CN111494360A - 朝藿定c治疗糖尿病肝损伤的药物应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的药物应用，属于生物医药技术领域。本发明首次公开了朝藿定C能够提升糖尿病模型动物肝脏中高密度脂蛋白胆固醇水平，降低肝脏中低密度脂蛋白胆固醇水平，缓解脂质代谢紊乱问题，降低肝脏指数，增强肝脏中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力，降低丙二醛含量，改善肝脏氧化应激状态，维护肝细胞、组织正常形态和结构，降低肝脏中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力水平，促进肝功能修复，因此可用于制备治疗糖尿病肝损伤的药物。朝藿定C制备治疗糖尿病肝损伤的药物以药用制剂的形式使用，包括口含片、包衣片和硬胶囊。本发明为糖尿病肝损伤治疗提供了依据，也为淫羊藿资源深度开发利用提供了思路。

Description

朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的药物应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及朝藿定C治疗糖尿病性肝损伤并发症(简称糖尿病肝损伤)的新作用，及其在制备糖尿病肝损伤治疗药物中的应用。

背景技术

近年来，糖尿病的发病率逐年升高，己经成为继心脑血管疾病、肿瘤之后严重危害人类生命健康的第三大疾病。糖尿病并发症是患者致残、致死的重要原因。肝脏作为糖、脂质代谢的重要器官，与糖尿病之间存在着极其密切的关系。糖尿病可能造成肝脏多个方面的损伤，引发肝损伤并发症。由于糖尿病肝损伤的临床症状不典型等原因，以往未得到医药界的重视。近年来，随着糖尿病患者终末期肝病死亡率的增加，糖尿病肝损伤逐渐引起了人们的关注。但是，迄今国内外缺乏专门的糖尿病肝损伤治疗药物，给其防控造成了很大困难。糖尿病肝损伤对健康的巨大危害，使得其治疗药物研发成为紧迫而重要的科研攻关课题。

朝藿定C(epimedin C)是一种具有8-异戊烯基的黄酮醇糖苷，分子式为C₃₉H₅₀O₁₇，结构式如下：

朝藿定C分布于巫山淫羊藿(Epimedium wushanense)、朝鲜淫羊藿(Epimediumkoreanum)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum)、心叶淫羊藿(Epimedium brevicornu)和柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens)等淫羊藿属(Epimedium L.)植物中。淫羊藿始载于《神农本草经》，列为中品，其性温，味辛、甘，归肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨和祛风湿作用，用于治疗肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛和麻木拘挛。现代研究发现，淫羊藿含有黄酮类化合物(flavonoids)、多糖(polysaccharides)、生物碱(alkaloids)、木脂素(lignans)、萜类化合物(terpenoids)、绿原酸(chlorogenic acid)、微量元素、必需氨基酸等多种营养成分或活性物质，其中黄酮类化合物被认为是淫羊藿的主要有效成分。目前已经从淫羊藿中发现了近百种黄酮类化合物，朝藿定A₁(epimedin A₁)、朝藿定A(epimedinA)、朝藿定B(epimedin B)、朝藿定C和淫羊藿苷(icariin)等都是淫羊藿中的黄酮类化合物单体。有学者将淫羊藿与其它中药材配伍用来治疗糖尿病，但是关于淫羊藿治疗糖尿病的物质基础并不明了，尚未完全揭示具体何种黄酮类化合物单体能够有效治疗糖尿病，也未见使用淫羊藿黄酮类化合物单体治疗糖尿病性肝损伤并发症的报道。

现有技术中，专利CN108704115A公开了一种治疗2型糖尿病(II型糖尿病)的中药组方及制作方法，所述中药组方由黄连、人参、西洋参、天花粉、生地、山药、芡实、当归、干姜、吴茱萸、黄柏、乌梅、淫羊藿、山萸肉、枸杞、杜仲、黄精、核桃仁、补骨脂、五味子、茯苓、香附、通草和肉桂制成。专利CN108853342A公开了一种治疗糖尿病的中药提取物和制备方法，将黄精、黄芪、西洋参、麦冬、生山药、野葛根、苦瓜、杞果、玉竹、山芋肉、桑椹、鬼箭羽、淫羊藿、生地、熟地、决明子、盐菟丝子、肉桂、天花粉、地骨皮、香蕉、葡萄皮和葡萄籽配伍，经过超微粉碎、加水煎煮、醇提、浓缩、发酵等工艺制成中药制剂。专利CN103487516B公开了一种中药组合物制剂指纹图谱的测定方法，该中药组合物由人参、黄精、苍术、苦参、茯苓、麦冬、制何首乌、地黄、山茱萸、黄连、淫羊藿等组成，可有效治疗糖尿病，该方法采用超高压液相色谱法控制该中药组合物的质量。专利CN108403868A公开了一种二仙药对的应用及含有二仙药对的治疗糖尿病骨质疏松的药物，由淫羊藿和仙茅配比制成，可以治疗糖尿病的骨质疏松并发症。论文《淫羊藿治疗糖尿病及其并发症》将淫羊藿与黄芪、太子参等配伍治疗糖尿病及其末梢神经炎并发症(发表于《中医杂志》2000年第1期第10页)。专利CN109432223A公开了一种预防和/或治疗脂肪肝的中药组合物及其应用，所述中药组合物由红参、大黄、黄芪、淫羊藿、川芎、生地、茵陈、垂盆草和鳖甲制成，可用于治疗脂肪肝和II型糖尿病合并非酒精性脂肪肝。专利CN101513427A公开了朝藿定C在制备治疗骨质疏松药物中的用途。

