CN117925902A - 鉴别李氏重楼的方法、引物、探针及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别李氏重楼的方法、引物、探针及应用，涉及植物鉴定的技术领域，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用引物D1‑F、D1‑R和探针D1‑probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为李氏重楼；所述引物D1‑F的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物D1‑R的序列如SEQ ID No.2所示，所述探针D1‑probe的序列如SEQ ID No.3所示。本发明具有极佳的特异性和灵敏度，能够对李氏重楼进行快速、可靠的鉴定。
Description
技术领域
本发明属于植物鉴定的技术领域，具体涉及鉴别李氏重楼的方法、引物、探针及应用。
背景技术
李氏重楼（Paris liana）是黑药花科重楼属植物，多年生草本主要分布在云南，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效。
李氏重楼药用植物的传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型。从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究无疑为植物分类和鉴定提供了本质依据。随着生命科学不断取得重大突破，分子生物学鉴定方法应运而生，此类方法应用DNA分子标记技术鉴定中药原植物及其药材和饮片，取得了快速发展。DNA分子标记鉴别应用于参类药材鉴别已有不少的报道，RFLP、SSR、RAPD、AP-PCR、AFLP、ISSR、SNP等技术相继应用于药用植物的鉴别鉴定。然而这些技术除了需要进行PCR扩增还需要通过电泳或测序技术呈现鉴定结果，存在操作步骤繁琐、工作量大、人为干扰大、检测灵敏度低、特异性和实验结果重复性差等弱点，特别是在鉴定工业加工、高温烘干过的药材，难以在实际中得到应用，而逐渐退出舞台。随着分子生物学的发展和基因组时代的到来，一些新的药用植物的鉴定提供了新的方法。
实时荧光PCR技术在物种鉴定上已经是非常成熟与成功的技术，使用一组或多组特异性的引物探针，通过监测荧光强度变化达到鉴定的目的，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测效率高等优势，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的鉴定方法可靠性差、操作复杂、工作量大、实验结果重复性差等不足，提供一种鉴别李氏重楼的方法、引物、探针及应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种鉴别李氏重楼的方法，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用引物D1-F、D1-R和探针D1-probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为李氏重楼；所述引物D1-F的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物D1-R的序列如SEQ IDNo.2所示，所述探针D1-probe的序列如SEQ ID No.3所示。
上述引物和探针的序列如表1。
具体的，上述探针D1-probe的5’端修饰FAM，探针D1-probe的3’端修饰MGB。
具体的，上述模板最低检测下限为0.0001ng/μL。
具体的，上述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2xT5 Fast qPCR Mix 10μL、10uM的上游引物0.7μL、10uM的下游引物0.7μL、10uM的探针0.6μL、待测模板1μL，使用ddH2O补足至20μL反应体系。
具体的，上述实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃ 1min，一个循环；95℃ 15s，60℃1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。
本发明的第二方面提供鉴别李氏重楼的引物对，所述引物对由引物D1-F和D1-R组成，所述引物D1-F的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物D1-R的序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的第三方面提供鉴别李氏重楼的探针，所述探针D1-probe的序列如SEQ IDNo.3所示。
本发明的第四方面提供鉴别李氏重楼的试剂，含有上述的引物对和上述的探针。
本发明的第五方面提供上述试剂在鉴别李氏重楼中的应用。
表1李氏重楼引物探针序列
本发明的有益效果是：
本发明的鉴别方法及试剂具有极佳的特异性和灵敏度，通过对检测CT值的判断就能够准确地鉴定或检测重楼属中的李氏重楼，实现了对李氏重楼的快速鉴定。
附图说明
图1为本发明实施例二的标准曲线；
图2为本发明实施例二的扩增图谱；
图3为本发明实施例三的扩增图谱；
图4为本发明实施例四的扩增图谱；
图5为第一批次酶验证的扩增图谱；
图6为第二批次酶验证的扩增图谱；
图7为实验员A操作验证的扩增图谱；
图8为实验员B操作验证的扩增图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一 目标植物样品的PCR扩增及鉴定
以提取的李氏重楼的基因组DNA作为模板，采用引物D1-F和D1-R进行PCR扩增，采用探针D1-probe进行实时荧光定量PCR检测，引物D1-F的序列为AGATTTATTCAACAGAATCCCACTTAC，引物D1-R的序列为CGAGAAAGTTTTGTTTGTGTAAGAA，探针D1-probe的序列为ATCTAATATAGATATAGAAGTGAAA，探针D1-probe的5’端修饰FAM，探针D1-probe的3’端修饰MGB。其中，扩增的反应体系如表1.1所示，扩增程序如表1.2所示，扩增后获得鉴定结果与PCR产物。
