CN111363853A

CN111363853A - 一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒

Info

Publication number: CN111363853A
Application number: CN202010324695.4A
Authority: CN
Inventors: 尚静; 薛冰; 张敏; 贾琦; 龚国淑; 陈华保
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-04-23
Also published as: CN111363853B; AU2020103434A4

Abstract

本发明公开了一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒。引物包括配合使用的体系Ⅰ和体系Ⅱ；体系Ⅰ和体系Ⅱ中至少一组体系包括如SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示的引物；同时，体系Ⅰ和体系Ⅱ分别包括如SEQ ID NO.5～6或SEQ ID NO.7～8所示的引物，且体系Ⅰ和体系Ⅱ含有的引物不同。本发明通过设计两组引物体系，通过一批次的检测就能够有效的将AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒完全的检测出来，同时还能够避免引物之间的相互干扰。

Description

一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物、试剂盒以及检测方法。

背景技术

植物病毒是一种由核酸和蛋白质组成的具有侵染活性的细胞内寄生病原物，据国际病毒分类委员会(ICTV)的第八次报告，目前全世界发现的植物病毒种类达1122个。植物病毒所引起的植物病害素有“植物癌症”之称，其对农作物的危害程度仅次于真菌病原物，几乎每种农作物都受到2～3种病毒的危害。全世界每年由植物病毒造成的损失约4百亿美元，仅烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)造成的危害就超过1亿美元。

猕猴桃是全球重要的园艺产品之一，因其果肉含有丰富的维生素C、矿物质及膳食纤维，深受大众的青睐。2017年，世界猕猴桃产量已达到403万吨，但病害的侵染会影响猕猴桃的产量和质量，甚至影响猕猴桃产业的健康发展。病毒病是一种潜伏期长、在生产上存在巨大隐患的病害。而猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspotsassociated virus,ACRaV)、黄瓜花叶病毒病(Cucumber mosaic virus,CMV)、猕猴桃病毒A(Actinidia virus A,AcVA)、猕猴桃病毒B(Actinidia virus B，AcVB)均能在自然条件下该病毒可侵染猕猴桃，对果树和猕猴桃的正常生长发育产生一定的影响。同时，我国在湖北，陕西，四川等地区的猕猴桃栽品种中均有检测到该病毒。但目前未见能够同时对4种病毒进行检测，且引物相互之间不会存在干扰的报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒，能够检测出AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒，且引物特异性好，灵敏度高。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，包括配合使用的体系Ⅰ和体系Ⅱ；体系Ⅰ和体系Ⅱ中至少一组体系包括如SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示的引物；

同时，体系Ⅰ和体系Ⅱ均还包括如SEQ ID NO.5～6或SEQ ID NO.7～8所示的引物；且SEQ ID NO.5～6和SEQ ID NO.7～8所示的引物不同时出现在体系Ⅰ和体系Ⅱ中；即体系Ⅰ中含有SEQ ID NO.5～6所示引物时，体系Ⅱ中就不会有SEQ ID NO.5～6所示引物，而是含有SEQ ID NO.7～8所示的引物。

