

tccccaaatc tcaatttcac cacgtggaat ttcccacaga aaattaaaaa ccctaatttc 1020

ccagattagg gttcataagg aacaacattg ggtaatcaat ttgtccaaag atttgtgttg 1080

ggtaaacctt atcgagtaaa ggagacattt ttttccacag ccaatcaaaa cccaagtgtc 1140

aaaatgtcaa ctttttcctt aaatttaaca ttttttggga atgggatgtg gtctagttag 1200

ggttaagttc tgggtttttt tggtttcgtt ttttctactt tgtctttggt taatagaatc 1260

tttggtcacg tcacaaaaga ttttttggtt cttgacttct gacaaaaggc gtttatatca 1320

tgattcctac attgtcttct cttccccttt tcccagttct tcaatcctaa atttttaacc 1380

ttgccggtta attttttcta cttggattgg gtctcacaaa gtaatttctt tcataattta 1440

tttttccaaa ttattaggga gggatattct gtgtgtgtga gatcatagct caactgggtc 1500

atcaaaatta tggcatcata gaatggttat tgcatttgcg gaagatcttg catatagata 1560

tatttatgca agttttctat ggtgttcgag agatacagtg aaacagaaac aacgtacgac 1620

aagtgcgagc caatgggaaa cgtctgagcg tttggcttat atgtcagctg ccttctctgt 1680

tgctgaaaac agacggcttt gatgttctca tcagagtttc agtctttcag acagaaaaaa 1740

aaaaaaaaaa caataataat aataattttt gagggtgttt ctatccacaa aaaacatatc 1800

tttcaaattt ttaccgtcga attaaaagaa ttgaagaaaa ttaaaaatag aaaaatagga 1860

tgtgtgatgt aaaaaaaggg ggtgtggtgt aaaaatatac aaagtactcg aggtgggtaa 1920

aatggtaaac tccgggtaat atcccttgtg taatgattgc aataggtacg gcccttaatc 1980

tagttgaacc aatcatattg gggagttgtg ccacggtggc acggggagcc aatcacaagc 2040

tcgacgattt taaggaatca gtatgcatag gaaaacgtga gtctttattt tttaagaaat 2100

gaatgatctt ttttatttat ttgtataatt atgatattga tatatggttt tgtattcaca 2160

tccgttagtt gagagactga ttgaaatagg tcagcaggtc taactcagaa aaccgagttt 2220

tctttttggt gtcaaggaac tgagatttga tttcgtaggc tttgttaact gaaagagttt 2280

gttcatttga ccgttagtaa ttgccttata attcaaattt agtcataaaa tctcagatta 2340

agtcagtagg attagccctt aatggtatgt gatagcatgt gtgcctaagg aaatgaatag 2400

aactaggcag aaaggctaga gcttggggaa agaaattcaa attttagcac aggcagaatc 2460

tgactcagaa attctgctga ggataagcag gcattttgca gaaattctgc tgtggttggg 2520

aactcccttt acatgttgtg ttcttctgta aattgacatg aacatcagca gttttatatc 2580

taattaaccc aagcgtttat atcaagttaa ttaaaaagga actttaacga aaagttttcg 2640

gtactgttca ttttaacgaa aaatcacatt tttacactaa aaagttaatc ctgatactat 2700

tcactttacc ctttattttg tctttatcgt taaaactcaa agtttttaaa cattttttca 2760

ttagtttttc ttaattaaaa tgcactaata ttcatgctca ttaattttgt agaaactatt 2820

tgtgaagaga gctccactta taattgcaag caccatgcca agagatgaca agagaaccca 2880

attagaactg ttggttaaac tgagattgga acccctacat gtataaaatg cttcattact 2940

ttggatcaga gaagctagta attaattttc ttttgtatag ttatccccaa gatgttaatt 3000

agttgagaaa aatattcaaa ggggtaaagg gaaaatttga atttgaaaaa aaaaaatgta 3060

aagcattcca ttacttcaag caagttacta cttgtttttt aatttattat tattaacggg 3120

aggggaaaga gttcgaaact attataaaaa tgtagagaga gagaatttcg aacccgagat 3180

gcacaagtag aagaaaccca atacattatt cactacaata ttaaaccaca tgcaacgact 3240

tactacctaa ggcaacagaa aatggtagca tctcattatt cctaaccttt tgctttcttt 3300

tgccaatata agaggggttt ccaatttgag acctctttat catgactaca gaaccagttg 3360

gtagttccac tacaaaccat gttcttgaag tttaccatct tatctcccta gctagatgcc 3420

ttaagataaa ggttgattaa ttaatatctt gttctttagt ttcacagttt ttttagggta 3480

gaaaatgttt aggaacttgt ttcatacctg ttcatgtttg aaagtttgat ctgataaact 3540

agacatagaa ccaatctttt gctagctagg tagctttcct cagggtatgc ctttcatatt 3600

aactatcaca attttttaga ccgtatattt cttaagtgtc tggtgcataa gcaatgctat 3660

agtatataga tgtagcttgc ttataatttg aggatttggt acttgcatta atttatatcg 3720

gtgttttttg cttttgagca ctgtttccat acatattggt tggactatgg gtttgtttgg 3780

tgtttaagtt aaattggatt tgataactca ccatattgaa gttgtgttaa atgaagaaat 3840

gaagaatttt gtccaagttc aaggtaaaag gtggattact catgaaaaaa acttacccct 3900

ttcaatctcc tcagaataat agggttaaaa gagataatat tttcttcgcg tctaatccct 3960

tccttttttt ttggtcaaac atctaatccc cttaaaatga aaaattattt acccctctct 4020

accttcaaca tacttcaatt ttatgagttg tccaatccaa tctaatctaa tctcagtgac 4080

aaaaaagaga atgtctaaca tggggtatta atgcatgaga gtcttttctg gtagctaaaa 4140

gtgttattaa tttatcattt tagtcgaatc atcctcatat ttcagtggtc cctagatata 4200

tagattcatt tattaacact gttagtgcat acaatgcag 4239

<210> 2

<211> 4236

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gtaataatat tattgcttca attttcttgc ttaattttct cttcttattc ttttattttt 60

