CN105368942A - 罂粟成分的实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

罂粟成分的实时荧光pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种罂粟成分的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：步骤一：以罂粟种子的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；步骤二：检测扩增产物的荧光信号；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增罂粟成分的特异性引物对和罂粟成分的特异性探针。本发明的罂粟成分的实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测食品添加剂或调味品中是否非法添加罂粟成分提供了一种很好的方法，具有较好的应用前景。

Description

罂粟成分的实时荧光PCR检测方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种食品或调味品中罂粟成分的实时荧光PCR检测方法。
背景技术
罂粟壳为罂粟科植物罂粟的干燥成熟果壳，具有敛肺止咳、涩肠、止痛的功效，包含吗啡、可待因、罂粟碱等20多种生物碱。吸食罂粟壳及制品，会使吸食者在心理、生理上成瘾，对人体的肝脏、心脏等器官产生毒害作用。因此，罂粟壳在我国被列入麻醉药品的范围予以管制，作为非食用物质，严格禁止在食品及调味品中添加使用。
目前罂粟成分检测方法主要集中在对于罂粟来源生物碱成分的检测，方法主要有薄层层析法、紫外分光光度法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、酶联免疫法。这些方法适用范围较广，但仅能对罂粟壳食物中残留的生物碱进行间接检测，不能对罂粟物种来源进行准确定性，不能充分满足对罂粟违禁成分的执法检验和整治监管的需要。因此有必要建立一种准确客观的检测罂粟成分的新方法。
发明内容
本发明首要目的在于提供一种罂粟成分的实时荧光PCR检测方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，以及检测试剂盒的应用。本发明的第三个目的在于提供一种罂粟成分实时荧光PCR的引物对和探针。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种罂粟成分的实时荧光PCR检测方法，该方法包括以下步骤：
步骤一：以罂粟种子的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤二：检测扩增产物的荧光信号；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增罂粟成分的特异性引物对和罂粟成分的特异性探针，所述扩增罂粟成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述罂粟成分的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
根据本发明，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系为：2XTaqManMastermix12.5μL，引物各1.25μL，探针0.5μL，ddH2O4.5μL，DNA模板5μL；
反应的条件为：50℃，2min；95℃，10min，90℃，10s，60℃，1min，45个循环。
作为本发明的第二个方面，一种罂粟成分的检测试剂盒，含有以下试剂：
(a)扩增罂粟成分的特异性引物对；
(b)罂粟成分的特异性探针；
其中，所述扩增罂粟成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述罂粟成分的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
根据本发明，所述检测试剂盒还包括：
(c)标准参照物。
本发明的检测试剂盒可用于检调味品或食品添加剂中的罂粟成分。
作为本发明的第三个方面，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
本发明的有益效果是：
1、可快速、简便地检测调味品中是否存在罂粟成分；
2、其特异性好，且灵敏度高，特别适用于各类调味料中非法添加罂粟成分的检测。
附图说明
图1为实时荧光PCR引物特异性试验扩增曲线图。
图2为实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。
图3为实时荧光PCR检出限试验扩增曲线图。
图4为8种调味料实时荧光PCR扩增曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本发明的实验材料和仪器如下：
(1)桂皮、八角、香叶等7种调味料，海底捞清汤火锅底料、炖肉料、排骨鲜味王等8种复合调味料均为市售产品；
(2)罂粟种子为市售产品；
(3)鱼腥草、金银花、紫花地丁等36种药材，与罂粟具有同源性，均为市售产品；
