CN115820631A - 一种来源于小麦的根特异性启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于小麦的根特异性启动子及其应用，所述根特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其可指导目的基因在植物根部特异性高表达，而在植物的其它组织不表达或低表达，该启动子在植物基因工程和遗传改良中具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物和基因工程技术领域，具体涉及一种来源于小麦TaRAX3基因的根特异性启动子及其在调控外源基因在植物根部特异性表达中的应用。
背景技术
启动子是位于基因起始密码子(ATG)上游的一段DNA序列，直接决定着基因的时空表达特征和表达水平。按作用方式和功能，启动子可分成组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子三类。在植物基因工程中，可以利用具有不同表达调控水平的启动子来驱动目的基因的表达。虽然组成型启动子能够驱动目的基因在植物的各个组织中非特异性地高水平表达，但往往会造成转基因产物的连续合成和大量的积累，打破转基因植物的原有代谢平衡，妨碍植物的正常生长，有时还会对组织产生毒性，从而得不到所预期的表型。组织特异型启动子可以使基因的表达限制在特定的发育时期或组织部位中，不仅能使目的基因的表达产物在期望的特定部位积累，而且可以避免植物体内不必要的营养浪费，减少对植物生长的副作用。因此，有效利用能够驱动目的基因在植物组织器官中定时、定点表达的组织特异型启动子，对于基因功能研究、作物性状改良具有重要的意义。
根系是植物吸收水分和养分的主要器官，利用根特异性启动子不仅可以研究植物根的生长发育和形态发生建成，而且可以改善植物根系生长和增加根际分泌物，从而提高植物的抵御逆境能力和土壤修复能力，这对于作物基础功能研究和遗传改良应用都具有重要的意义。
目前，采用分子生物学和基因工程对农作物进行遗传改良过程中能够选用的已知的驱动性高且特异性好的植物根部特异型启动子依然较少。因此，提供新的植物根特异性启动子对植物根发育研究和新品种培育均具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的植物根特异性启动子，用于指导目的基因在植物根部特异性高表达，而在植物的其它组织低表达或不表达。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：
本发明一方面提供了一种来源于小麦的根特异性启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
本发明发现、分离并鉴定了小麦根部特异性高表达TaRAX3基因上游包括转录起始位点在内的2020bp的DNA序列(即SEQ ID NO:1所示序列)，确定其可调控外源基因在植物根部特异性表达。
本发明第二方面提供了用于扩增上述根特异性启动子的引物组，该引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示。
本发明第三方面提供了一种重组表达载体，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的根特异性启动子。
本发明第四方面进一步提供了上述重组表达载体的构建方法，具体包括以下步骤：
S1、以小麦基因组DNA为模板，使用序列如SEQ ID NO:2～3所示的引物组进行PCR扩增；
S2、以S1所得PCR产物为模板，使用序列如SEQ ID NO:4～5所示的引物对进行PCR扩增，再采用Hind III和BamH I对扩增产物和质粒载体分别进行双酶切；
S3、回收PCR酶切产物和载体并用DNA连接酶连接，获得重组表达载体。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S1种PCR扩增的反应体系包括5μL2×UltraHiFidelityPCRPreMix、2μL 1μM正向引物、2μL 1μM反向引物、1μL基因组DNA，且其反应程序为94℃5min，94℃、15sec，60℃、15sec，72℃、30sec，35个循环。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中酶切的反应体系包括5μL10×CutSmartBuffer、1μLHind III-HF、1μLBamH I-HF、1μg PCR产物或质粒载体、补加ddH2O至50μL，且反应程序为37℃、1h。
进一步地，在上述技术方案中，步骤S3所述连接的反应体系为1μL10×T4ligasebuffer、1μL T4ligase、2μL PCR酶切产物、6μL载体，且反应程序为16℃、12h。
本发明第五方面提供了一种重组菌，其包含序列如SEQ ID NO:1所示的根特异性启动子，或者包含上述重组表达载体，具体可采用电击法将重组表达载体倒入载体菌中，载体菌可以为大肠杆菌或农杆菌。
本发明第六方面提供了上述根特异性启动子、重组表达载体、或者重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用，具体的，目的基因表达是在植物根中表达。
在本发明某一具体的实施例中，将融合有上述根特异性启动子和GUS基因的重组表达载体导入根癌农杆菌中，并采用农杆菌浸花法转化拟南芥，得到转基因拟南芥；对转基因拟南芥植株进行检测，可发现本发明提供的特异性启动子能够调控目的基因GUS在拟南芥的根中特异性表达。
本发明的有益效果为：提供了一种新的能够使目的基因在植物根部特异性高表达，而在其他组织中不表达的根特异性启动子，丰富了植物根部特异型启动子的选择性，对植物根部研究和新品种培育有重要意义。
附图说明
