CN116904466B - 一种促进基因表达的增强子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进基因表达的增强子及其应用，属于植物基因工程技术领域。一种促进基因表达的增强子，增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8中至少两段序列串联而成，R1的序列如序列表中SED ID NO：1所示，R2的序列如序列表中SED ID NO：2所示，R3的序列如序列表中SED ID NO：3所示，R4的序列如序列表中SED ID NO：4所示，R5的序列如序列表中SED ID NO：5所示，R6的序列如序列表中SED ID NO：6所示，R7的序列如序列表中SED ID NO：7所示，R8的序列如序列表中SED ID NO：8所示。该增强子能增强基因表达，且增强子的活性随着序列段数目的增加而增强。

Description

一种促进基因表达的增强子及其应用

技术领域

本公开涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种促进基因表达的增强子及其应用。

背景技术

生物的生长发育是基因在时空上有序的表达和协同作用的结果，增强子是一类短的DNA片段，能够通过结合转录因子进而激活基因转录过程。增强子能够通过同一条染色体的顺式激活或不同染色体之间的反式激活增强基因的时空表达。增强子相继在动物、植物、微生物和其他病毒中发现。大量动物增强研究表明，增强子能够通过与目的基因启动子相互作用，从上游或者下游以任何方向激活基因表达。

在农作物中，增强子是作物重要农艺性状变异的重要因素。例如，增强子在玉米中的应用，利用UB3基因负调控了雌穗发育，KRN4增强子可以远距离(60Kb)激活UB3基因在雌穗分生组织表达，调控穗行数的数量变异。可见，在植物基因工程领域利用增强子进行植物种质分子改良，对于提高作物产量、品质及抗逆性具有重要意义，对确保我国的粮食安全和发展持续、高效的绿色农业具有重要意义。但是，目前已经掌握的增强子的数量相较于植物种质分子改良仍显不足。因此，亟需开发增强子用于作物分子遗传改良。

公开内容

为了解决现有技术的问题，本公开实施例提供了一种促进基因表达的增强子及其应用。所述技术方案如下：

一方面，本公开提供了一种促进基因表达的增强子，所述增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8中至少两段序列串联而成，所述R1的序列如序列表中SEDIDNO：1所示，所述R2的序列如序列表中SEDIDNO：2所示，所述R3的序列如序列表中SEDIDNO：3所示，所述R4的序列如序列表中SEDIDNO：4所示，所述R5的序列如序列表中SEDIDNO：5所示，所述R6的序列如序列表中SEDIDNO：6所示，所述R7的序列如序列表中SEDID NO：7所示，所述R8的序列如序列表中SEDIDNO：8所示。

具体地，所述增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8依次串联而成，所述增强子的序列如序列表中SEDIDNO：9所示。

具体地，所述增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5和R6依次串联而成，所述增强子的序列如序列表中SEDIDNO：10所示。

具体地，所述增强子的序列为R5、R6、R7和R8依次串联而成，所述增强子的序列如序列表中SEDIDNO：11所示。

具体地，所述增强子的序列为R1、R2、R3和R4依次串联而成，所述增强子的序列如序列表中SEDIDNO：12所示。

具体地，所述增强子的序列为R7和R8依次串联而成，所述增强子的序列如序列表中SEDIDNO：13所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种促进基因表达的增强子的应用，所述应用包括：将所述增强子用于作物分子遗传改良。

具体地，将所述增强子插入到目标基因的启动子的上游位置用于增加目标基因的表达量。

进一步地，所述目标基因为BnaA9.CYP78A9基因。

更进一步地，所述增强子用于增加油菜角果的长度。

本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本公开提供了一种促进基因表达的增强子，该增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8中至少两段序列串联而成，该增强子能够增强目标基因表达，且增强子的活性随着序列段数目的增加而增强。

本公开还提供了一种促进基因表达的增强子的应用，该应用包括：将增强子用于作物分子遗传改良。在农作物育种中，可以通过转基因技术或引导编辑技术将不同序列段数目的增强子插入到目标基因的启动子上游，在基本不改变组织和时空特异性的条件下不同程度地增加目标基因的表达量，从而实现作物分子遗传改良的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本公开实施例六提供的由pCAMBIA3301改造而成的mini35S-GUS载体v示意图；

