CN106018523B - 用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法 - Google Patents

用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，包括如下步骤：步骤一、提取待检测样品的基因组DNA，利用大西洋鲑特异性引物对，以待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅰ，且大西洋鲑特异性引物对各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子；步骤二、将步骤一中得到的PCR扩增产物加于修饰有锚定受体的电极表面进行反应，锚定标记分子可被锚定受体捕获，以使带有锚定标记分子的PCR扩增产物被电极表面捕获；和步骤三、检测电化学活性标记分子的电化学信号，若存在电化学标记分子的电化学信号，则待检测样品来自于大西洋鲑。本方法适用于任何发育时期、任意形态的鱼类样本。

Description

用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，涉及一种用于鉴别鱼卵、鱼苗、成鱼、鱼肉及其制品的所属物种的检测技术，特别涉及一种用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法。
背景技术
大西洋鲑(Salmo salar)，属于鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、鲑属(Salmo)，原始栖息地为大西洋北部的温带和亚北极地区，20世纪60年代在挪威人工养殖成功，目前已经成为世界性的养殖鱼类，主要以海水网箱的形式养殖生产商品鱼，在我国水产品市场上称为“挪威三文鱼”，销售价格较高。
虹鳟(Oncorhynchus mykiss)，属于鲑形目(Salmoniformes)、鲑科(Salmonidae)、大马哈鱼属(Oncorhynchus)，原始栖息地为北美洲北部和太平洋西岸，自19世纪起就在美国开始淡水养殖，我国曾从朝鲜、美国、日本等国多次引种，目前在20多个省市区都有人工养殖，是国内养殖范围较广的冷水鱼类。
我国国内大西洋鲑养殖产量较低，但以其为原料制作的三文鱼刺身、烟熏三文鱼等产品很受消费者欢迎，因而部分不法养殖者和经营者使用虹鳟来冒充大西洋鲑：有的利用虹鳟和大西洋鲑分类学上的近缘关系，将虹鳟冠以“淡水三文鱼”的名称混淆视听，高价销售；有的向虹鳟饲料中添加色素，使原本为白色、青色的虹鳟肉呈现出类似大西洋鲑的橘红色泽，冒充进口“挪威三文鱼”销售，严重侵害消费者的知情权，甚至存在非法色素添加等健康隐患。
综上所述，迫切需要准确可靠的检测技术，用于大西洋鲑和虹鳟的物种鉴别。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法。
为此，本发明提供的技术方案为：一种用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，包括如下步骤：
步骤一、提取待检测样品的基因组DNA，利用大西洋鲑特异性引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅰ，且大西洋鲑特异性引物对各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子；
步骤二、将步骤一中得到的所述PCR扩增产物加于修饰有锚定受体的电极表面进行反应，所述锚定标记分子可被所述锚定受体捕获，以使带有锚定标记分子的PCR扩增产物被电极表面捕获；和
步骤三、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则所述待检测样品来自于大西洋鲑。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法中，所述大西洋鲑特异引物对为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，还包括：
步骤四、以步骤一中得到的所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用虹鳟特异性引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅱ，其中，所述虹鳟特异性引物对也各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子；
步骤五、将步骤四中得到的PCR扩增产物Ⅱ加入到一新的所述修饰有锚定受体的电极表面进行反应；
步骤六、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则所述待检测样品来自于虹鳟；
若在步骤六中未检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号，而在步骤三中检测到所述电化学活性分子标记的电化学信号，则所述待检测样品来自于大西洋鲑。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法中，虹鳟特异性引物对为如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的碱基序列。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，还包括：
步骤七、以步骤一中得到的所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用如SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示的碱基序列的通用引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅲ，其中，所述通用引物对也各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子；