图1为TaRAX3基因在小麦不同组织中的表达水平比较图；
图2为TaRAX3基因的启动子的PCR扩增结果；
图3为重组表达载体pBI101-TaRAX3 promoter-GUS的结构示意图；
图4为转基因植株的PCR检测结果，其中，WT为野生型拟南芥植株，L1、L2、L3为三个不同的阳性转基因拟南芥株系；
图5为阳性转基因拟南芥植株的GUS染色结果，其中，A为10天的幼苗，B为开花期的根，C为开花期的茎，D为开花期的莲座叶，E为开花期的茎生叶，F为花，G为未成熟的果荚，H为成熟期的种子。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本实施例通过以下过程分析了小麦TaRAX3基因(GeneID为Traes CS5D02G415800)在小麦不同组织中的表达差异，具体为：
(1)分别取小麦品种中国春10天幼苗的根和叶，开花期的根、茎、叶和穗，以及成熟期的种子，于液氮中保存。
(2)将上述小麦各组织样品于液氮中充分研磨成细粉后，采用TRNzol Universal(TIANGEN#DP424)法提取各个样品的总RNA。
(3)以上述小麦各组织的总RNA为模板，使用
III All-in-one RTSuperMix Perfect for qPCR试剂盒(Vazyme#R333)进行反转录PCR，合成cDNA。
(4)以上述小麦各组织的cDNA为模板，使用Talent qPCR PreMix试剂盒(TIANGEN#FP209)进行实时定量PCR，检测TaRAX3基因在小麦不同组织中的相对表达量。
其中，用于检测TaRAX3基因(目的基因)的引物具体为：
正向引物为5’-GGAGGACGGACAATGACATC-3’(SEQ ID NO:6)，
反向引物为5’-TAAGCACCAGCAGCAAAGC-3’(SEQ ID NO:7)；
用于检测β-Actin基因(内参基因)引物具体为：
正向引物为5’-GGAATCCATGAGACCACCTAC-3’(SEQ ID NO:8)，
反向引物为5’-GACCCAGACAACTCGCAAC-3’(SEQ ID NO:9)。
实时定量PCR的反应体系为：10μL 2×Talent qPCR PreMix、4μL 1μM正向引物、4μL 1μM反向引物、1μL cDNA模板和1μL ddH2O。
实时定量PCR的反应程序为：95℃、5min，95℃、15sec，60℃、15s，72℃、20s，40个循环。
计算方法为：C＝2-ΔCt，ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因，将三个重复的C值的平均值作为目的基因的相对表达水平。结果如图1所示：TaRAX3基因在小麦的根中特异性高表达，而在其它组织中基本不表达。
进一步对TaRAX3基因的启动子的进行克隆，具体方法如下：
(1)取小麦品种中国春的叶片，在液氮中充分研磨成细粉，采用CTAB(Coolaber#SL2071)法提取基因组DNA。
(2)以上述小麦叶片基因组DNA为模板，使用Ultra HiFidelity PCR试剂盒(TIANGEN#KP203)进行PCR扩增TaRAX3基因的启动子；其中，用于扩增TaRAX3基因启动子的引物组具体为：
正向引物为5’-TCAGTCAGACCTCTTCAGCC-3’(SEQ ID NO:2)，
反向引物为5’-TGGTATCCTTCCTCCTCTTCTA-3’(SEQ ID NO:3)。
PCR的反应体系为：5μL 2×Ultra HiFidelityPCRPreMix、2μL 1μM正向引物、2μL1μM反向引物、1μL基因组DNA。
PCR的反应程序为：94℃、5min；94℃、15sec，60℃、15sec，72℃、30sec，35个循环。
(3)将步骤(2)所得PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，同时由擎科生物科技有限公司进行测序分析。
电泳检测结果(见图2)和测序结果(SEQID NO:1)显示，PCR产物条带清晰单一，DNA片段大小为2020bp，即为TaRAX3基因启动子的核苷酸序列。
实施例2
本实施例提供了重组表达载体和重组菌的构建过程，具体如下：
(1)以实施例1启动子克隆中所得的PCR产物为模板，使用引物对其进行PCR扩增。
其中，扩增所用的引物序列具体为：
5’-CCCAAGCTTTCAGTCAGACCTCTTCAGC-3’(SEQ ID NO:4，下划线为限制性内切酶Hind III的识别位点)，
5’-CGCGGATCCGGTGGTATCCTTCCTCCTCT-3’(SEQ ID NO:5，下划线为限制性内切酶BamH I的识别位点)。
PCR扩增的反应体系为：5μL 2×Ultra HiFidelityPCRPreMix、2μL 1μM正向引物、2μL 1μM反向引物、1μL PCR产物。
PCR扩增的反应程序为：94℃、5min；94℃、15sec，60℃、15sec，72℃、30sec，35个循环。
(2)使用Hind III(NEB#R3104)和BamH I(NEB#R3136)对上述扩增所得的PCR产物和pBI101质粒载体分别进行双酶切。其中，酶切反应体系为：5μL10×CutSmart Buffer、1μLHind III-HF、1μLBamH I-HF、1μg PCR产物/质粒载体，补加ddH2O至50μL。酶切反应程序为：37℃，1h。
(3)步骤(2)所得酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN#DP219)分别回收PCR酶切产物和线性化载体骨架。
(4)将上述回收的PCR酶切产物和线性化载体骨架用T4 DNA连接酶(NEB#M0202)进行连接，获得TaRAX3基因启动子与GUS基因融合的重组表达载体pBI101-TaRAX3 promoter-GUS。
