CN114790496A

CN114790496A - 同步检测5种柑橘病毒的dpo rt-pcr引物组、检测方法、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114790496A
Application number: CN202210476485.6A
Authority: CN
Inventors: 李战彪; 莫翠萍; 谢慧婷; 崔丽贤; 陈锦清; 林林; 罗婉笛; 李金哲; 蔡健和; 秦碧霞
Original assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-29
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-07-26

Abstract

本发明公开了一种同步检测5种柑橘病毒的DPO RT‑PCR引物组、检测方法、试剂盒及其应用，引物组的序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.10所示。本发明通过对柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒设计特异性DPORT‑PCR引物，检测引物可有效去除引物二聚体干扰，可同时从样品中检测出这5种病毒，检测方法简便高效，仅需要使用普通PCR仪和电泳仪即可进行检测，具有快速、经济、准确度高和灵敏度高的特点，可用于田间柑橘植株的大规模筛查和种苗调运前的防疫检测，为健康种苗检测及病害的田间筛查提供了技术支撑。

Description

同步检测5种柑橘病毒的DPO RT-PCR引物组、检测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种同步检测5种柑橘病毒的DPORT-PCR引物组、检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

随着柑橘种植面积不断扩大和新品种引进种植，区域间种苗调运频繁；由于难于监管，导致多种病虫害通过种苗携带传播流行，并造成严重危害，其中，病毒病害尤其突出。

柑橘衰退病毒(Citrus tristezavirus,CTV)引起柑橘树势衰退、枝条茎陷点、果实变小等症状；柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leafvirus,CTLV)引起植株黄化衰弱，严重时整株枯死；柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid，CEVd)的病树矮化，新梢少而弱，叶片小且多数呈缺锌症状，病树开花多，但落花落果严重，产量低；柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)能感染柠檬、酸橙、甜橙等大多数柑橘种类，会引起不同程度的脉明、褪绿和花叶症状，在砂糖橘上会造成严重的叶卷；柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotchvirus，CLBV)侵染柑橘属植物后，可引起枳橙或柚子作为砧木上的接穗异常结合，柑橘的接穗与砧木的不亲和性会直接危害柑橘树的生长，进而造成柑橘产业重大的经济损失。上述5种柑橘病毒是较为常见的侵染柑橘的RNA病毒，可经介体蚜虫、接穗进行传播，而带毒苗木的大范围调运则增加了病毒病远距离传播的风险，因此，建立高效、特异、灵敏度高的病毒检测方法有利于防止柑橘病毒随苗木传播的风险，从源头控制该类病害。

双启动寡核苷酸引物(dual-primering oligonucleotide，DPO)是一种新型的PCR引物设计方法，具有特异性高，引物设计简单等优点。目前已广泛应用于多种病原菌、病毒病原的检测中。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供同步检测5种柑橘病毒的DPO RT-PCR 引物组、检测方法、试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种同步检测5种柑橘病毒的OPO RT-PCR引物组，包括2条柑橘衰退病毒(CTV) 特异性引物，2条柑橘碎叶病毒(CTLV)特异性引物，2条柑橘裂皮病毒(CEVd)的特异性引物，2条柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)特异性引物，2条柑橘叶斑驳病毒(CLBV) 的特异性引物，具体如下：