总体上看，现有技术各有特色，其特点和局限性如下：

(1)多数现有技术将淫羊藿药材与其它药材配伍制成中成药或中药复方制剂，用于糖尿病及其并发症防治，未见单独使用淫羊藿药材、淫羊藿提取物或者淫羊藿黄酮类化合物单体治疗糖尿病及其并发症的报道。

(2)多数现有技术将淫羊藿或其提取物用作糖尿病、骨质疏松等疾病防治，鲜见将淫羊藿或其提取物应用于糖尿病性肝损伤并发症治疗的报道。

(3)有的现有技术将淫羊藿总黄酮或淫羊藿提取物同其它中药提取物组合后用于糖尿病及其并发症防治，但是未见将朝藿定C这种黄酮类化合物单体用于糖尿病及其并发症治疗的任何相关报道。淫羊藿中含有黄酮类化合物、多糖、生物碱、木脂素、萜类化合物、绿原酸等多种物质，仅黄酮类化合物就有近百种单体。现有技术难以揭示淫羊藿应用于糖尿病及其并发症治疗的物质基础，故此说明，现有技术并无关于朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的作用的报道。

(4)多数现有技术在制备含有淫羊藿药材、总黄酮或提取物的药物制剂时，未充分考虑药物口感和生物利用度。有的现有技术直接将药材粉碎、水煮后制成药丸或药膏，味道苦涩，难以下咽；有的现有技术为了调整药物口感，加入了蔗糖或蜂蜜等不适于糖尿病人食用的甜味剂；有的现有技术未考虑到药物有效成分对唾液淀粉酶的抑制作用，未涉及口含片制备，不利于发挥有效成分对α-淀粉酶的抑制功效。有的现有技术在制备胶囊剂时使用淀粉作为填充物料辅料，糖尿病人服用后可能出现血糖陡增甚至病情加重的情况。

因此，可以看出，上述现有技术报道了关于朝藿定C具有抗肿瘤、调节免疫、防治骨质疏松等活性。但迄今未见有关朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的作用及其用于制备治疗糖尿病肝损伤药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的药物应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了朝藿定C在制备治疗糖尿病肝损伤的药物中的应用。

所述用于治疗糖尿病肝损伤的化合物朝藿定C是一种具有8-异戊烯基的黄酮醇糖苷，分子式为C₃₉H₅₀O₁₇。朝藿定C在自然界中分布于淫羊藿属植物，运用常规的分离纯化技术能够制得朝藿定C纯品，运用化学合成方法也可制备，该原料亦可直接购买得到。

本发明涉及的糖尿病肝损伤的临床表现为：肝脏中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量降低，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量升高；肝脏指数升高；肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力下降，丙二醛(MDA)水平升高；肝细胞、组织形态和结构出现病变；肝脏中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活力升高。通常，糖尿病肝损伤也具有糖尿病的典型临床表现，即空腹血糖水平升高以及饮水量增加、饮食量增加、排尿量增多、体重减少的“三多一少”症状。

本发明提供了朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的新作用，即朝藿定C可以改善糖尿病肝损伤的临床表现。具体地讲，朝藿定C能够提升肝脏中HDL-C水平，降低LDL-C水平，缓解糖尿病小鼠脂质代谢紊乱问题，降低肝脏指数，增强肝脏中SOD、GSH-Px活力，降低MDA水平，改善肝脏氧化应激状态，维护肝细胞、组织正常形态和结构，降低肝脏中ALT和AST活力水平，促进肝功能修复，对肝脏具有明显的保护作用。