步骤八、将步骤七中得到的PCR扩增产物Ⅲ加到另一所述修饰有锚定受体的电极表面进行反应；
步骤九、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则表明反应体系正常，鉴别结果可信，若未检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号，则表明反应体系异常，鉴别结果不可信。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法中，PCR扩增产物加到修饰有锚定受体的电极表面进行反应的步骤包括：
1)将获得的PCR扩增产物，滴加到修饰的电极表面中，于温度37℃下反应30min进行锚定反应；
2)对电极表面未结合的分子进行洗脱，洗脱条件为利用pH 7.0的Tris-EDTA缓冲液洗脱3次，每次洗脱5min；
3)以铂丝为对电极，以Ag/AgCl为参比电极，pH 7.0磷酸缓冲液为支持电解质，初始电位设为0mV，折回电位设为+600mV，扫描速度设为50mV/s，测定工作电极的循环伏安曲线。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法中，所述PCR反应的条件为：退火温度60℃，延伸时间90s，循环次数25次。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法中，步骤二中，所述待检测样品组织为鱼鳍或鱼肉。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法中，所述电化学活性标记分子为二茂铁，所述锚定标记分子为生物素。
优选的是，所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法中，检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号指检测到呈现所述电化学活性标记分子的氧化还原峰。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明提供了一种准确可靠的大西洋鲑和虹鳟鉴定技术，适用于处在生活史任何阶段、任意形态的鱼类样本，包括鱼卵、鱼苗、成鱼、冰鲜鱼肉、冷冻鱼肉、烟熏制品，以及其它DNA未完全降解的组织和制品。
本发明中PCR扩增靶标为核基因组肌红蛋白基因，规避了常规物种鉴定技术中DNA条形码来源于线粒体基因组的母系遗传特征，能够避免人工养殖中杂交制种对检测结果的误导。
本发明基于电化学生物传感检测原理，易于集成化，可在其基础上构建芯片进行高通量多位点快速检测。
本发明不使用任何有毒有害试剂，检测操作全程不存在人身健康或环境污染隐患。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中大西洋鲑特异性引物的基因组位置比对图，序列右侧数字表示该序列在相应物种肌红蛋白基因上的位置，序列下方柱状图显示序列保守性，箭头指示引物方向(5’至3’)；
图2为本发明中虹鳟特异性引物的基因组位置比对图，序列右侧数字表示该序列在相应物种肌红蛋白基因上的位置，序列下方柱状图显示序列保守性，箭头指示引物方向(5’至3’)；
图3为本发明中通用引物的基因组位置比对图，序列右侧数字表示该序列在相应物种肌红蛋白基因上的位置，序列下方柱状图显示序列保守性，箭头指示引物方向(5’至3’)；
图4为本发明的检测流程示意图；
图5为本发明检测大西洋鲑样品的循环伏安信号，细实线表示大西洋鲑引物扩增产物检测信号，粗虚线表示虹鳟引物扩增产物检测信号，点线表示通用引物扩增产物检测信号；
图6为本发明检测虹鳟样品的循环伏安信号，细实线表示大西洋鲑引物扩增产物检测信号，粗虚线表示虹鳟引物扩增产物检测信号，点线表示通用引物扩增产物检测信号。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种基于生物传感原理的检测技术，使用物种特异性引物对待测样品基因组DNA进行扩增，同时向扩增产物两端分别引入电化学活性标记和锚定标记，然后利用锚定标记将扩增产物捕获在电极表面，检测电极表面的电化学活性，从而准确判定样品的物种来源。
本发明中，大西洋鲑特异性引物、虹鳟特异性引物、大西洋鲑和虹鳟通用引物的扩增靶标均位于核基因组肌红蛋白基因的外显子区。在同一物种中，基因的外显子区域保守程度较高，因而适用于作为物种鉴定的依据。从NCBI下载大西洋鲑和虹鳟基因组参考序列，对其基因区进行序列相似性BLAST比对，获取差异最显著的1％基因列表，从中选择研究较为深入、注释清晰的基因，最终确定肌红蛋白基因为靶基因。在两个物种肌红蛋白基因外显子区的差异序列处分别设计大西洋鲑特异性引物和虹鳟特异性引物，在保守区设计大西洋鲑和虹鳟通用引物，将引物序列在大西洋鲑和虹鳟基因组内进行BLAST比对，证实不存在非特异性扩增。各引物序列及其基因组位置如图1-3所示。
本发明中，正向引物带有电化学活性标记，反向引物带有锚定标记，标记均位于引物5’端，不影响PCR反应的进行，PCR扩增成功的DNA片段将在两端分别带有电化学活性标记和锚定标记，能够被偶联有锚定受体的电极表面所捕获，并产生电化学信号。而未成功扩增的正向引物和模板DNA将被洗脱，无法留在电极表面，带有锚定标记的反向引物虽然也能竞争性结合在电极表面，但不带有电化学活性标记，因而无法产生电化学信号。检测流程和原理如图4所示。
本发明中，大西洋鲑和虹鳟通用引物的作用是充当正对照，指示所有实验流程操作成功，若通用引物检测电极无信号，提示应排查DNA是否降解、DNA提取是否成功、PCR反应是否成功等操作问题。
本发明提供一种用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，包括如下步骤：
骤一、提取待检测样品的基因组DNA，利用大西洋鲑特异性引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅰ，且大西洋鲑特异性引物对各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子；
