CN105613258A - 一种高油酸油菜品种的培育方法 - Google Patents

一种高油酸油菜品种的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于油菜育种领域，具体涉及一种高油酸油菜品种的培育方法。本发明的特征在于：以油酸含量为65％或以下的甘蓝型油菜品系甲A177为母本与保藏号为CCTCC？NO：P201604的油酸含量至少为78％的高油酸甘蓝型油菜品系甲H003为父本进行杂交，通过人工去雄，得到F1；种植F1，通过小孢子培养获得分离的DH系；对DH系群体的每一个株系苗期进行高油酸分子标记鉴定，确定每个株系的基因型；利用气相色谱仪测定每个单株的油酸含量，确认各初选系的油酸含量；在油酸含量大于75％的DH系中，选择全株角果数、每角果粒数、千粒重和单株产量性状优于油酸小于69％的亲本株系，得到油酸大于78％的高油酸油菜选系和品种。

Description

一种高油酸油菜品种的培育方法
技术领域
本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种高油酸油菜品种的培育方法。本发明涉及利用小孢子培养、分子标记辅助选择和气相色谱法相结合选育优良高油酸油菜品系的方法。
背景技术
油菜种子中脂肪酸组成直接决定菜籽油的食用品质和营养价值。油酸是一种十八碳单不饱和脂肪酸。普通油菜种子中油酸含量为17-65％，本发明中的高油酸油菜是指种子及菜籽油脂肪酸中油酸的比例大于75％的油菜品种及其衍生的菜籽油。
高油酸食用油，包括高油酸菜籽油，在食用油和工业上有很高的应用价值。高油酸食用油的氧化稳定性高，在煎炸食物时，高油酸食用油高温不起烟，能够缩短煎炸时间，减少油吸收过量(Miller等,Geneticcontrolofhigholeicacidcontentinsunfloweroil.CropSciences,1987,27:923-926)。在日常饮食中，高油酸可降低血液中的低密度脂蛋白胆固醇的含量，从而有利于阻止动脉血管硬化(Chang等,Effectsoftheratioofpolyunsaturatedandmonounsaturatedfattyacidonratplasmaandliverlipidconcentration.Lipids,1998,33:481-487)。由于油酸的十八碳链长度与柴油组分相似，高油酸菜籽油可用于生产优质生物柴油，是重要的可再生性能源原料(Piazza等，Rapeseedoilforoleochemicaluses.EurJLipidSciTechnol,2001,103:405-454)。
培育高油酸油菜是国内外油菜育种的主要目标之一。目前在中国还没有高油酸油菜品种通过审定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种油菜高油酸品种的培育方法，该方法利用普通油酸含量(小于69％)的油菜品系或品种与高油酸(种子中油酸含量大于75％)油菜材料为亲本进行杂交，利用气相色谱分析和小孢子培养的辅助方法，通过杂交在上述材料的杂交后代中培育出高油酸油菜选系，即获得油酸含量大于78％的非转基因高油酸油菜材料和品种。
本发明的技术方案如下所述：
(1)以甘蓝型油菜品系甲A177为母本(2012年测定油酸含量65％)【该材料的种子已于2009年11月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNO：P200908；该生物材料已在专利号为ZL2009102734352，申请公布号为CN101824472A，即本申请人的专利文献中公开，本申请不需要重新提交生物材料保藏与公开】与高油酸含量甘蓝型油菜新资源甲H003为父本(2012年测定的油酸含量为80％。申请人将所述的父本命名为油菜高油酸种子甲H003，BrassicanapusL.甲H003,于2016年1月25日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNOP201604)杂交，通过人工去雄，得到F1；