DPO-CTV-F：5’-TGGCTCGTAGACACCIIIIICGTTCTCCGG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

DPO-CTV-R:5’-CTAAGGAGAACTTCTTIIIIICACGCATACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

DPO-CTLV-F：5’-TGCTTCAACAAGCGAGGCIIIIICGGGTAGGAG-3’，如SEQ ID NO.3 所示；

DPO-CTLV-R:5’-GTATAAAGGCAGGCATGTCAIIIIICAAGACCGCG-3’，如SEQ ID NO.4所示；

DPO-CEV-F:5’-CGGGATCTTTCTTGAGIIIIIIGTGGTGCT-3’，如SEQ ID NO.5所示；

DPO-CEV-R：5’-GCTCCTGTTTCTCCGCTGGIIIIIAGTGATCC-3’，如SEQ ID NO.6 所示；

DPO-CYVCV-F：5’-TCCATTGTCGACGAGTIIIIICTAAGCCAG-3’，如SEQ ID NO.7 所示；

DPO-CYVCV-R：5’-GGATAGCTGCGGTAGAGAGGGTIIIIGTAGTCGAAG-3’，如SEQ ID NO.8所示；

DPO-CLBV-F：5’-GGATTATGTGTCTCATGTIIIIIIAGAGACGG-3’，如SEQ ID NO.9 所示；

DPO-CLBV-R：5’-TGCAGCTTTGAGTGACIIIIICAATTCTTC-3’，如SEQ ID NO.10所示；

引物序列中的“I”为次黄嘌呤。

包含上述引物组的试剂或试剂盒。

采用如上所述的引物组同步检测柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒的方法，包括以下步骤：

(1)取待测样品，提取其总RNA，反转录为cDNA；

(2)采用所述引物组，以待测样品的cDNA为模板进行PCR反应，获得扩增产物；

(3)使用琼脂糖电泳检测PCR扩增产物：如扩增到416bp大小的条带，表明样品中含有柑橘衰退病毒；如扩增到716bp大小的条带，表明样品中含有柑橘碎叶病毒；如扩增到187bp大小的条带，表明样品中含有柑橘裂皮病毒；如扩增到938bp大小的条带，表明样品中含有柑橘黄化脉明病毒；如扩增到576bp大小的条带，表明样品中含有柑橘叶斑驳病毒；

优选地，所述PCR反应的反应体系为20μL，各引物的浓度为：引物DPO-CTV-F和引物DPO-CTV-R的浓度均为0.2μM，引物DPO-CTLV-F和引物DPO-CTLV-R的浓度均为 0.1μM，引物DPO-CEV-F和引物DPO-CEV-R的浓度均为0.5μM，引物DPO-CYVCV-F 和引物DPO-CYVCV-R的浓度均为0.3μM，引物DPO-CLBV-F和引物DPO-CLBV-R的浓度均为0.3μM。

优选地，所述PCR反应的反应程序为：50℃30min，94℃5min；30个循环参数为： 94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。

本发明还提供了上述引物组或含有该引物组的试剂盒在同步检测柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过对柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒设计特异性DPO RT-PCR引物，可同时从样品中检测出这5种病毒，检测方法简便高效，仅需要使用普通PCR仪和电泳仪即可进行检测，具有快速、经济、准确度高和灵敏度高的特点，可用于田间柑橘植株的大规模筛查和种苗调运前的防疫检测，为健康种苗检测及病害的田间筛查提供了技术支撑。

附图说明

图1为柑橘病毒单重检测最适退火温度筛选；

图2为5种柑橘病毒的灵敏度检测；

图3为柑橘多重检测引物浓度组合筛选及不同病毒复合侵染检测电泳图。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1引物设计

根据NCBI已公布的柑橘柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒的全基因组序列设计同步检测这5种病毒的DPO RT-PCR检测引物。

将柑橘衰退病毒(登录号:AF001623、AF260651、AY170468、FJ525436、JQ965169等)、柑橘碎叶病毒(登录号：AY646511、EU553489、MH108985、KC588948、KY706358 等)、柑橘裂皮病毒(登录号：DQ44444、M30870、S67437、M30868等)、柑橘黄化脉明病毒(登录号：KT124646、KX156742、MK415924、MF563877等)、柑橘叶斑驳病毒(登录号：EU857539、MT863785、MG572236、MN495980等)的所有致病型全基因组序列进行比对分析，选择同一病毒不同致病型间的保守序列且与不同病毒间差异较大的基因序列 (排除不同病毒间的保守序列)进行引物设计，避开同一病毒不同致病型基因序列间的特异序列和不同病毒基因序列间的保守序列，通过此方法更好的提高引物的特异性，同时在引物序列的3段增加次黄嘌呤进行修饰，进一步的减少二聚体的形成，从而达到引物高特异，高灵敏度和减少二聚体干扰等目的。

最终设计出来的所有引物与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性，扩增的目的条带大小存在差异，可以利用琼脂糖凝胶电泳轻松分离，明显辨别。引物序列具体如下：

DPO-CTV-F：5’-TGGCTCGTAGACACCIIIIICGTTCTCCGG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

DPO-CTV-R:5’-CTAAGGAGAACTTCTTIIIIICACGCATACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

DPO-CEV-F:5’-CGGGATCTTTCTTGAGIIIIIIGTGGTGCT-3’，如SEQ ID NO.5所示；

引物序列中的“I”为次黄嘌呤；

使用琼脂糖电泳检测PCR扩增产物：如扩增到416bp大小的条带，表明样品中含有柑橘衰退病毒；如扩增到716bp大小的条带，表明样品中含有柑橘碎叶病毒；如扩增到187bp 大小的条带，表明样品中含有柑橘裂皮病毒；如扩增到938bp大小的条带，表明样品中含有柑橘黄化脉明病毒；如扩增到576bp大小的条带，表明样品中含有柑橘叶斑驳病毒。