步骤二、将步骤一中得到的所述PCR扩增产物加于修饰有锚定受体的电极表面进行反应，所述锚定标记分子可被所述锚定受体捕获，以使带有锚定标记分子的PCR扩增产物被电极表面捕获；和
步骤三、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则所述待检测样品来自于大西洋鲑。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，还包括：
步骤四、以步骤一中得到的所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用虹鳟特异性引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅱ，其中，所述虹鳟特异性引物对也各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子；
步骤五、将步骤四中得到的PCR扩增产物Ⅱ加入到一新的所述修饰有锚定受体的电极表面进行反应；
步骤六、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则所述待检测样品来自于虹鳟；
若在步骤六中未检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号，而在步骤三中检测到所述电化学活性分子标记的电化学信号，则所述待检测样品来自于大西洋鲑。
故此，在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述大西洋鲑特异引物对为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，虹鳟特异性引物对为如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的碱基序列。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，该用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，还包括：
步骤七、以步骤一中得到的所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用如SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示的碱基序列的通用引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅲ，其中，所述通用引物对也各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子；
步骤八、将步骤七中得到的PCR扩增产物Ⅲ加到另一所述修饰有锚定受体的电极表面进行反应；
步骤九、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则表明反应体系正常，鉴别结果可信，若未检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号，则表明反应体系异常，鉴别结果不可信。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，PCR扩增产物加到修饰有锚定受体的电极表面进行反应的步骤包括：
1)将获得的PCR扩增产物，滴加到修饰的电极表面中，于温度37℃下反应30min进行锚定反应；
2)对电极表面未结合的分子进行洗脱，洗脱条件为利用pH 7.0的Tris-EDTA缓冲液洗脱3次，每次洗脱5min；
3)以铂丝为对电极，以Ag/AgCl为参比电极，pH 7.0磷酸缓冲液为支持电解质，初始电位设为0mV，折回电位设为+600mV，扫描速度设为50mV/s，测定工作电极的循环伏安曲线。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述PCR反应的条件为：退火温度60℃，延伸时间90s，循环次数25次。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤二中，所述待检测样品组织为鱼鳍或鱼肉。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述电化学活性标记分子为二茂铁，所述锚定标记分子为生物素。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号指检测到呈现所述电化学活性标记分子的氧化还原峰。
各引物序列如下：
SEQ ID NO:1：ACTCTCCCCTACTACCCACCT
SEQ ID NO:2：TGTCCTATCCCTGTGACCTCT
SEQ ID NO:3：CCGTTTACAGGCTCGGCTTA
SEQ ID NO:4：AATCCTAGTGGAGGGGAGAGG
SEQ ID NO:5：CAGTGGAGGCTGACTACAACAA
SEQ ID NO:6：GATGCCTGCGAACTTAGGGAA
实施例1
1.基因组DNA提取
取鳍条或肌肉组织约100mg，使用海洋动物基因组DNA提取试剂盒(天根DP324-03)，按照说明书步骤提取基因组DNA，溶于100μL灭菌去离子水，紫外分光光度计测定浓度。
2.PCR扩增
定制合成碱基序列如SEQ ID NO：1-6所示引物(上海生工)，其中SEQ ID NO：1、3、5引物5’端带有二茂铁修饰，SEQ ID NO：2、4、6引物5’端带有生物素修饰。
在3个PCR管中分别扩增大西洋鲑特异性引物(SEQ ID NO：1-2)，虹鳟特异性引物(SEQ ID NO：3-4)，通用引物(SEQ ID NO：5-6)，PCR反应体系如下：
PCR程序为
3.电极表面修饰
使用Au2O3粉末对金电极进行抛光，超声波清洗5min，浸入纳米金溶液(Sigma，柠檬酸钠还原氯金酸法制备，粒径30nm)，+1.55V电位下沉积15min，静置5min，灭菌去离子水清洗。
电极表面浸入含10mMα-硫辛酸的乙醇溶液活化20min，移入浓度为100g/L的EDC/NHS混合液活化羧基，向电极表面滴加0.2g/L的亲和素50μL，偶联30min，去离子水洗脱未结合亲和素。超净台风干后可4℃长期保存，12个月内均可用于检测。短期保存可置于室温pH7.0磷酸缓冲液中。
