CN116694588A - 玉米lox5蛋白在增强植物低温耐受能力中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了玉米LOX5蛋白在增强植物低温耐受能力中的应用。本发明克隆了LOX5基因，并构建了过表达LOX5基因的转基因植物，对获得的转基因玉米进行抗寒性分析发现，过表达LOX5能够使玉米获得更强的低温耐受能力。本发明提供了玉米LOX5蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提升植物耐受低温胁迫性能中的应用。本发明为培育耐低温植物新品种提供了新的基因资源和方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及玉米LOX5蛋白在增强植物低温耐受能力中的应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是一种起源于热带低纬度地区的经济作物，尽管在人类驯化和种植过程中逐渐进入高纬度和高海拔的温带地区，但是玉米对于低温寒害依旧十分敏感，因此在温带地区扩大玉米种植仍然需要进行耐冷抗寒玉米的培育。玉米对低温的敏感性主要是由于光合作用能力减弱和自身新陈代谢紊乱。玉米幼苗短期暴露于低温度下会导致光合作用活性降低，随后耗散机制和抗氧化系统的参与，影响同化物的输运。
转基因技术可以把植物的抗逆基因导入需要改良的玉米遗传物质中，并使其后代表现出稳定遗传的抗逆能力，为农业生产提供优良品种资源。不断提供新的抗寒性基因资源，对玉米种植资源改良和实际生产具有积极意义。
发明内容
本发明的目的在于提供新的玉米耐冷基因及其应用。
玉米LOX5与拟南芥中的LOX1同源性最高，但目前未发现拟南芥中的LOX1具有低温表型，也尚未有遗传证据证实玉米中的LOX5基因或其他物种的同源基因能够直接影响植物的耐冷性。LOXs基因家族成员较多，比如大豆中有19个，水稻、马铃薯和西红柿中均有14个，玉米中有13个，拟南芥中则被鉴定出有6个LOXs基因，这些结果说明该基因存在功能冗余的可能性，无法简单预期单一的LOX基因能否发挥生物学功能。此外，基因的表达水平变化和表型之间不一定存在必然关联(比如已发现玉米MYB41基因表达水平受低温诱导上调，但MYB41的转基因材料并无显著低温表型)，因此也无法仅通过基因表达的变化来预期相应基因的功能。本发明是通过对玉米LOX5基因的深入研究，发现过表达该基因的转基因植株较野生型植株具有明显耐冷表型。LOX5基因为培育耐冷植物新品种提供了基因资源。
本发明提供了LOX5蛋白及其编码基因在玉米耐冷抗寒中的应用。为发掘玉米耐冷抗寒相关基因，本发明筛选了转基因过表达株系的玉米库，并且观察它们的表型，发现不同的过表达基因株系的表型各异，进一步发现过表达LOX5基因的若干株系，都表现为明显的耐冷表型。
具体地，本发明对过表达玉米群体进行筛选，以叶片相对受伤面积为指标，进行低温表型的初步筛选，对初筛有表型的过表达株系进行复筛，确定其低温相关表型，通过查阅过表达信息表发现该株系过表达基因的基因号为GRMZM2G102760。进一步根据MaizeGDB网站上的基因注释确定为玉米脂代谢酶LOX5(lipoxygenase5)，统一比对发现LOX5属于脂氧合酶，参与不饱和脂肪酸代谢生成氧脂素(oxylipin)。通过本发明研究确定LOX5基因可能为玉米耐冷抗寒的关键基因，进而通过在玉米中过表达LOX5基因，获得了耐冷抗寒的转基因植物。
本发明中涉及的玉米LOX5蛋白的cDNA序列为：i)SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。
玉米LOX5cDNA由3160个碱基组成，序列如SEQ ID No.1所示。该基因读码框由9个外显子组成。由玉米LOX5基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明所述的玉米LOX5蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：
1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。
本发明提供了玉米LOX5蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提升植物耐受低温胁迫性能、选育耐受低温胁迫性能提高的转基因植物、植物耐受低温胁迫种质资源改良和提高低温胁迫下植物存活率中的应用。
所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