(2)种植上步所得的F1，取花蕾进行小孢子培养(小孢子培养培养方法参见：余凤群等，提高甘蓝型油菜小孢子胚状体成苗率的某些培养因素研究，作物学报，1997，23(2)：165-168)获得分离的双单倍体(简称DH系)群体；
(3)利用高油酸分子标记(例如YQ-Fad2a-1)对DH系群体的每一个株系的幼苗进行标记分析，可以在苗期获得每个株系的油酸基因型(该分子标记的制备及其应用方法参见申请人，专利号为ZL2009102734352文献，申请公布号CN101824472A；申请公布日：2010.09.08)，通过分子标记分析可以减少花期及后续种子分析的工作量，提高鉴定的准确性；
所用的分子标记引物(YQ-Fad2a-1，本发明中所称的分子标记和分子标记引物为同一对序列)如下：
正向引物5'-CAGTTCACTCTCGGCAGC-3'，
反向引物5'-GCAACTCCTTGGACAGCA-3'；
(4)利用气相色谱仪测定每个株系种子的油酸含量(测定方法参照：杨燕宇等.无芥酸甘蓝型油菜十八碳不饱和脂肪酸含量的QTL定位.作物学报，(2011).37(8):1342-1350)，确认每个初选系的油酸含量；
(5)种植种子中油酸含量大于75％的DH系，考察各个株系的全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量4个性状；筛选得到全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量4个性状的优于普通油酸(油酸含量小于69％)含量亲本的株系，获得种子油酸含量大于78％的高油酸油菜选系和品种。
附图说明
图1：利用分子标记引物(YQ-Fad2a-1)对高油酸FAD2基因在24个DH系材料中油酸基因型鉴定结果。附图标记说明：编号为2、3、4、5、9、10、11、12、13、15、16、17、18、21、24的样品，有扩展产物的DH系鉴定为高油酸(油酸含量大于75％)基因型，没有得到扩增产物的个体(编号为1、6、7、8、14、19、20、22、23样品)为普通低油酸含量(油酸含量小于69％)基因型。
本发明的积极效果如下：
(1)本发明利用油酸含量大于75％的甘蓝型油菜品系，通过与油酸含量小于69％的优良甘蓝型油菜品系或品种为亲本进行杂交，在小孢子培养获得的纯系中进行高油酸分子标记选择，可以提前分离出高油酸基因型，减少育种工作量；通过对种子脂肪酸的气相色谱分析并结合后代农艺性状鉴定，可以选育出油酸含量稳定大于78％的非转基因高油酸材料和品种。
(2)本发明为选育优良高油酸油菜品种提供了一种简单、快速、有效的方法。利用该方法可进一步改良菜籽油的品质，提高菜籽油的市场价值，为高端食用油生产企业提供优质原料,通过降低生产成本，提高企业经济效益和市场竞争力。
具体实施方式
实施例1
(1)配制普通油酸含量和高油酸含量的F1组合
以甘蓝型油菜品系甲A177为母本(油酸含量65％)【该材料的种子已于2009年11月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNO：P200908；该生物材料已在专利号为ZL2009102734352，申请公布号为CN101824472A，本申请中甘蓝型油菜品系甲A177已在本申请人的专利文献中公开，本申请不需要重新提交生物材料保藏与公开)，与创造的高油酸含量甘蓝型油菜甲H003为父本(2012年测定的油酸含量为80％。申请人将所述的父本命名为油菜高油酸种子甲H003，BrassicanapusL.甲H003，于2016年1月25日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNOP201604)】进行杂交，通过人工去雄，得到F1；
(2)利用小孢子培养获得加倍单倍体(doubledhaploid，简称双单倍体，或简称DH)分离群体。
将上步得到的F1植株种植在华中农业大学实验农场，初花期根据植物整体长势选10个单株，取3mm左右花药作小孢子培养，以70mg/L的秋水仙碱作染色体加倍培养(小孢子培养和加倍方法参照：石淑稳，吴江生，周永明等.甘蓝型油菜小孢子单倍体二倍化技术的研究.中国油料作物学报，2002，第4卷，第1期1-5)获得双单倍体(DH)植株300株。