tctaatggaa ggcttttagt attattttca gacccaagtt ttattttcaa tttacctttt 120

aataagattt ctttgttctt gttaaagttc ttttcttttt ctttcttctt ctgtgcaaat 180

ttttgtcaca atttagcatt tcaagaagtt attggcactt cagtcctcaa gatttttgct 240

tctgtgaaat agatcttttg ctggatttaa tcaggaaaaa cattatcatt gttatggtac 300

tcagttgagt tgagattgag attgagttct ctctctctcc tctctttctc tctctttcat 360

ctctctatat aacttataag attcactcgt ctttctttct tctgttttgt ttttttccat 420

gtatgtgctt aataatgttg ggtatttttt aatttaattt ttcttttctg tttgtgatca 480

ttttcttagc tcttggtttg gtggaaacat agatctggtg taatagatag aaaaaagaag 540

catatacata tatatatatg tatgtatgta tgtatgtatt atcattagga tgtatatagc 600

aacaagtatt ggtttttggg aatgtatgca ggcttctgag atcagctcct taccctccct 660

ccattgttgt taatgttctg tttccctttc tctttctgat ttcttccata ctctctctct 720

ctctctctct ctctctcata tgctgcatga ctctatgtca atcttatgca gctaagcagg 780

cctacaacac acaacctgtc atgcccccat tagccaagcc ccccaatctg tttgacactt 840

ccttaatagc aagtcagcta tagacatcag gaaagttaaa gtacaaattt aattaaaaaa 900

taattaaata atgtattgac aggacctctg caaaataagc acaaattagg gttccaaggc 960

acccaaacgt gttttgcttg aaatatgaaa caaacttccc tgtagatcca aatctggcta 1020

caacctccaa aacccagaag ctaaaattcc ccaaatctca gtttcaccac gtggaatttc 1080

cctcagaaaa ttaaaaccct aatttcccaa attagggttc ataagaaacc acattgggta 1140

ttcaatttgt ccaaagattt gtggtgggca acccttaaat cgagtaaagg acacatattt 1200

tccacatctc aagtgtcaaa atgtcatctt ttcttaaatt tgacattttt tggaaatggg 1260

atgcggtcta gttagggtta ggttctggtt tttttgtttc ttttttttct cttttgtctt 1320

tggttgatag aatctttggt cacgtcacac gagatttttc ggttcttgac ttctgacaaa 1380

aggggtttat gtcatgattc ctacactggc ttctcttccc cttttcccag ttcttcaacc 1440

ctaaattttt aacctttctg gtcatttttt ttctacttgg atcggatctc ataaatcaat 1500

attcttttat aatttatttt tccaaattat tagagagaga gagagagaga gatcttagct 1560

caactgggtc atcaaaatta tggcatcata gaatggcatt tgcatttgca gagatcttgc 1620

gtagatatat ttatgcaagt tttaagcgtg agagatacaa gtgaaacaga agacaacgta 1680

cgacaactgc gagccaatgg gagagttctg agcgtttcgt ttggctcata tgtctgcctt 1740

ctctgctgct ggaaacagac ggctttgatg ttctcatcag agcttcagtc tttcagacag 1800

aaaagaaaaa atatcaaatc tttatgttat atttactttc acttctgtaa agtaattaaa 1860

aacatacaaa attcattaaa ctgtttgtgt tttacacgag gtgggttaaa aggtgaactc 1920

caggaaaata tcccttgtgt aatgagagtt atggcctctt atctagttga accaatcata 1980

ttggggagct gtgccaccgt ggcacaggga accaatcaca agctcgacga ttttaaggaa 2040

tcagtatgca taggaaggcg cgaggttttg tttttttatt aaattaatga tttttttttt 2100

ttaaatttaa ttgtataatt atgatattga tatatggttt tgtatcacat ccgtcagttg 2160

agagactgat tgaattaggc cagccggtct aactcagaga accgagtttt ctggtgtcaa 2220