本发明还提供含有植物耐低温的LOX5基因序列或其片段的克隆载体或各类表达载体，含有所述载体的宿主细胞，含有所述基因序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。其中，含有LOX5基因的过表达载体为含有Ubi启动子的pBCXUN载体。
本发明还提供了一种转基因植物的制备方法，通过转基因方法提高LOX5基因的表达量，获得具有提高的抗寒能力的植物。
具体所述转基因植物的制备方法包括如下步骤：
(1)扩增LOX5基因的全长基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)；
(2)构建LOX5基因的过表达载体；
(3)构建含有LOX5基因的过表达载体的重组农杆菌；
(4)采用农杆菌侵染法，构建LOX5基因过表达的转基因植物。
本发明提供的LOX5蛋白及其编码基因在植物中的应用，其中，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为水稻、小麦、大豆、高粱、小米、棉花、大麦或玉米。
本发明还提供了提升植物耐受低温胁迫性能的方法，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，提高植物对玉米LOX5基因的表达。
所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含所述玉米LOX5基因的重组表达载体导入玉米。
在本发明的实施例中，构建抗低温的转基因植物的具体方法为：
1)提取玉米总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增LOX5基因，将扩增产物构建到表达载体pBCXUN上，获得的重组表达载体命名为pBCXUN-LOX5；
2)用pBCXUN-LOX5转化农杆菌EHA105，然后利用转化的农杆菌侵染玉米愈伤组织，获得抗低温的转基因玉米幼苗。
其中，步骤1)中所述引物F和R的核苷酸序列如SEQ ID No.3和4所示。被侵染的玉米优选为LH244纯合基因型的玉米植株。将本发明的LOX5基因过表达后，玉米表现为抗低温的表型。
所述表达载体为pBCXUN载体，该pBCXUN载体改造自质粒pCAMBIA1300，为在pCAMBIA1300中连入潮霉素抗性基因得到。
本发明克隆了LOX5基因，并构建了过表达LOX5基因的转基因植物，对获得的转基因玉米进行抗寒性分析发现，过表达LOX5基因能够提高玉米耐冷性，使玉米获得更强的低温耐受能力。本发明为培育耐低温植物新品种提供了新的基因资源，同时为研究玉米应答低温胁迫的机制奠定了一定的理论基础。
附图说明
图1为本发明实施例2中WT组和玉米过表达株系的LOX5基因过量表达测试结果图；图中，***代表P<0.001。
图2为本发明实施例3中WT组和玉米过表达株系低温处理恢复后植株生长情况照片；
图3为本发明实施例3中WT组和玉米过表达株系离子渗漏率统计图；图中，**代表P<0.01，***代表P<0.001。
图4为本发明实施例3中WT组和玉米过表达株系相对叶片损伤面积统计图；图中，**代表P<0.01，***代表P<0.001。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,21)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中的主要试剂为：各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD购自NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及Glucose、BSA、LBMedium等购自Sigma、Bio-Rad等公司；实时定量PCR所用的试剂购自于TaKaRa，实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。
实施例1LOX5基因过表达载体的构建和检测
本实施例从B73玉米(Zea mays L.)提取总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增LOX5基因，引物带有酶切位点，酶切后连到过表达载体上。LOX5基因过表达载体构建方法具体如下：
(1)用Magen公司的RNA提取试剂盒提取B73玉米总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。
(2)用thermo公司的反转录试剂盒将RNA反转录出cDNA，具体步骤参照试剂盒说明书。
(3)以玉米cDNA为模板，F和R为引物，扩增LOX5的cDNA(如SEQ ID NO.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，将扩增产物跑电泳切胶回收，回收方法参照天根公司试剂盒说明书。