(3)DH群体中高油酸系筛选及鉴定
将上步所得的DH单株和其亲本(甲A177，甲H003)种植在湖北省武汉市华中农业大学试验田。每一个株系种1行，每行11株，株距24cm，行间距30cm。苗期采集300个株系及双亲的叶片提取基因组DNA(油菜基因组DNA的提取方法参考：李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)。利用申请人的发明专利(该分子标记的制备及应用方法参见申请人，专利号为ZL2009102734352，申请公布号CN101824472A；公布日：2010.09.08的专利文献)公开的分子标记对筛选材料进行标记分析，获得各DH系的油酸含量基因型。
分子标记引物(YQ-Fad2a-1)如下所述：
正向引物5'-CAGTTCACTCTCGGCAGC-3'，
反向引物5'-GCAACTCCTTGGACAGCA-3'；
(4)高油酸DH系的气相色谱分析
种子成熟时收获DH单株上的自交种子，采用气相色谱仪测定种子中脂肪酸成份(测定方法参照：杨燕宇等，无芥酸甘蓝型油菜十八碳不饱和脂肪酸含量的QTL定位，作物学报，201137(8):1342-1350)，共选择油酸含量大于78％的单株52个进行播种(脂肪酸数据测试结果见表1)，形成52个株系；每个株系选4株自交。将自交后的种子采用气相色谱仪进行分析测试。
表1本发明中52个甘蓝型油菜DH单株的主要脂肪酸含量
(5)高油酸株系的农艺性状分析
将上步所得的DH系和其亲本(甘蓝型油菜甲A177，甘蓝型油菜甲H003)种植在湖北省武汉市华中农业大学实验农场试验田。田间试验采取完全随机区组设计，三次重复，每个系种二行，每行11株，株距24cm左右，行间距30cm。收获成熟的试验材料并考察各株系单株的全株角果数、每角果粒数、千粒重和单株产量4个性状；筛选得到全株角果数、每角果粒数、千粒重和单株产量4个性状均优于母本或与母本相当的株系13个。将13个株系进行种植，同样每个株系选4株自交，自交种子采用气相色谱仪分析测试，并选取在各株系内选取30个正常单株，考察单株的全株角果数、每角果粒数、千粒重和单株产量4个性状，最后获得全株角果数、每角果粒数、千粒重、单株产量4个性状均优于母本或与母本相当的7个株系(农艺性状数据见表2)。
表2本发明中7个高油酸甘蓝型油菜株系的主要农艺性状
表3本发明中7个高油酸甘蓝型油菜株系的主要脂肪酸含量
这7个株系单株间脂肪酸成分含量表现较一致，各株系单株种子的油酸含量均在78％-80％之间，亚油酸含量在9％左右，亚麻酸含量在6％左右(脂肪酸测试结果见表3)，育成的新品系的油酸含量超过78％,为生产上亟需的低芥酸、高油酸含量甘蓝型油菜新品系。

Claims (2)

1.一种油菜高油酸品种的培育方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)以油酸含量为65％或以下的甘蓝型油菜品系甲A177为母本与保藏号为CCTCCNO：P201604的油酸含量至少为78％的高油酸甘蓝型油菜品系甲H003为父本进行杂交，通过人工去雄，得到F1；
(2)种植上步所得F1，通过小孢子培养获得分离的双单倍体(DH系)群体；
(3)对DH系群体的每一个株系在苗期进行高油酸分子标记鉴定，确定每个株系的基因型；
分子标记引物对的序列如下所示：
正向引物5'-CAGTTCACTCTCGGCAGC-3'，
反向引物5'-GCAACTCCTTGGACAGCA-3'；
(4)利用气相色谱仪测定每个单株的油酸含量，确认各初选系的油酸含量；
(5)种植种子中油酸含量大于75％的DH系，考察各株系的全株角果数、每角果粒数、千粒重和单株产量4个性状；筛选得到全株角果数、每角果粒数、千粒重和单株产量4个性状等于或优于种子中油酸含量小于69％的亲本的株系，获得种子中油酸含量大于78％的高油酸油菜选系和品种。
2.权利要求1所述的方法在培育高油酸油菜品种中的应用。
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