实施例2构建质粒

使用实施例1设计的特异性引物，分别从采集到的柑橘柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒样品中扩增目的片段，然后通过胶回收试剂盒回收扩增片段并纯化，将其与pMDT-20T载体连接，然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行培养，并进行菌落PCR验证，验证正确的菌落，将菌液送上海生工生物工程有限公司测序。对测序结果比对正确的菌落进行质粒的抽提，得到各重组质粒pCEV、pCTV、pCLBV、pCTLV、pCYVCV。然后用核酸蛋白分析仪测定质粒DNA的浓度，以测定样品DNA的浓度，各质粒浓度分别为70.7ng/μL，47.4ng/μL，50.8ng/μL。依据公式拷贝数(copies/μL)＝{6.02×10²³(copies/mol)×DNA浓度(ng/μL)×10^-9}/{碱基数(bp) ×660(ng/mol)}(Wilhelm et al.,2003)计算各质粒的拷贝数(copies)，分别为1.39×10¹⁰ copies，1.19×10¹⁰copies，1.23×10¹⁰copies、1.12×10¹⁰copies，1.60×10¹⁰copies。并分别对5种质粒进行稀释，稀释梯度见表1。

表1五种柑橘病毒质粒浓度梯度稀释及拷贝数计算

实施例3不同退火温度对单重PCR检测结果的影响

以克隆的重组质粒稀释10²倍为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL：PremixEx TaqTM 10μL、上下游引物终浓度0.50μmol/L，质粒DNA模板1μL，ddH2O补足20μL。 PCR反应参数为：94℃预变性2min；94℃变性30s，48～62℃退火30s，72℃延伸1min， 35个循环；最后72℃延伸10min，降温至12℃结束反应。

其他条件不变，筛选退火温度，设置8个处理：48℃、50℃，52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62.0℃。

PCR产物电泳检测：取6μLPCR产物与1μL 6×上样缓冲液相混合，室温下进行1.2％琼脂糖凝胶(已加入Goldview核酸染料)电泳，电泳条件为电压120V，时间30min，电泳结束后于凝胶成像系统观察电泳结果。

实验结果如图1所示，其中，M为DL2000 plus marker(Genstar)；1-8泳道分别对应从低到高的退火温度48℃，50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62.0℃；从上往下：A 图为CEVd；B图为CTV；C图为CLBV；D图为CTLV；E图为CYVCV。从图1中可以看出，本发明的检测5种柑橘病毒的特异性引物在以上所有退火温度中，均可以检出其大小与理论值相符的单一条带，且均未有引物二聚体干扰，后续实验验证挑选退火温度56℃。

实施例4检测灵敏度

在实施例3的基础上，其他条件不变，对各引物的灵敏度进行验证，将TA克隆质粒模板依次稀释(表1)，设置7个处理：10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。CEV在稀释到10^-3时仍能检测出目的基因条带，CTV和CYVCV在稀释到10^-4时均能检出目的基因条带，CLBV和CTLV在稀释到10^-5时仍能检出目的基因条带。结果说明CEV、CTV、CLBV、 CTLV和CYVCV单重PCR具有较高的检测灵敏度，其检测阈值的copies数分别为： 1.39E+06、1.19E+06、1.23E+05、1.12E+05、1.60E+06。

结果如图2所示，其中，M为DL2000 plus marker(Genstar)；1-8泳道分别对应从低到高的稀释倍数10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，8为阴性对照；A图为CEVd灵敏度检测电泳图；B图为CTV灵敏度检测电泳图；C图为CLBV灵敏度检测电泳图；D 图为CTLV灵敏度检测电泳图；E图为CYVCV灵敏度检测电泳图。

实施例5不同引物浓度对多重PCR检测结果的影响

在实施例3和4的基础上，对引物浓度进行优化，建立同时检测5种柑橘病毒的多重PCR体系。其他条件不变，设置16个引物浓度组合，组合情况见表2，选择稀释倍数10^-2的质粒模板进行多重PCR验证，结果如图3-A所示，除组合5和组合11未能检测到5种病毒之外，其他引物组合均可以检测到5条大小与理论值相符合的条带。

表2同时检测多种柑橘病毒的最佳引物组合筛选

实施例6多重PCR特异性和稳定性试验

在实施例5的基础上，挑选表2中的引物组合2分别对1种、2种、3种、4种、5种病毒混合质粒进行多重PCR验证。电泳结果如图3-B所示，M为DL2000 plus marker (Genstar)；1-5泳道分别为单一病毒模板：CEVd、CTV、CLBV、CTLV、CYVCV；6-15 泳道分别为2种病毒、3种、4种、5种病毒随机组合的复合模板，16泳道为阴性对照。结果表明本发明的多重检测体系在1种、2种、3种、4种、5种病毒中均可稳定检测到目的病毒。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院