图2是本公开实施例六提供的携带有不同增强子的转基因拟南芥幼苗中GUS活性分析对比图，图中的标尺为1mm，mini35S为阴性对照；

图3是本公开实施例六提供的携带有不同增强子的转基因拟南芥叶片中GUS活性分析对比图，图中的标尺为1mm，mini35S为阴性对照；

图4是本公开实施例六提供的pGreenⅡ0800-LUC载体结构示意图；

图5是本公开实施例六提供的LUC/REN分析序列段数目对增强活性的影响；

图6是本公开实施例六提供的增强子、BnaA9.CYP78A9编码区及其启动子插入pCAMBIA2301载体的结构；

图7是本公开实施例六提供的qPCR分析阴性对照植株和转基因阳性植株BnaA9.CYP78A9基因表达水平，阴性对照植株(Westar)表达水平设为1，误差线表示SD，误差线上方的不同的字母表示差异显著，P值<0.01，t-test；

图8是本公开实施例六提供的ZS11、阴性植株和转基因阳性植株开花后30天角果的表型对比图；

图9是本公开实施例六提供的ZS11、阴性植株和转基因阳性植株开花后30天角果长度统计图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。

一方面，本公开提供了一种促进基因表达的增强子，增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8中至少两段序列串联而成，R1的序列如序列表中SEDIDNO：1所示，R2的序列如序列表中SEDIDNO：2所示，R3的序列如序列表中SEDIDNO：3所示，R4的序列如序列表中SEDIDNO：4所示，R5的序列如序列表中SEDIDNO：5所示，R6的序列如序列表中SEDIDNO：6所示，R7的序列如序列表中SEDIDNO：7所示，R8的序列如序列表中SED IDNO：8所示。

具体地，增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：9所示。

具体地，增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5和R6依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：10所示。

具体地，增强子的序列为R5、R6、R7和R8依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：11所示。

具体地，增强子的序列为R1、R2、R3和R4依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：12所示。

具体地，增强子的序列为R7和R8依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：13所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种促进基因表达的增强子的应用，应用包括：将增强子用于作物分子遗传改良。

具体地，将增强子插入到目标基因的启动子的上游位置用于增加目标基因的表达量。

进一步地，目标基因为BnaA9.CYP78A9基因。

更进一步地，增强子用于增加油菜角果的长度。

实施例一

本实施例提供了一种促进基因表达的增强子(R1-8)，该增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8依次串联而成。其中，R1的序列如序列表中SEDIDNO：1所示，具体序列为：ACGTAAACATTTACAACTAATTACCG TCGAAATGATTT，R2的序列如序列表中SEDIDNO：2所示，具体序列为：ACGAGTCTTTTACATCGAAGATTTC，R3的序列如序列表中SEDIDNO：3所示，具体序列为：ACGTGGTCTTTACATCGAAATTTT，R4的序列如序列表中SEDIDNO：4所示，具体序列为：ACGTGGAGTTTACATCGAAACATTT，R5的序列如序列表中SEDIDNO：5所示，具体序列为：ACGAGGGTGTTAC AACGAAACAATTT，R6的序列如序列表中SEDIDNO：6所示，具体序列为：ACGTGTGCTTTACATCGAATCCATT，R7的序列如序列表中SEDIDNO：7所示，具体序列为：ACGTGGAGTTTACCACGAAATTTT，R8的序列如序列表中SEDIDNO：8所示，具体序列为：ACGTGTCATTTACGACGAATATCT，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：9所示，具体序列为：ACGTAAACATT TACAACTAATTACCGTCGAAATGATTTACGAGTCTTTTACATCGAAGATTTCACGTGGTCTTTACATCGAAATTTTACGTGGAGTTTACATCGAAACATTTACGAGGGTGTTACAACGAAACAATTTACGTGTGCTTTACATCGAATCCATTACGTGGAGTTTACCACGAAATTTTACGTGTCATTTACGACGAATATCT。

实施例二

本实施例提供了一种促进基因表达的增强子(R1-6)，该增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5和R6依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDID NO：10所示，具体序列为：ACGTAAACATTTACAACTAATTACCGTCGAAAT GATTTACGAGTCTTTTACATCGAAGATTTCACGTGGTCTTTACATCGAAATT TTACGTGGAGTTTACATCGAAACATTTACGAGGGTGTTACAACGAAACAATTTACGTGTGCTTTACATCGAATCCATT。