ggaactgaga tttgcttatt aattaggctc agttaactga aagagtttgt tcatttgacc 2280

gttagtaatc gccttataat ttataaattt aaacataaga tctcagatta agtcagtaga 2340

attagccctt aatgttatgt gatagcatgt gtgcctaagg aaatgaataa agctaagcag 2400

aaaggctaga gcttggggaa agaaattcag tttatagcag acagaaatct gactcagaaa 2460

ttctgctgag gataagcatg cattttgtgt aaacaacttc aattaccatt tatatttcaa 2520

tcaatcaggt cctcttttct ctctttctcc cccttcccaa cactagaaat ttagctgtgg 2580

ttgggaaccc cttttacatg ttgttttctt ctgtaaattg acatgaactt cagcagtttt 2640

atatctaatt aaccaaagtg cttatatcta gttaattaaa atgaactaat ttttgtactc 2700

gttgttttag taactattta tgaggacatg acaagagagc ctaatagtag ttagatctat 2760

ttagttaata agttaaactg agactggaac cctacatgta caaaatgcat aatgcattac 2820

tttggatcag aaaaagactg caagtttctt ctttatattt tccccagtta attagttgag 2880

aaaaatatta aaatcaattt taattagtat tcagaaaggt aaagagaaaa aattttaatt 2940

tgaaaaagaa aatattgtaa agctttccat tacttcaagc aatttactac ttaaggcaac 3000

agaaaatggt tagatcttaa ggctccgcac cttttgtttt cttttgtaca aatagaaggg 3060

gattcaaact taagccttgg gaagaaaagt atcattagac taaggttatc cagctatgtt 3120

tggttgagga tcttctaagt cacaaaggat taattaaagc caagctagta acatatagac 3180

tacaaaatgc taggcgaagg gaattagaaa agccgtcgat gcgcatttca taggcatgta 3240

agagggtttg caattcacta cttggaaagg tacatttaca aatctctctc acacacctac 3300

atttctaatc cctctatcta acattttatg atcaattcct tagtaacttg gcctcaatcc 3360

tttgatactt gaaaatccct cactcaaata cagcgtagga agttgaggct tccactccac 3420

accatgttct taaggtttac catcttatct ccctagatgc tttaagaaaa atatctttag 3480

tttcacagtc tttttattta ggtagaaaat gattatagga acttatttca aaaaccctta 3540

tgtggaaagt ttgatcaaat aagccagata tagaaccaat cttttgctag gtagcttccc 3600

tcatggtatg cctttcatat tatgttcaaa ctatcacaat gtttcagatt atacatttct 3660

taacattaaa tgcataagca atgctatagt atatgaatgt agctttctta taaatttgag 3720

aatcatacat gcattaatta tattggtgtt tttccttttg agtactagtt ccaaagcata 3780

ttgattggac taagggttcg tttggtgttt aggattagat tggattcaat agctcaccat 3840

atttatggta tgttcaagga aaaaataaag atttgtccaa gttcaaggaa gaatgtggat 3900

tactcttgaa agaaacttat tcctttccat ctcctcaaaa tggtaggatt aaaagagata 3960

aattccttta ggtctaatat ccttaaaaat gacaatgatc acttctactt acaacatact 4020

tgcattttat gagttgtcca atccaatcta gtccaatcat atagtaacca aacaagaatg 4080

tctaatatgg gttatcaatg catgagattc ttttctggag ctagaagtgt tatccattaa 4140

tcattttagt catatgttag atcctcctta gatttcaatg gtccctacat atatagattc 4200

atatagtaat actatgagtg cataccatat gtgcag 4236

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag 60

<210> 4

<211> 4296

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ctgcacatat ggtatgcact catagtatta ctatatgaat ctatatatgt agggaccatt 60