所用扩增LOX5基因cDNA的引物为：
上游引物F：5’-ATGTTCTGGCACGGGGTCG-3’(SEQ IDNo.3)；
下游引物R：5’-TCATATGGAGATGCTGTTGG-3’(SEQ IDNo.4)。
(4)将回收的LOX5基因cDNA和pBCXUN载体(pBCXUN载体是以商业化载体pCAMBIA1300为骨架，在pCAMBIA1300中连入潮霉素抗性基因所得到的(Guo et al.,2018Stepwise cis-regulatory changes in ZCN8contribute to maize flowering-timeadaptation.Current Bio.28,3005–3015)；同时将玉米泛素基因Ubi的启动子通过酶切连接的方式克隆到载体上，驱动下游过表达基因的转录)用Xba I和Cla I双酶切，酶切产物跑电泳切胶回收。回收产物用T4连接酶连接。将LOX5基因连接至pBCXUN载体，以Ubi启动子驱动LOX5基因的表达。
(5)取5μL酶切-连接体系的产物，转化大肠杆菌感受态。在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选。菌落PCR鉴定单克隆，挑选阳性克隆测序。获得的测序正确的重组表达载体命名为pBCXUN-LOX5。将上一步所得的质粒酶切后，进行电泳检测，具体的方法为：用XbaI和Cla I酶切pBCXUN-LOX5，用1％琼脂糖凝胶，120V，50mA电泳后，UVP Gel Documentation凝胶分析系统扫描成像。
实施例2LOX5基因过表达植物的构建和检测
将实施例1所述含有LOX5基因的pBCXUN载体转化到农杆菌EHA105菌株中(Ma etal.,2009,Enhanced tolerance to chilling stress in OsMYB3R-2transgenic rice ismediated by alteration in cell cycle and ectopic expression of stressgenes.Plant Physiol.150,244–256)，再侵染玉米LH244愈伤组织，得到转基因幼苗。具体方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于100mL LB三抗液体培养液(Kan 50μg/mL，Rif 50μg/mL，Gen 50μg/mL)中，28℃振荡培养过夜，待OD600值为1.0-2.0，以50g，室温离心15min，收集菌体；用2mL转化液(1/2MS，5％蔗糖，40μL Silwet L-77)悬浮菌体；将玉米愈伤组织浸泡在农杆菌的转化液中，封口。放回光照培养架上正常生长至长出植株。然后进行筛选得到的种子进行低温逆境处理实验。
本实施例中分离得到表达量较高的过表达株系OE#1和OE#2采用实时定量PCR检测所得过表达株系OE#1和OE#2中LOX5的基因表达。具体方法如下：
1)提取植物总RNA，并反转录获得cDNA。
2)将反转录得到的cDNA稀释5倍后，用Takara试剂盒进行实时定量PCR，所用反应体系包括：2×SYBR Premix ExTaq buffer，0.2μL DyII，0.4μL Primer(F1/R1)，2μL cDNA模板，最后用ddH2O补齐至20μL，充分混匀后放入ABI PRISM 75实时定量PCR仪中进行两步法进行PCR扩增，反应条件为：95℃30s；95℃5s；60℃40s；40cycles。
其中，引物F1、R1(qRT-PCR的引物)的序列如下：
F1：5’-AAACGTCTGACGGAGTTCCC-3’(SEQ ID No.5)；
R1：5’-CCTCTTGTTCCTCAGTGCGT-3’(SEQ ID No.6)。
PCR反应完成后根据2-Δ(ΔCt)的原理计算出野生型(WT组)和过表达株系(OE)之间相对表达量并作图分析，进行三次生物学重复，三次趋势相近。在扩增所鉴定基因的同时，每个样品以UBI基因作为内参同时扩增。测试结果见图1，从图1中可知，过表达株系的表达量显著高于WT对照组。
实施例3过表达LOX5基因植物的抗低温能力检测
首先将WT组(野生型玉米)和实施例2中获得的OE#1和OE#2的种子播种在含有黑土，进口土和蛭石(质量比1:1:1)的长10cm，宽10cm，高10cm的小盆里，每个盆里放5粒，再覆2cm土放置于托盘中，浇水至土完全湿润，放置于23℃的培养室中，16小时光照，8小时黑暗。生长14天后进行4℃低温处理4天直到第二叶皱缩萎蔫后，拿出来放到23℃培养室恢复两天后拍照以及取材进行离子渗漏率和相对叶片损伤面积的统计。