将3管PCR扩增产物，分别滴加在3支修饰电极表面，37℃温育30min。
将DNA修饰电极浸入pH 7.0Tris-EDTA缓冲液，洗脱5min，换新的缓冲液重复2次。
4.电化学信号检测
采用三电极测试系统，以DNA修饰电极为工作电极，铂丝(直径1mm)为对电极，Ag/AgCl为参比电极，20mL pH 7.0磷酸缓冲溶液为支持电解质，分别测定3支电极的循环伏安曲线，初始电位设为0mV，折回电位设为+600mV，扫描速度设为50mV/s，记录3个循环中的第3个。
大西洋鲑样品检测结果如图5所示，黑色细实线表示大西洋鲑引物扩增产物修饰电极信号，红色粗虚线表示虹鳟引物扩增产物修饰电极信号，蓝色点线表示通用引物扩增产物修饰电极信号，大西洋鲑引物和通用引物电极均呈现明显的氧化还原峰，而虹鳟引物电极无氧化还原峰。
虹鳟样品检测结果如图6所示，黑色细实线表示大西洋鲑引物扩增产物修饰电极信号，红色粗虚线表示虹鳟引物扩增产物修饰电极信号，蓝色点线表示通用引物扩增产物修饰电极信号，虹鳟引物和通用引物电极均呈现明显的氧化还原峰，而大西洋鲑引物电极无氧化还原峰。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.一种用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、提取待检测样品的基因组DNA，利用大西洋鲑特异性引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅰ，且大西洋鲑特异性引物对各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子，所述大西洋鲑特异引物对为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的碱基序列；
步骤二、将步骤一中得到的所述PCR扩增产物加于修饰有锚定受体的电极表面进行反应，所述锚定标记分子可被所述锚定受体捕获，以使带有锚定标记分子的PCR扩增产物被电极表面捕获；和
步骤三、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则所述待检测样品来自于大西洋鲑；
还包括：
步骤四、以步骤一中得到的所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用虹鳟特异性引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅱ，其中，所述虹鳟特异性引物对也各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子，虹鳟特异性引物对为如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的碱基序列；
步骤五、将步骤四中得到的PCR扩增产物Ⅱ加入到一新的所述修饰有锚定受体的电极表面进行反应；
步骤六、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则所述待检测样品来自于虹鳟；
若在步骤六中未检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号，而在步骤三中检测到所述电化学活性分子标记的电化学信号，则所述待检测样品来自于大西洋鲑。
2.如权利要求1所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，其特征在于，还包括：
步骤七、以步骤一中得到的所述待检测样品的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的碱基序列的通用引物对，以所述待检测样品的基因组DNA为模板进行PCR反应，得到待检测样品的PCR扩增产物Ⅲ，其中，所述通用引物对也各自分别于碱基序列的上游带有电化学活性标记分子和锚定标记分子；
步骤八、将步骤七中得到的PCR扩增产物Ⅲ加到另一所述修饰有锚定受体的电极表面进行反应；
步骤九、检测所述电化学活性标记分子的电化学信号，若存在所述电化学标记分子的电化学信号，则表明反应体系正常，鉴别结果可信，若未检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号，则表明反应体系异常，鉴别结果不可信。
3.如权利要求1或2任一所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，其特征在于，PCR扩增产物加到修饰有锚定受体的电极表面进行反应的步骤包括：
1)将获得的PCR扩增产物，滴加到修饰的电极表面中，于温度37℃下反应30min进行锚定反应；
2)对电极表面未结合的分子进行洗脱，洗脱条件为利用pH 7.0的Tris-EDTA缓冲液洗脱3次，每次洗脱5min；
3)以铂丝为对电极，以Ag/AgCl为参比电极，pH 7.0磷酸缓冲液为支持电解质，初始电位设为0mV，折回电位设为+600mV，扫描速度设为50mV/s，测定工作电极的循环伏安曲线。
4.如权利要求1或2任一所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：退火温度60℃，延伸时间90s，循环次数25次。
5.如权利要求1所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，其特征在于，步骤二中，所述待检测样品组织为鱼鳍或鱼肉。
6.如权利要求1所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，其特征在于，所述电化学活性标记分子为二茂铁，所述锚定标记分子为生物素。
7.如权利要求1所述的用于鉴别大西洋鲑和虹鳟的生物传感检测方法，其特征在于，检测到所述电化学活性标记分子的电化学信号指检测到呈现所述电化学活性标记分子的氧化还原峰。
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