gaaatctaag gaggatctaa catatgacta aaatgattaa tggataacac ttctagctcc 120

agaaaagaat ctcatgcatt gataacccat attagacatt cttgtttggt tactatatga 180

ttggactaga ttggattgga caactcataa aatgcaagta tgttgtaagt agaagtgatc 240

attgtcattt ttaaggatat tagacctaaa ggaatttatc tcttttaatc ctaccatttt 300

gaggagatgg aaaggaataa gtttctttca agagtaatcc acattcttcc ttgaacttgg 360

acaaatcttt attttttcct tgaacatacc ataaatatgg tgagctattg aatccaatct 420

aatcctaaac accaaacgaa cccttagtcc aatcaatatg ctttggaact agtactcaaa 480

aggaaaaaca ccaatataat taatgcatgt atgattctca aatttataag aaagctacat 540

tcatatacta tagcattgct tatgcattta atgttaagaa atgtataatc tgaaacattg 600

tgatagtttg aacataatat gaaaggcata ccatgaggga agctacctag caaaagattg 660

gttctatatc tggcttattt gatcaaactt tccacataag ggtttttgaa ataagttcct 720

ataatcattt tctacctaaa taaaaagact gtgaaactaa agatattttt cttaaagcat 780

ctagggagat aagatggtaa accttaagaa catggtgtgg agtggaagcc tcaacttcct 840

acgctgtatt tgagtgaggg attttcaagt atcaaaggat tgaggccaag ttactaagga 900

attgatcata aaatgttaga tagagggatt agaaatgtag gtgtgtgaga gagatttgta 960

aatgtacctt tccaagtagt gaattgcaaa ccctcttaca tgcctatgaa atgcgcatcg 1020

acggcttttc taattccctt cgcctagcat tttgtagtct atatgttact agcttggctt 1080

taattaatcc tttgtgactt agaagatcct caaccaaaca tagctggata accttagtct 1140

aatgatactt ttcttcccaa ggcttaagtt tgaatcccct tctatttgta caaaagaaaa 1200

caaaaggtgc ggagccttaa gatctaacca ttttctgttg ccttaagtag taaattgctt 1260

gaagtaatgg aaagctttac aatattttct ttttcaaatt aaaatttttt ctctttacct 1320

ttctgaatac taattaaaat tgattttaat atttttctca actaattaac tggggaaaat 1380

ataaagaaga aacttgcagt ctttttctga tccaaagtaa tgcattatgc attttgtaca 1440

tgtagggttc cagtctcagt ttaacttatt aactaaatag atctaactac tattaggctc 1500

tcttgtcatg tcctcataaa tagttactaa aacaacgagt acaaaaatta gttcatttta 1560

attaactaga tataagcact ttggttaatt agatataaaa ctgctgaagt tcatgtcaat 1620

ttacagaaga aaacaacatg taaaaggggt tcccaaccac agctaaattt ctagtgttgg 1680

gaagggggag aaagagagaa aagaggacct gattgattga aatataaatg gtaattgaag 1740

ttgtttacac aaaatgcatg cttatcctca gcagaatttc tgagtcagat ttctgtctgc 1800

tataaactga atttctttcc ccaagctcta gcctttctgc ttagctttat tcatttcctt 1860

aggcacacat gctatcacat aacattaagg gctaattcta ctgacttaat ctgagatctt 1920

atgtttaaat ttataaatta taaggcgatt actaacggtc aaatgaacaa actctttcag 1980

ttaactgagc ctaattaata agcaaatctc agttccttga caccagaaaa ctcggttctc 2040

tgagttagac cggctggcct aattcaatca gtctctcaac tgacggatgt gatacaaaac 2100

catatatcaa tatcataatt atacaattaa atttaaaaaa aaaaaatcat taatttaata 2160

aaaaaacaaa acctcgcgcc ttcctatgca tactgattcc ttaaaatcgt cgagcttgtg 2220

attggttccc tgtgccacgg tggcacagct ccccaatatg attggttcaa ctagataaga 2280

ggccataact ctcattacac aagggatatt ttcctggagt tcacctttta acccacctcg 2340

tgtaaaacac aaacagttta atgaattttg tatgttttta attactttac agaagtgaaa 2400

gtaaatataa cataaagatt tgatattttt tcttttctgt ctgaaagact gaagctctga 2460