其中，连接反应体系为：1μL 10×T4ligase buffer、1μL T4ligase、2μL PCR酶切产物、6μL线性化载体骨架。连接反应程序为：16℃，12h。
(5)采用电击法将上述重组表达载体pBI101-TaRAX3 promoter-GUS导入大肠杆菌DH5α，然后通过菌液PCR筛选阳性单克隆菌株提取重组质粒进行测序分析。
根据测序结果，对重组表达载体pBI101-TaRAX3 promoter-GUS的结构描述如下：将pBI101载体上Hind III和BamH I限制性内切酶的酶切位点之间小片段替换为序列表中SEQ ID NO:1自5’末端起第1至2020位核苷酸所示的DNA片段，结构示意图见图3。
实施例3
本实施例以拟南芥为例，验证本发明提供的根特异性启动子调控外源基因的特异性表达，具体如下：
(1)转基因拟南芥植株的制备
先采用冻融法将实施例2构建的重组表达载体pBI101-TaRAX3 promoter-GUS导入根癌农杆菌GV3103。再采用农杆菌浸花法转化哥伦比亚生态型拟南芥(野生型拟南芥，记为WT)，获得T0代转基因拟南芥的种子。
将T0代种子消毒后点播于含有50mg/L的卡那霉素MS固体培养基上，筛选出具有卡那霉素抗性的转基因苗，移栽到营养土中培养，收获的种子即为T1代种子。T1代种子消毒后点播于含有50mg/L的卡那霉素MS固体培养基上，筛选出具有卡那霉素抗性的转基因苗，移栽到营养土中培养。
其中，筛选转基因苗的方法为：取T1代植株的叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，通过PCR扩增鉴定阳性转基因拟南芥株系。用于检测GUS基因(外源基因)的引物序列具体为：
正向引物为5’-GCATCAGCCGATTATCATCA-3’(SEQ ID NO:10)，
反向引物为5’-TCCCTTTCTTGTTACCGCC-3’(SEQ ID NO:11)。
PCR扩增鉴定所用的反应体系为：5μL 2×Ultra HiFidelityPCRPreMix、2μL1μM正向引物、2μL 1μM反向引物、1μL基因组DNA。
PCR扩增鉴定所用的反应程序为：94℃，5min；94℃、15sec，60℃、15sec，72℃、10sec，35个循环。
部分样本的结果见图4，在阳性转基因拟南芥株系(L1、L2、L3)中可见外源基因GUS的目的条带，而在野生型拟南芥株系(WT)中未见目的条带。
(2)转基因拟南芥各组织中的GUS基因表达
分别取T1代阳性转基因拟南芥株系10天的幼苗，开花期的根、茎、莲座叶、茎生叶、盛开的花、未成熟的果荚，以及成熟期的种子。将各组织样品浸泡于GUS染色液(Coolaber#SL7160)中，37℃反应过夜，再用75％(V/V)乙醇脱色后，通过体式显微镜观察GUS染色结果并拍照。
结果如图5所示，在转基因拟南芥植株中，只有根部有明显的蓝色，而在茎、叶、花和种子中没有着色，表明TaRAX3基因启动子具有表达活性，且仅能在转基因拟南芥的根中启动GUS基因的表达。由此说明，TaRAX3基因启动子是一个能够调控目的基因在植物根中特异性表达的启动子。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种来源于小麦的根特异性启动子，其特征在于，所述根特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.用于扩增权利要求1所述根特异性启动子的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的根特异性启动子。
4.一种构建权利要求3所述重组表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以小麦基因组DNA为模板，使用权利要求2所述引物组进行PCR扩增；
S2、以S1所得PCR产物为模板，使用序列如SEQ ID NO:4～5所示的引物对进行PCR扩增，再采用Hind III和BamH I对扩增产物和质粒载体分别进行酶切；
S3、回收PCR酶切产物和载体并用DNA连接酶连接，获得重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1所述PCR扩增的反应体系包括5μL 2×Ultra HiFidelityPCRPreMix、2μL 1μM正向引物、2μL 1μM反向引物、1μL基因组DNA，且其反应程序为94℃5min，94℃、15sec，60℃、15sec，72℃、30sec，35个循环。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2所述酶切的反应体系包括5μL10×CutSmart Buffer、1μLHind III-HF、1μLBamH I-HF、1μg PCR产物或质粒载体、补加ddH2O至50μL，且反应程序为37℃、1h。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3所述连接的反应体系为1μL 10×T4ligase buffer、1μL T4ligase、2μL PCR酶切产物、6μL载体，且反应程序为16℃、12h。
8.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求1所述的根特异性启动子或权利要求3所述的重组表达载体。
9.权利要求1所述的根特异性启动子，或权利要求3所述的重组表达载体，或权利要求8所述的重组菌在植物中启动目的基因表达中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述目的基因表达是在植物根中表达。
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