本发明还公开了一种治疗糖尿病肝损伤的药物，所述的药用制剂由朝藿定C作为活性成分与药学上可接受的辅料(如甜味剂)、载体(如适宜于胃肠内给药的无机或有机固体或液体赋形剂)相混合或相结合制成，该药用制剂可以为口含片、包衣片、硬胶囊。

优选地，所述的剂型为口含片、包衣片和硬胶囊。

进一步优选地，在制备朝藿定C口含片时，可以使用湿润剂、粘合剂、润滑剂和甜味剂。所述甜味剂为阿拉伯糖、甜菊糖苷的一种或两种的混合物，不得使用蔗糖、蜂蜜等作为甜味剂。所述湿润剂、粘合剂、润滑剂和甜味剂不会对糖尿病人健康产生负面影响。朝藿定C口含片的制备方法包括原料称量与预处理、制软材、制粒和压片等步骤。

进一步优选地，在制备朝藿定C包衣片时，可以使用湿润剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂和包衣剂(包衣液)。所述粘合剂为蒸馏水，不得使用淀粉浆作为粘合剂。所述甜味剂为甜菊糖苷，不得使用蔗糖等作为甜味剂。所述湿润剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂和甜味剂不会对糖尿病人健康产生负面影响。朝藿定C包衣片的制备方法包括原料称量与预处理、片芯的制备、包衣液的配制和包衣等步骤。

进一步优选地，在制备朝藿定C硬胶囊时，使用明胶硬胶囊壳作为载体，使用膳食纤维作为填充物料辅料，不得使用淀粉作为填充物料辅料。所述填充物料辅料、胶囊壳不会对糖尿病人健康产生负面影响。朝藿定C硬胶囊的制备方法包括原料称量与预处理、填充物料的准备和填充胶囊等步骤。

上述药用制剂可按照各种制剂常规制备工艺制成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明首次公开了朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的作用，通过大量的试验研究发现，朝藿定C对α-葡萄糖苷酶受体有较高的分子对接亲和活性，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有较好的抑制作用，能够有效缓解糖尿病小鼠“三多一少”的典型症状，提升糖尿病小鼠肝脏中HDL-C水平，降低肝脏中LDL-C水平，缓解糖尿病小鼠脂质代谢紊乱问题，降低肝脏指数，改善肝脏氧化应激状态，维护肝细胞、组织正常形态和结构，促进肝功能修复，具有治疗糖尿病肝损伤的作用。目前治疗糖尿病肝损伤的专用药物十分缺乏，本发明推进了糖尿病肝损伤治疗药物研发进程，为糖尿病肝损伤的治疗提供了依据。

(2)本发明涉及的能够治疗糖尿病肝损伤的黄酮类化合物单体朝藿定C物质结构清晰，疗效确切，易于分析检测，在糖尿病肝损伤治疗实践中应用可行性较高。有关朝藿定C定性、定量分析的研究报道很多，现代分析化学技术能够对朝藿定C进行准确、精密的分析检测。同淫羊藿总黄酮或提取物相比，本发明明确的药用成分朝藿定C的化合物组成单一(单体)，化学结构明了，对糖尿病肝损伤的治疗效果确切，容易进行分析检测和质量控制，因此更加适用于糖尿病肝损伤临床治疗实践。

(3)本发明涉及的能够治疗糖尿病肝损伤的朝藿定C是一种具有8-异戊烯基的黄酮醇糖苷，在淫羊藿属植物中自然分布。已有学者将淫羊藿与其它药材配伍组成复方应用于糖尿病防治，也有学者将淫羊藿提取物或淫羊藿总黄酮与其它中药材提取物组合后用于糖尿病防治。但是淫羊藿中含有黄酮类化合物、多糖、生物碱、木脂素、萜类化合物、绿原酸等多种物质，仅黄酮类化合物就有近百种单体，因此现有技术难以揭示淫羊藿应用于糖尿病治疗的物质基础，也没有确认朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的作用。本发明通过试验研究发现了朝藿定C治疗糖尿病肝损伤的新作用，有助于阐明淫羊藿防治糖尿病及其并发症的物质基础，可为淫羊藿资源的深度开发利用提供思路。