tgagaacatc aaagccgtct gtttccagca gcagagaagg cagacatatg agccaaacga 2520

aacgctcaga actctcccat tggctcgcag ttgtcgtacg ttgtcttctg tttcacttgt 2580

atctctcacg cttaaaactt gcataaatat atctacgcaa gatctctgca aatgcaaatg 2640

ccattctatg atgccataat tttgatgacc cagttgagct aagatctctc tctctctctc 2700

tctctaataa tttggaaaaa taaattataa aagaatattg atttatgaga tccgatccaa 2760

gtagaaaaaa aatgaccaga aaggttaaaa atttagggtt gaagaactgg gaaaagggga 2820

agagaagcca gtgtaggaat catgacataa accccttttg tcagaagtca agaaccgaaa 2880

aatctcgtgt gacgtgacca aagattctat caaccaaaga caaaagagaa aaaaaagaaa 2940

caaaaaaacc agaacctaac cctaactaga ccgcatccca tttccaaaaa atgtcaaatt 3000

taagaaaaga tgacattttg acacttgaga tgtggaaaat atgtgtcctt tactcgattt 3060

aagggttgcc caccacaaat ctttggacaa attgaatacc caatgtggtt tcttatgaac 3120

cctaatttgg gaaattaggg ttttaatttt ctgagggaaa ttccacgtgg tgaaactgag 3180

atttggggaa ttttagcttc tgggttttgg aggttgtagc cagatttgga tctacaggga 3240

agtttgtttc atatttcaag caaaacacgt ttgggtgcct tggaacccta atttgtgctt 3300

attttgcaga ggtcctgtca atacattatt taattatttt ttaattaaat ttgtacttta 3360

actttcctga tgtctatagc tgacttgcta ttaaggaagt gtcaaacaga ttggggggct 3420

tggctaatgg gggcatgaca ggttgtgtgt tgtaggcctg cttagctgca taagattgac 3480

atagagtcat gcagcatatg agagagagag agagagagag agagagtatg gaagaaatca 3540

gaaagagaaa gggaaacaga acattaacaa caatggaggg agggtaagga gctgatctca 3600

gaagcctgca tacattccca aaaaccaata cttgttgcta tatacatcct aatgataata 3660

catacataca tacatacata tatatatatg tatatgcttc ttttttctat ctattacacc 3720

agatctatgt ttccaccaaa ccaagagcta agaaaatgat cacaaacaga aaagaaaaat 3780

taaattaaaa aatacccaac attattaagc acatacatgg aaaaaaacaa aacagaagaa 3840

agaaagacga gtgaatctta taagttatat agagagatga aagagagaga aagagaggag 3900

agagagagaa ctcaatctca atctcaactc aactgagtac cataacaatg ataatgtttt 3960

tcctgattaa atccagcaaa agatctattt cacagaagca aaaatcttga ggactgaagt 4020

gccaataact tcttgaaatg ctaaattgtg acaaaaattt gcacagaaga agaaagaaaa 4080

agaaaagaac tttaacaaga acaaagaaat cttattaaaa ggtaaattga aaataaaact 4140

tgggtctgaa aataatacta aaagccttcc attagaaaaa ataaaagaat aagaagagaa 4200

aattaagcaa gaaaattgaa gcaataatat tattacatcc cactatcctt cgcaagaccc 4260

ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagag 4296

Claims (6)

1.DNA分子，为SEQ ID No.4所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

4.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒由具有启动子功能的所述DNA分子、由所述DNA分子启动表达的目的基因，以及转录终止序列组成；所述DNA分子以功能性方式与所述目的基因连接，且所述目的基因与所述转录终止序列连接。

5.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因表达中的应用；

所述启动目的基因表达为在植物中启动目的基因表达；

所述表达为花特异性表达；

所述植物为苹果属植物或烟草。

6.SEQ ID No.2所示DNA片段在使SEQ ID No.3所示的最小35S启动子在植物中具有花特异性表达活性中的应用；

所述应用中，SEQ ID No.2所示DNA片段的反向互补序列连接于SEQ ID No.3所示的最小35S启动子的5’端，即连接后序列为SEQ ID No.4；

所述植物为苹果属植物或烟草。

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