<120> 同步检测5种柑橘病毒的DPO RT-PCR引物组、检测方法、试剂盒

<130> YX

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(20)

<223> n is i

<400> 1

tggctcgtag acaccnnnnn cgttctccgg 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(21)

<223> n is i

<400> 2

ctaaggagaa cttcttnnnn ncacgcatac g 31

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(23)

<223> n is i

<400> 3

tgcttcaaca agcgaggcnn nnncgggtag gag 33

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(25)

<223> n is i

<400> 4

gtataaaggc aggcatgtca nnnnncaaga ccgcg 35

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(22)

<223> n is i

<400> 5

cgggatcttt cttgagnnnn nngtggtgct 30

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(24)

<223> n is i

<400> 6

gctcctgttt ctccgctggn nnnnagtgat cc 32

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(21)

<223> n is i

<400> 7

tccattgtcg acgagtnnnn nctaagccag 30

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(26)

<223> n is i

<400> 8

ggatagctgc ggtagagagg gtnnnngtag tcgaag 36

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(24)

<223> n is i

<400> 9

ggattatgtg tctcatgtnn nnnnagagac gg 32

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(21)

<223> n is i

<400> 10

tgcagctttg agtgacnnnn ncaattcttc 30

Claims

1.一种同步检测5种柑橘病毒的OPO RT-PCR引物组，其特征在于，包括以下引物：

2条柑橘衰退病毒特异性引物：

DPO-CTV-F：5’-TGGCTCGTAGACACCIIIIICGTTCTCCGG-3’，如SEQ ID NO.1所示；

DPO-CTV-R:5’-CTAAGGAGAACTTCTTIIIIICACGCATACG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

2条柑橘碎叶病毒特异性引物：

DPO-CTLV-F：5’-TGCTTCAACAAGCGAGGCIIIIICGGGTAGGAG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

2条柑橘裂皮病毒的特异性引物：

DPO-CEV-F:5’-CGGGATCTTTCTTGAGIIIIIIGTGGTGCT-3’，如SEQ ID NO.5所示；

DPO-CEV-R：5’-GCTCCTGTTTCTCCGCTGGIIIIIAGTGATCC-3’，如SEQ ID NO.6所示；

2条柑橘黄化脉明病毒特异性引物：

DPO-CYVCV-F：5’-TCCATTGTCGACGAGTIIIIICTAAGCCAG-3’，如SEQ ID NO.7所示；

2条柑橘叶斑驳病毒的特异性引物，具体如下：

DPO-CLBV-F：5’-GGATTATGTGTCTCATGTIIIIIIAGAGACGG-3’，如SEQ ID NO.9所示；

其中，I为次黄嘌呤。

2.一种检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒包含权利要求1所述的OPO RT-PCR引物组。

3.一种同步检测柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取待测样品，提取其总RNA，反转录为cDNA；

(2)采用权利要求1所述的OPO RT-PCR引物组，以待测样品的cDNA为模板进行PCR反应，获得扩增产物；

(3)使用琼脂糖电泳检测PCR扩增产物：如扩增到416bp大小的条带，表明样品中含有柑橘衰退病毒；如扩增到716bp大小的条带，表明样品中含有柑橘碎叶病毒；如扩增到187bp大小的条带，表明样品中含有柑橘裂皮病毒；如扩增到938bp大小的条带，表明样品中含有柑橘黄化脉明病毒；如扩增到576bp大小的条带，表明样品中含有柑橘叶斑驳病毒。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系为20μL，各引物的浓度为：引物DPO-CTV-F和引物DPO-CTV-R的浓度均为0.2μM，引物DPO-CTLV-F和引物DPO-CTLV-R的浓度均为0.1μM，引物DPO-CEV-F和引物DPO-CEV-R的浓度均为0.5μM，引物DPO-CYVCV-F和引物DPO-CYVCV-R的浓度均为0.3μM，引物DPO-CLBV-F和引物DPO-CLBV-R的浓度均为0.3μM。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应程序为：50℃30min，94℃5min；30个循环参数为：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。

6.权利要求1所述的OPO RT-PCR引物组在同步检测柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒中的应用。

7.权利要求2所述的检测试剂或试剂盒在同步检测柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病毒、柑橘黄化脉明病毒、柑橘叶斑驳病毒中的应用。