(4)本发明提供了朝藿定C在制备糖尿病肝损伤治疗药物中的应用。朝藿定C制备治疗糖尿病肝损伤的药物以药用制剂的形式使用。所述药用制剂可以为口含片、包衣片、硬胶囊。在药用制剂制备过程中所用的载体、辅料不会对糖尿病人健康产生负面影响。在口含片制备中，所用的甜味剂为阿拉伯糖、甜菊糖苷的一种或两种的混合物。研究表明，阿拉伯糖、甜菊糖苷甜味纯正，安全性高，在人体的代谢无需胰岛素参与，具有一定的辅助降血糖作用。朝藿定C口含片不使用蔗糖、蜂蜜等营养性甜味剂，而选用阿拉伯糖、甜菊糖苷作为甜味剂，有利于糖尿病患者康复。另外，由于朝藿定C具有较强的α-淀粉酶抑制活性，而唾液中淀粉酶较多，因此口含片在发挥α-淀粉酶抑制作用方面具有独特优势。在制备朝藿定C硬胶囊时，使用膳食纤维作为填充物料辅料，不使用淀粉作为填充物料辅料。淀粉在体内水解消化后容易产生葡萄糖，影响糖尿病人血糖水平，而膳食纤维不能被人体消化吸收，适于糖尿病人食用。在制备朝藿定C包衣片时，不使用蔗糖等营养性甜味剂，而选用甜菊糖苷作为甜味剂，具有一定的辅助降血糖作用。包衣片不使用淀粉浆作为粘合剂，而选用蒸馏水作为粘合剂，有助于保护糖尿病患者健康。此外，口含片、包衣片、硬胶囊3种制剂形式均可有效解决朝藿定C味道极苦的口感问题，更加适于患者服用。

附图说明

图1为朝藿定C与受体蛋白的对接模式分析图；

图2为朝藿定C与与受体蛋白的对接模式二维分析图；

图3为朝藿定C对α-淀粉酶的抑制曲线；

图4为朝藿定C对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线；

图5为朝藿定C对II型糖尿病小鼠饮水量的影响；

图6为朝藿定C对II型糖尿病小鼠饮食量的影响；

图7为朝藿定C对II型糖尿病小鼠体重的影响；

图8为小鼠肝脏组织切片分析。图中，A、B、C、D、E、F、G和H分别代表NC组(正常组)、MC组(模型组)、PC1组(二甲双胍组)、PC2组(格列美脲组)、EC30组(30mg/kg朝藿定C组)、EC20组(20mg/kg朝藿定C组)、EC10组(10mg/kg朝藿定C组)和EC5组(5mg/kg朝藿定C组)。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等以及它们的任何变形是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合实施例对本发明做进一步详细描述：

实施例1：朝藿定C口含片的制备

一种治疗糖尿病肝损伤的朝藿定C口含片，其处方由以下质量百分比的组分制成：朝藿定C为65％，阿拉伯糖为9.8％，甜菊糖苷为0.1％，微晶纤维素为15％，羟丙甲纤维素为9％，硬脂酸镁为1％，无水乙醇为0.1％。

朝藿定C口含片的制备方法是：

步骤1，原料称量与预处理：按照既定的质量百分比分别称取朝藿定C、阿拉伯糖、甜菊糖苷、微晶纤维素、羟丙甲纤维素和硬脂酸镁，过60目筛。

步骤2，制软材：取朝藿定C，加入阿拉伯糖和甜菊糖苷，用无水乙醇做润湿剂，搅拌均匀后加入微晶纤维素和羟丙甲纤维素，搅拌均匀，制成软材。

步骤3，制粒：将制好的软材投入旋转式造粒机中造粒，然后置于60℃鼓风干燥箱中干燥约1h，过20目筛整粒。

步骤4，压片：向颗粒中撒入硬脂酸镁，混合均匀后用旋转式压片机压片，即得朝藿定C口含片。

实施例2

实施例2：朝藿定C包衣片的制备

一种治疗糖尿病肝损伤的朝藿定C包衣片，其处方由以下质量百分比的组分制成：朝藿定C为49.8％，微晶纤维素为15％，硬脂酸镁为1％，羟丙甲纤维素为5％，甜菊糖苷0.2％，甘油为1％，滑石粉为1％，蒸馏水为27％。

朝藿定C包衣片的制备方法是：

步骤1，原料称量与预处理：按照既定的质量百分比分别称取朝藿定C、微晶纤维素、硬脂酸镁和羟丙甲纤维素，过60目筛。

步骤2，片芯的制备：取朝藿定C，加入微晶纤维素和羟丙甲纤维素，混合均匀，用蒸馏水作为粘合剂制软材，然后将湿颗粒放入60℃鼓风干燥箱中干燥约1h，撒入硬脂酸镁后压片。

步骤3，包衣液的配制：取羟丙甲纤维素和甜菊糖苷，用蒸馏水溶解，加入甘油、滑石粉，搅拌均匀，过夜。

步骤4，包衣：将包衣液过100目筛，利用传统的包衣锅进行包衣，制得朝藿定C包衣片。包衣工艺参数为：进风温度38-40℃，片床温度34-38℃，喷枪-片床距离7-9cm，喷液流速0.6-0.9mL/min。