引物具体序列如下所示：

AcVB-F：5’-GTTTGCGAGGAGACGTAGGGC-3’(SEQ ID NO.1)；

AcVB-R：5’-AGTTAAGTGCTCTYGGRGGTGTG-3’(SEQ ID NO.2)；

CMV-F：5’-GCCGCCATCTCTGCTATGTT-3’(SEQ ID NO.3)；

CMV-R：5’-GAATGCGTTGGTGCTCGATG-3’(SEQ ID NO.4)；

AcVA-F：5’-CATGGCAAAGAATATCTCAAG-3’(SEQ ID NO.5)；

AcVA-R：5’-AGATCCAACCCAGAGTTGAAA-3’(SEQ ID NO.6)；

AcCRaV-F：5’-GCTTGCAAGATGTCGATGCAG-3’(SEQ ID NO.7)；

AcCRaV-R：5’-TGCAGGGTCTGCTGCTTATTA-3’(SEQ ID NO.8)；

进一步地，体系Ⅰ包括如SEQ ID NO.1～6所示的引物；体系Ⅱ包括如SEQ ID NO.1～4和SEQ ID NO.7～8所示的引物。

进一步地，体系Ⅰ包括如SEQ ID NO.1～6所示的引物；体系Ⅱ包括如SEQ ID NO.7～8所示的引物。

进一步地，体系Ⅰ包括如SEQ ID NO.5～6所示的引物；体系Ⅱ包括如SEQ ID NO.1～4和SEQ ID NO.7～8所示的引物。

一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的方法，包括以下步骤：

(1)采集带病样本，然后提取其总RNA，并反转录得到cDNA；

(2)以权利要求1的体系Ⅰ和体系Ⅱ的引物分别进行PCR扩增即可。

进一步地，采集带病样本后，根据样本表现出的患病症状，选择相应体系Ⅰ或体系Ⅱ的引物体系进行初步检测，然后再用剩余体系的引物进行补充检测。

进一步地，PCR反应体系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、cDNA1.0μL，体系Ⅰ所述引物或体系Ⅱ所述引物1.0μL，最后补ddH₂O至25μL。

进一步地，体系Ⅰ中各引物以等比例浓度添加；体系Ⅱ中SEQ ID NO.1～2所述引物浓度为其余引物浓度的5倍，且其余引物以等比例浓度添加。

进一步地，PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸40s；35个循环；72℃延伸10min。

一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的引物。

本发明的有益效果为：

本发明通过设计两组引物体系，通过一批次的检测就能够有效的将AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒完全的检测出来，同时还能够避免引物之间的相互干扰，且引物也具有很高的灵敏度。

附图说明

图1为各引物特异性检测结果；

图2为AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R引物体系的灵敏度检测结果；

图3为AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R引物体系的灵敏度检测结果；

图4为AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R引物体系，以及AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R引物体系对四种病毒的特异性检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例

1、样本采集

从四川猕猴桃种植区采集具有典型泡状收缩、环状斑、黄色斑、萎黄斑、狭长变形、叶脉发黄、坏死等症状的叶片。叶片样本与无水氯化钙一起储存在干瓶中，4℃保存。新鲜叶片样品保存在-80℃的冰箱中。

2、总RNA提取

植物组织样品(0.1g)用2mL灭菌离心管在液氮中研磨，用苯酚、氯仿、异戊醇(v：v：v，25：24：1)(500μL)和RNA缓冲液(500μL)提取。离心后，将上清液(约400μL)与2倍体积的4M氯化锂溶液混合，在-20℃下孵育至少8小时，然后在4℃下，12，000rpm离心10min，回收颗粒中的RNA。球团用70％乙醇在4℃反复离心，风干后再悬浮于30μL的ddH₂O中，在-20℃下贮存。

3、引物设计

使用DNAMAN 8.0和MEGA 7.0从GenBank获得的每个病毒外壳蛋白(CP)基因的保守区域设计病毒特异性引物。BLASTN在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上验证引物的特异性。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并用ddH₂O稀释至10μM，50μM以进行PCR扩增。

4、引物特异性检测

分别以AcVA、AcVB、CMV、AcCRaV的RNA为模板，反转录得到相应单一病毒的cDNA，反转录试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

反转录体系包括：RNA 4μL；各病毒对应的下游引物2μL；5×RT Buffer 2μL；dNTPmixture 1μL；Rnase inhibitor 0.2μL；M-mulv 0.2μL；补RNase-free water至10μL。

然后于72℃，水浴锅中反转录5min；再在4℃放置5min以上即可得到各单一病毒的cDNA。

再分别以AcVA、AcVB、CMV、AcCRaV的单一cDNA为模板，采用SEQ ID NO.1～8所示的各病毒的特异引物分别对AcVA、AcVB、CMV、AcCRaV进行PCR扩增。

其反应体系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、病毒cDNA 1.0μL、上下游引物各1.0μL，最后补充ddH₂O至25μL。

反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸40s；35个循环；72℃延伸10min。

最后对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，其结果见图1。图1中条带M为Marker，条带1为AcVA，条带2为AcVB，条带3为CMV，条带4为AcCRaV。根据图1的检测结果可知，各病毒均有清晰可见的电泳条带，表明各病毒对应的引物均具有很强的特异性和灵敏度。

5、多重PCR的建立

(1)将步骤4中反转录体系中的引物替换为AcVA-R、AcVB-R和CMV-R(c：c：c，1：1：1)的混合体系，或AcVB-R、CMV-R和AcCRaV-R(c：c：c，5：1：1)的混合体系，其余过程均与步骤4的反转录过程相同。

(2)将步骤4中PCR体系中的引物替换为AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R(c：c：c，1：1：1)的混合体系，或AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R(c：c：c，5：1：1)的混合体系，其余过程均与步骤4的PCR过程相同。