(4)TianGenDP-305植物基因组DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司(TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD,Beijing,China)；
(5)TianGenDP-326深加工食品DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司(TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD,Beijing,China)；
(6)引物和探针由辉瑞公司合成(Pfizer,Inc.NYSE：PFE,USA)；
(7)TaqManGeneExpressionMasterMix(货号：4369016)试剂均购自AppliedBiosystems公司(AppliedBiosystemsInc.,USA)；
(8)试验相关仪器：液氮冷冻研磨仪SPEX6580(SPEX，USA)；紫外分光光度计NanovuePlus(GEHealthcare，UnitedKingdom)；实时荧光PCR仪ABIViia7(AppliedBiosystemsInc.,USA)；实时荧光PCR仪ABI7300(AppliedBiosystemsInc.,USA)；核酸蛋白分析仪；分析天平；离心机。
实施例1罂粟及香辛料、药材的DNA的提取
(1)固体样品：取25g罂粟种子，用液氮冷冻研磨仪研磨粉碎，称取200mg罂粟种子粉末至离心管中。
(2)液体样品：称取250g罂粟种子，倒入500mL的分液滤斗中，静置1-2小时，样品会分为3层，上层是油脂，中间是水相，下层是固体残渣。残渣处理：将残渣分离到100ml烧杯中，取部分残渣到研钵或者研磨仪中，研磨粉碎，取1mL至2ml的离心管中。水相处理：残渣分离后往分液滤斗中加入100mL石油醚，震荡5分钟后静置，收集下层水相，采用大体积浓缩仪(40～60℃+抽真空+低速离心)浓缩至1-5mL，取1mL至2mL的离心管中。
(3)采用TianGenDP-305植物基因组DNA提取试剂盒(TianGenDP305-02)对桂皮、八角、香叶等7种香辛料和鱼腥草、金银花、紫花地丁等36种药材进行提取。
(4)采用TianGenDP-326深加工食品DNA提取试剂盒对海底捞清汤火锅底料、炖肉料、排骨鲜味王等8种复合调味料进行提取。
上述(1)～(4)的DNA浓度采用紫外分光光度仪NanovuePlus测定，模板量控制在30ng/反应以上，OD260/280控制在1.8至2.0之间。
实施例2引物对和探针的设计
(1)本实施例的引物对和探针的序列见表1：
表1引物及探针序列
(2)本实施例的实时荧光PCR反应体系见表2：
其中，TaqMan实时荧光PCR反应程序为：50℃，2min；95℃，10min，90℃，10s，60℃，1min，45个循环。
表2SYBRGreen实时荧光PCR反应体系
实施例3罂粟成分实时荧光PCR扩增的引物和探针特异性检测
选取常见的用于配制复合调味料的香辛调味料，包括桂皮、八角、香叶、小茴香、花椒、辣椒、孜然共7种，另选取常用药材包括鱼腥草、金银花、紫花地丁等共36种，与罂粟种子一起抽提总DNA并纯化，抽提情况见表3和表4，以罂粟种子DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照，利用表2选取的扩增体系对引物进行特异性试验。扩增结果如图1。
表37种香辛料中DNA抽提情况
表436种药材中DNA抽提情况
结论：引物和探针仅对罂粟种子DNA扩增阳性，有明显S型扩增曲线，对其余7种香辛调味料和36种常用药材扩增阴性，提示该引物和探针特异性好。
实施例4实时荧光PCR灵敏度检测
将实施例3抽提得到的罂粟种子基因组DNA浓度调整为100ng/μL，梯度稀释成10ng/μL、1ng/μL、100pg/L、10pg/L、1pg/L共五个浓度梯度，各1μL进行PCR扩增，扩增Ct值见表5。扩增曲线见图2。
表5实时荧光PCR灵敏度试验Ct值
结论：可以看出随罂粟成分浓度的降低，扩增Ct值呈梯度增大，在模板使用量为10pg时，有明显S型扩增曲线，检出灵敏度达到10pg。
实施例5实时荧光PCR检出限试验
将罂粟种子样品研磨粉碎处理后，按照不同的重量比分别添加到不含罂粟成分的玉米淀粉基质中，抽提获得罂粟含量分别为100％、10％、5％、2％、1％、0.1％、0.01％、0.001％共8个梯度的系列稀释品，取每孔10ng用于PCR扩增，扩增Ct值见表6。扩增曲线见图3。
表6实时荧光PCR检出限试验Ct值
结论：可以看出随罂粟成分浓度的降低，扩增Ct值呈梯度增大，0.01％的模板有明显的S型扩增曲线，检出限达到0.01％。
实施例6实例验证
随机在上海世纪联华超市购买调味料样品8件，提取总DNA，抽提情况见表7。其中炒菜王未提取得到可供检测的DNA。以罂粟种子DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照，7个样品各取100ng进行扩增试验，扩增曲线见图4。
表78种调味料DNA抽提情况
结论：可以看出仅阳性对照出现S型曲线，结果表明该批超市抽取样品中未检出阳性。
本发明建立了罂粟成分的实时荧光PCR检测方法，针对罂粟物种特异基因设计引物和探针，仅需结合实时荧光扩增曲线图，2小时就能准确检测到调味料中罂粟这一非法添加物的存在，灵敏度达到10pg，检出限达到0.01％。