实施例三

本实施例提供了一种促进基因表达的增强子(R5-8)，该增强子的序列为R5、R6、R7和R8依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：11所示，具体序列为：ACGAGGGTGTTACAACGAAACAATTTACGTGTGCTTTAC ATCGAATCCATTACGTGGAGTTTACCACGAAATTTTACGTGTCATTTACGAC GAATATCT。

实施例四

本实施例提供了一种促进基因表达的增强子(R1-4)，该增强子的序列为R1、R2、R3和R4依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：12所示，具体序列为：ACGTAAACATTTACAACTAATTACCGTCGAAATGATTTAC GAGTCTTTTACATCGAAGATTTCACGTGGTCTTTACATCGAAATTTTACGTG GAGTTTACATCGAAACATTT。

实施例五

本实施例提供了一种促进基因表达的增强子(R7-8)，该增强子的序列为R7和R8依次串联而成，增强子的序列如序列表中SEDIDNO：13所示，具体序列为：ACGTGGAGTTTACCACGAAATTTTACGTGTCATTTACGACGAATAT CT。

实施例六

本实施例提供了一种促进基因表达的增强子的应用，该应用包括：将增强子用于作物分子遗传改良。确定重复单元数与增强子活性的关系。具体地，通过PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)扩增实施例一至实施例五提供的增强子，体系为20μL，具体扩增体系为：DNA模板1μL，10×PCRbuffer2μL，10mMdNTP1.6μL，2.5mMMg²⁺1.5μL，正向引物F和反向引物R各0.4μL，rTaq酶0.2μL，加水至20μL，本实施例中所用的PCRbuffer、dNTP、Mg²⁺和rTaq酶等均购自宝生物工程大连有限公司。PCR扩增程序如下：94℃4分钟；每个扩增循环均包括：94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，共计31个循环；72℃7分钟；4℃保存。

正向引物F包括：

R1-F：ATAGGATCCACGTAAACATTTACAACTAATTA；

R3-F：ATAGGATCCACGTGGTCTTTACATCGAAA；

R5-F：ATAGGATCCACGAGGGTGTTACAACGAAACAA；

R7-F：ATAGGATCCACGTGGAGTTTACCACGAAA。

反向引物R包括：

R4-R：TTACTGCAGAAATGTTTCGATGTAAACT；

R6-R：AATGGATTCGATGTAAAGCA；

R8-R：TTACTGCAGAGATATTCGTCGTAAATG。

进一步地，分别利用BamHI和PstI限制性内切酶酶切本发明实施例一至实施例五提供的增强子序列。酶切体系为20μL，具体配法为：10xBamHIBuffer2μL，BamHI限制性内切酶1μL，PstI限制性内切酶1μL，PCR产物10μL，去离子水6μL(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)，反应条件为37度3小时。

进一步地，酶切片段回收纯化后，通过T4DNA连接酶(NEB，M0202T)连接到mini35S-GUS载体中，得到连接产物，其结构如图1所示。将连接产物利用电转化仪通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf公司产品，所用电压为1800v，操作方法见电转化仪的说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司)中，在含有250ppm卡那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯着，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台内接种于灭菌的10mL离心管内，离心管内预先加入3mL含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16～18小时。按照J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔着，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002版报道的方法抽提质粒，用KpnI和PstI双酶切并电泳检测，根据插入目标片段的大小获得阳性的表达载体，并进行测序检验。

将测序检验过的实施例一至实施例五提供的增强子通过农杆菌蘸花法转化拟南芥拟南芥野生型Col-0(CloughandBent1998)。并进行GUS染色，GUS染色结果如图2和图3所示。由图2和图3可知，转基因植株的GUS活性随着序列段数目的减少而降低，并且实施例三与实施例四表现出相似的GUS强度和表达模式，即实施例一提供的增强子的强度大于实施例二的增强子的强度，实施例二的增强子的强度大于实施例三的增强子的强度，实施例三的增强子的强度与实施例四的增强子的强度相似，实施例四的增强子的强度大于实施例五的增强子的强度。由此可见，本发明实施例提供的增强子的活性随着序列段数目的增加而增强，且实施例提供的不同增强子之间具有相似的增强活性。

进一步地，验证实施例一至实施例五提供的增强子的增强活性，分别将实施例一至实施例五提供的增强子作为模板，通过PCR扩增增强子与mini35S启动子片段，PCR扩增体系和PCR扩增程序同上，获得PCR产物，PCR扩增时所用的引物对如下：