6.多重PCR的灵敏度检测

将步骤2提取得到的总RNA浓度调整到600ng/μL，然后以步骤5建立的混合引物体系对其进行反转录，得到cDNA，并将cDNA进行10倍连续梯度稀释(10⁰-10^-8)，作为PCR扩增模板，然后以步骤5建立的PCR扩增引物体系对其进行PCR扩增，再用1％琼脂糖凝胶电泳检测其灵敏度，其结果见图2、图3和图4。

图2为AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R三重引物体系的灵敏度检测结果；

图3为AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R三重引物体系的灵敏度检测结果；图2和图3中条带1均为600ng/μL；条带2均为600×10^-1ng/μL；条带3均为600×10^-2ng/μL；条带4均为600×10^-3ng/μL；条带5均为600×10^-4ng/μL；条带6均为600×10^-5ng/μL；条带7均为600×10^-6ng/μL；条带8均为600×10^-7ng/μL；条带9均为600×10^-8ng/μL；条带M均为2000bpmolecular marker；条带N均为negative control。

根据图2和图3的检测结果可知，AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R，以及AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R引物体系均具有很高的灵敏度。

图4为AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R，以及AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R引物体系对四种病毒的特异性检测。

图4中条带1为AcVA；条带2为AcVB；条带3为CMV；条带4为AcCRaV；条带5为AcVA+AcVB；条带6为AcVA+CMV；条带7为AcVB+CMV；条带8为AcVB+AcCRaV；条带9为CMV+AcCRaV；条带10为AcVA+AcVB+CMV；条带11为AcVB+CMV+AcCRaV；条带M均为2000bp molecular marker；条带N均为negative control。

根据图4的检测结果可知，AcVA-F/R、AcVB-F/R和CMV-F/R，以及AcVB-F/R、CMV-F/R和AcCRaV-F/R引物体系均具有很高的特异性。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物和试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtttgcgagg agacgtaggg c 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agttaagtgc tctyggrggt gtg 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccgccatct ctgctatgtt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaatgcgttg gtgctcgatg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catggcaaag aatatctcaa g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agatccaacc cagagttgaa a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcttgcaaga tgtcgatgca g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcagggtct gctgcttatt a 21

Claims

1.一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，包括配合使用的体系Ⅰ和体系Ⅱ；所述体系Ⅰ和体系Ⅱ中至少一组体系包括如SEQ ID NO.1～2和SEQ IDNO.3～4所示的引物；

同时，体系Ⅰ和体系Ⅱ均还包括如SEQ ID NO.5～6或SEQ ID NO.7～8所示的引物；且SEQ ID NO.5～6和SEQ ID NO.7～8所示的引物不同时出现在体系Ⅰ和体系Ⅱ中。

2.根据权利要求1所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，所述体系Ⅰ包括如SEQ ID NO.1～6所示的引物；所述体系Ⅱ包括如SEQ ID NO.1～4和SEQ ID NO.7～8所示的引物。

3.根据权利要求1所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，所述体系Ⅰ包括如SEQ ID NO.1～6所示的引物；所述体系Ⅱ包括如SEQ ID NO.7～8所示的引物。

4.根据权利要求1所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的引物，其特征在于，所述体系Ⅰ包括如SEQ ID NO.5～6所示的引物；所述体系Ⅱ包括如SEQ ID NO.1～4和SEQ ID NO.7～8所示的引物。

5.一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集带病样本，然后提取其总RNA，并反转录得到cDNA；

6.根据权利要求5所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的方法，其特征在于，采集带病样本后，根据样本表现出的患病症状，选择相应体系Ⅰ或体系Ⅱ的引物体系进行初步检测，然后再用剩余体系的引物进行补充检测。

7.根据权利要求5所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、cDNA 1.0μL，体系Ⅰ所述引物或体系Ⅱ所述引物1.0μL，最后补ddH₂O至25μL。

8.根据权利要求7所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的方法，其特征在于，所述体系Ⅰ中各引物以等比例浓度添加；所述体系Ⅱ中SEQ ID NO.1～2所述引物浓度为其余引物浓度的5倍，且其余引物以等比例浓度添加。

9.根据权利要求5所述的检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸40s；35个循环；72℃延伸10min。

10.一种检测AcVA、AcVB、CMV和AcCRaV四种猕猴桃病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。