综上所述，本发明设计的罂粟成分的实时荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测食品添加剂或调味品中是否非法添加罂粟成分提供了一种很好的方法，在食品添加剂和调味品安全领域的检测把关上，具有较好的应用前景。而且，所述特异性引物对和探针可采用本领域中已知的方法，进一步制成检测试剂盒，所述试剂盒除了所述特异性引物对和探针外，还可以包括标准参照物，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一种罂粟成分的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一：以罂粟种子的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤二：检测扩增产物的荧光信号；
其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增罂粟成分的特异性引物对和罂粟成分的特异性探针，所述扩增罂粟成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述罂粟成分的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下：
反应体系为：2XTaqManMastermix12.5μL，引物各1.25μL，探针0.5μL，ddH2O4.5μL，DNA模板5μL；
反应的条件为：50℃，2min；95℃，10min，90℃，10s，60℃，1min，45个循环。
3.一种罂粟成分的检测试剂盒，其特征在于，含有以下试剂：
(a)扩增罂粟成分的特异性引物对；
(b)罂粟成分的特异性探针；
其中，所述扩增罂粟成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述罂粟成分的特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括：
(c)标准参照物。
5.一种如权利要求3或4所述的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于检测调味品或食品添加剂中的罂粟成分。
6.一种如权利要求1所述的罂粟成分的特异性引物对和探针，其特征在于，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO.3所示。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861711A (zh) * 2016-05-23 2016-08-17 公安部物证鉴定中心 罂粟种属特异性遗传标记检测体系
CN105969844A (zh) * 2016-03-31 2016-09-28 陈定虎 基于lamp技术检测罂粟的引物、试剂盒及检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484530A (zh) * 2012-06-13 2014-01-01 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 食品调味品中罂粟成分的检测方法
CN103898204A (zh) * 2012-12-28 2014-07-02 财团法人工业技术研究院 植物药材鉴别方法及其数据库以及引子对
CN104673930A (zh) * 2015-03-26 2015-06-03 湖南农业大学 一种罂粟的pcr检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103484530A (zh) * 2012-06-13 2014-01-01 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 食品调味品中罂粟成分的检测方法
CN103898204A (zh) * 2012-12-28 2014-07-02 财团法人工业技术研究院 植物药材鉴别方法及其数据库以及引子对
CN104673930A (zh) * 2015-03-26 2015-06-03 湖南农业大学 一种罂粟的pcr检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘洋等: "复合调味粉中罂粟成分的PCR检测方法", 《食品工业科技》 *
刘洋等: "复合调味粉中罂粟成分的实时荧光PCR检测方法", 《中国调味品》 *
刘爱平: "《细胞生物学 荧光技术原理和应用》", 31 January 2012 *
李建平: "《高等分析化学》", 31 August 2007, 冶金工业出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105969844A (zh) * 2016-03-31 2016-09-28 陈定虎 基于lamp技术检测罂粟的引物、试剂盒及检测方法
CN105861711A (zh) * 2016-05-23 2016-08-17 公安部物证鉴定中心 罂粟种属特异性遗传标记检测体系

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