WT组和玉米过表达株系低温处理恢复后植株生长情况如图2所示(左图为未进行低温处理的对照组，右图为低温处理恢复后的实验组)。结果显示，野生型WT叶片严重萎蔫，干枯甚至无法直立，而过表达株系OE#1和OE#2只有叶尖轻微受伤，且依然保持挺拔直立，表现出抗低温的表型。
本实施例中离子渗漏率的统计通过测叶片的相对电导率L＝(S1-S0)/(S2-S0)*100％进行。将低温处理后玉米的一整棵植株全部放到装有10ml蒸馏水的15ml离心管中，用真空泵抽气30min，然后置于摇床室温摇1h，之后用电导仪测其初电导值为S1，然后再将样品置于沸水中水浴15min，取出置于摇床摇2h，再测电导率记为S2。S0为空白对照蒸馏水的电导率。每次过表达株系(OE)和野生型(WT)都各取三株苗进行测定，并进行三次生物学重复。
结果显示如图3和表1所示，与野生型WT植株相比，过表达株系OE#1和OE#2的离子渗漏率分别降低31.0％和42.2％(三次野生型WT植株与过表达株系离子渗漏率差值的平均值)，达到显著性差异，P<0.01，表明过表达LOX5基因能够使得玉米抗寒能力增强。
表1三次独立实验离子渗漏率数值
| WT | OE#1 | OE#2 |
| 81.87％ | 50.48％ | 39.13％ |
| 81.75％ | 58.98％ | 39.83％ |
| 85.82％ | 47.06％ | 44.01％ |
本实施例中相对叶片损伤面积的统计通过将冷处理后的玉米叶片用胶棒贴到A4纸上,然后拍照,将照片放到Image J的软件中,进行处理,设置一个标尺,然后把叶片的受伤部位圈上,点击测量,记为A1，将整个叶片的一周圈上,点击测量,记为A2。通过A1/A2*100％可算出相对叶片损伤面积。每次过表达株系(OE)和野生型(WT)都各取三株苗进行测定，并进行三次生物学重复。
结果显示如图4和表2所示，与野生型WT植株相比，过表达株系OE#1和OE#2的相对叶片损伤面积分别降低31.6％和46.9％(三次野生型WT植株与过表达株系相对叶片损伤面积差值的平均值)，达到显著性差异，P<0.01，表明过表达LOX5基因能够使得玉米抗寒能力增强。
表2三次独立实验相对叶伤数值
| WT | OE#1 | OE#2 |
| 78.46％ | 44.73％ | 36.88％ |
| 83.00％ | 49.15％ | 33.08％ |
| 84.51％ | 57.26％ | 35.25％ |
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.玉米LOX5蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提升植物耐受低温胁迫性能中的应用。
2.玉米LOX5蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在选育耐受低温胁迫性能提高的转基因植物中的应用。
3.玉米LOX5蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在植物耐受低温胁迫种质资源改良中的应用。
4.玉米LOX5蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在提高低温胁迫下植物存活率中的应用。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述玉米LOX5蛋白的cDNA具有以下任一种核苷酸序列：
(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或
(2)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述玉米LOX5蛋白具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或重组菌。
8.如权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；优选水稻、小麦、大豆、高粱、小米、棉花、大麦或玉米。
9.提升植物耐受低温胁迫性能的方法，其特征在于，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，提高植物对玉米LOX5基因的表达。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导、农杆菌介导的方法将包含所述玉米LOX5基因的重组表达载体导入玉米。
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