LUCh35S-F：GTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCTCCACTGACGTAA；

LUCh35S-R：CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCGTGTTCTCTCCAAATGAA AT；

LUChS1-F：GTCGACGGTATCGATAAGCTTACGTAAACATTTACAACTAA TTA；

LUChS5-F：GTCGACGGTATCGATAAGCTTACGAGGGTGTTACAACGAA ACAA；

LUCh-8R：CGCTCTAGAACTAGTGGATCCAGATATTCGTCGTAAATG。

将PCR产物纯化后，再利用内切酶HindIII和内切酶BamH1分别插入pGreenⅡ0800-LUC载体，得到结构如图4所示的pGreenⅡ0800-LUC载体结构。拟南芥原生质体转化及双荧光素酶活性分析采用ReporterAssay System试剂盒(Promega，E1910，USA)方法进行。利用两种不同荧光素酶的活性比值(Luc/Ren)来判断序列段数目与增强活性的关系。结合图5可知，实施例一提供的增强子的Luc/Ren比值最高，说明具有8个序列段时增强子的活性最强；实施例三提供的增强子和实施例四提供的增强子比值均比实施例一提供的增强子的Luc/Ren比值低，这说明具有4个序列段时增强子的活性会降低；实施例五提供的增强子的Luc/Ren比值最低，这说明具有2个序列段时增强子的活性最低。

确定本发明实施例提供的增强子对油菜角果长度的增强效果，具体地，通过PCR扩增实施例一提供的增强子、BnaA9.CYB78A9基因编码区和BnaA9.CYB78A9基因编码区上游3000bp的启动子序列。扩增所使用的引物如下：

SRS-F：ATAGAATTCACGTAAACATTTACAACTAATTA；

SRS-R：TTAGGTACCAGATATTCGTCGTAAATG；

Prom-F：TACGAATTCGAGCTCGGTACCTTACTGCTGATATCTCAACCA；

Prom-R：GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGGAAGCAGAGAAAGAGATAA A；

A9-F：TCCTCTAGAGTCGACCTGCAGATGGCGACCAAGCTCGACAC；

A9-R：ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTTAACCGCGCCTGCCGCTCA。

将PCR产物纯化后，SRS片段通过EcroI和BamH1双酶切插入Pcambia2301载体、BnaA9.CYB78A9基因编码区及其启动子通过重组连接如结构图6所示产物。连接体系为：载体1.5μL，片段6μL，5xbuffer2μL，NovoRecplus0.5μL(NovoRecplusPCR一步定向克隆试剂盒)。

本实施例使用Westar受体，获得10株T0代转基因阳性植株，同时设置阴性对照植株(Westar)，并以大粒品种中双11号(ZS11)作为参考。从这些转基因阳性植株中选择3个独立株系，分别命名为8R-1、8R-2和8R-3，通过qPCR(Quantitativepolymerasechainreaction，实时荧光定量聚合酶链反应)做详细分析，具体引物如下：

qBnaA9.CYP78A9-F：AACTCGTGACTCGCCTAGC；

qBnaA9.CYP78A9-R：ATCCTAGCAAGAACCCAC；

Actin-BnENTH-F：GTTTAGACCCGTTGCTGCTC；

Actin-BnENTH-R：TTGTCCATCTCAGCCATTTG。

结果如图7所示，与阴性对照植株相比，在8R-1、8R-2和8R-3转基因阳性植株中BnaA9.CYB78A9基因表达水平显著升高，BnaA9.CYB78A9基因能够正调控油菜角果的长度，如图8和图9所示，油菜角果的长度显著平均增加2.28cm，油菜角果的长度是影响甘蓝型油菜产量的重要性状，可见，本发明实施例提供的增强子能够用于作物分子遗传改良。

以上所述仅为本公开的可选实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种促进基因表达的增强子，其特征在于，所述增强子的序列为R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8依次串联而成，所述增强子的序列如序列表中SEDID NO：9所示。

2.一种如权利要求1所述的促进基因表达的增强子的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述增强子用于作物分子遗传改良。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述增强子插入到目标基因的启动子的上游位置用于增加目标基因的表达量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述目标基因为BnaA9.CYP78A9基因。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述增强子用于增加油菜角果的长度。