表1.1 反应体系
表1.2 扩增程序
实施例二 李氏重楼标准质粒的制备和探针标准曲线的创建
根据实施例一获得的PCR产物制备阳性克隆样品，然后进行测序，选择测序结果中序列完全正确的阳性克隆样品，使用质粒提取试剂盒完成质粒的提取。
计算质粒浓度拷贝数，计算如下所示：
C=A•B-1×6.02×1014，
式中，A为质粒浓度（ng/μL），B为质粒DNA分子量，C为copies•μL-1。计算得到母液浓度：李氏重楼标准质粒（2.26*1010copies•μL 1），作为实验质粒标准品使用。
使用溶剂将李氏重楼质粒标准品稀释至2.26*1010copies•μL 1，再按10倍浓度将其稀释为5个梯度，然后分别以稀释后的各梯度质粒标准品为模板，在实施例一的反应条件下进行实时荧光定量PCR检测，每组试验重复3次，制定标准曲线。李氏重楼质粒标准品检测结果如表2所示，标准曲线如图1所示，相关扩增图谱如图2所示。
李氏重楼标准曲线方程：y = -4.1993x + 49.152；R²=0.9999；R²大于0 .98，符合实时荧光定量PCR的标准要求。
表2 李氏重楼质粒标准品检测结果
实施例三 鉴别李氏重楼的特异性验证
本实施例提供一种鉴别李氏重楼的方法，包括以下步骤：分别以李氏重楼、滇重楼以及多花重楼、高平重楼、海南重楼等十九个近缘种的基因组DNA为模板，并设立阴性对照组（ddH2O），采用实施例一的引物对、探针、反应体系及扩增程序对模板进行扩增，每个样本重复3次，检测结果如表3所示，扩增图谱如图3所示。
表3.1 特异性检测结果
表3.2 特异性检测结果
表3.3 特异性检测结果
由表3.1、3.2、3.3可见，本发明提供的引物对及探针仅与李氏重楼有扩增反应和荧光现象，特异性好，且每3个重复的CT值相近，重复性好。
实施例四 引物探针的灵敏度验证
将实施例三采用的李氏重楼样本的DNA浓度分别设置1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL、0.00001 ng/μL、0.000001ng/μL七个浓度梯度，采用实施例一的引物对、探针、反应体系及扩增程序对样本进行扩增，以测试引物对和探针的灵敏度，每个样本重复三次，并使用实时荧光定量PCR仪进行测定，检测结果如表4和图4所示。
表4引物探针灵敏度检测结果
由表4可见，本发明的引物对和探针对李氏重楼的灵敏度均较高，最低检测下限为0.0001 ng/μL，平均CT值为38.772。
实施例五 重复性验证
1.同实验员同实时荧光定量PCR仪（QuantStudio Dx)不同批次酶之间的重复性验证；
2.同批次酶同实时荧光定量PCR仪（QuantStudio Dx)不同人员操作之间的重复性验证。
样本采用野外采集经形态学及叶绿体基因组对比确认为李氏重楼的两个已知样本，采用实施例一的引物对、探针、反应体系及扩增程序，每个样本重复3次，通过计算变异系数（CV%）值来进行重复性评价。变异系数值的计算公式为：
CV=SD(标准偏差)/Mean(平均值)×100%。
同实验员同QPCR仪不同批次酶的验证结果如表5.1和表5.2所示；第一批次酶验证的扩增图谱如图5，第二批次酶验证的扩增图谱如图6，同批次酶同QPCR仪不同人员操作的验证结果如表5.3和5.4所示；实验员A操作验证的扩增图谱如图7，实验员B操作验证的扩增图谱如图8。
表5.1 同实验员同QPCR仪第一批次酶的验证结果
表5.2 同实验员同QPCR仪第二批次酶的验证结果
表5.3 同批次酶同QPCR仪实验员A操作的验证结果
表5.4 同批次酶同QPCR仪实验员B操作的验证结果
由表5.1、5.2、5.3和5.4可见，无论是同实验员同QPCR仪不同批次酶之间、同批次酶同QPCR仪不同人员操作之间，其重复性验证结果变异系数值均小于3%，实验重复性好，不同批次聚合酶稳定性优良，反应体系稳定。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.鉴别李氏重楼的方法，其特征在于：包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用引物D1-F、D1-R和探针D1-probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为李氏重楼；所述引物D1-F的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物D1-R的序列如SEQID No.2所示，所述探针D1-probe的序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的鉴别李氏重楼的方法，其特征在于：所述探针D1-probe的5’端修饰FAM，所述探针D1-probe的3’端修饰MGB。
3.根据权利要求1所述的鉴别李氏重楼的方法，其特征在于：所述模板最低检测下限为0.0001ng/μL。
4.根据权利要求1所述的鉴别李氏重楼的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2xT5 Fast qPCR Mix 10μL、10uM的上游引物0.7μL、10uM的下游引物0.7μL、10uM的探针0.6μL、待测模板1μL，使用ddH2O补足至20μL反应体系。
5.根据权利要求1所述的鉴别李氏重楼的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃ 1min，一个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。
6.鉴别李氏重楼的引物对，其特征在于：所述引物对由引物D1-F和D1-R组成，所述引物D1-F的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物D1-R的序列如SEQ ID No.2所示。
7.鉴别李氏重楼的探针，其特征在于：所述探针D1-probe的序列如SEQ ID No.3所示。
8.鉴别李氏重楼的试剂，其特征在于：含有权利要求6所述的引物对和权利要求7所述的探针。
9.权利要求8所述的试剂在鉴别李氏重楼中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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