实施例3：朝藿定C硬胶囊的制备

一种治疗糖尿病肝损伤的朝藿定C胶囊剂，其处方由以下质量百分比的组分制成：朝藿定C为70％，膳食纤维为30％。另外，需要药用明胶硬胶囊壳若干。

朝藿定C硬胶囊的制备方法是：

步骤1，原料称量与预处理：按照既定的质量百分比分别称取朝藿定C和膳食纤维，过60目筛。

步骤2，填充物料的准备：将朝藿定C和膳食纤维混合均匀。

步骤3，填充胶囊：采用自由流入方法使填充物料进入胶囊壳，然后套合胶囊帽，即得朝藿定C硬胶囊。

以下通过试验例进一步阐明本发明所述的朝藿定C对糖尿病肝损伤的治疗效果：

一、朝藿定C与α-葡萄糖苷酶的分子对接

受体蛋白处理方法：选择α-葡萄糖苷酶晶体结构(PDB ID：3W37)作为受体蛋白，蛋白从Protein Data Bank数据库中获得，经加氢、准备、赋予力场后，定义原配体的位置为活性位点，根据原配体大小，定义活性口袋的半径为9.627148。

配体小分子处理方法：以朝藿定C为配体分子，利用Discovery Studio软件生成化合物的立体结构，经加氢、赋予力场后，保存为SD格式，备用。

分子对接方法：采用Discovery Studio平台的CDocker模块将朝藿定C和α-葡萄糖苷酶进行分子对接，根据其对接位点数和对接亲和能的大小进行打分。分子对接的结果以对接能作为对接分值的打分指标，对接能的负绝对值越大，证明受体与底物的对接亲和力越大，同时也预计小分子与受体结合的活性越高。

实验结果：朝藿定C与α-葡萄糖苷酶的分子对接结果如表1和图1、图2所示。可知，配体分子能够与蛋白的氨基酸残基ASP232、ASN237、ASP469、LYS506、ARG552和ASP568形成分子间氢键，与氨基酸残基PHE601、ALA602和ALA628产生疏水作用，与TRP329形成π-孤对电子作用力，配体与蛋白所形成的复合物结合稳定(图1、图2)，相互作用能量打分较好(表1)。

表1朝藿定C与酶蛋白的分子对接结果

二、朝藿定C对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用

朝藿定C标准品：本发明试验例所用的朝藿定C购自中国药品生物制品检定所。

朝藿定C对α-淀粉酶的抑制作用实验方法：实验设置测定组、空白组、背景组和对照组，每组先加入50μL的PBS缓冲液，40℃下预热5min，测定组和空白组分别加入50μL不同浓度的朝藿定C溶液，背景组和对照组则加入50μL的蒸馏水。测定组和与背景组中加入10μL的α-淀粉酶溶液，其余组则加入10μL的蒸馏水。所有组别的离心管混匀后于40℃水浴7.5min，分别加入50μL的碘稀释液，最后用蒸馏水定容至300μL，于660nm处用酶标仪测定吸光度，按照以下公式计算酶活和抑制率，并计算半抑制浓度(IC₅₀)，实验重复测定3次，取平均值。采用阿卡波糖作为阳性对照，实验步骤同上。

α-淀粉酶抑制率＝(总酶活-酶活)/酶活*100％

α-淀粉酶活力＝(Ab-Au)/Ab*800(式中，Ab为空白组和背景组吸光度之差，Au为测定组和对照组吸光度之差)

朝藿定C对α-葡萄糖苷酶的抑制作用实验方法：实验设置测定组、对照组和空白组，其中，测定组加入50μL不同浓度的朝藿定C溶液后加入50μL磷酸缓冲液，空白组加入50μL不同浓度的朝藿定C溶液后加入200μL磷酸缓冲液，对照组中加入100μL的磷酸缓冲液。测定组与对照组加入50μL的α-葡萄糖苷酶溶液后再加入100μL 5mmol/L的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)。用磷酸缓冲液定容体积后将3组处理置于37℃水浴保温15min，然后迅速加入750μL0.1mol/L的Na2CO3溶液终止反应，于405nm处用酶标仪测定吸光度。采用阿卡波糖作为阳性对照，实验重复3次，取平均值。按照以下公式计算朝藿定C对α-葡萄糖苷酶的抑制率并计算IC₅₀。

α-葡萄糖苷酶抑制率＝[1-(Au-Ab)/Ao]*100％(式中，Au、Ab、Ao分别代表测定组、空白组、对照组吸光度)

实验结果：由图3和图4可见，朝藿定C对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，并且呈现出明显的剂量依赖性。随着朝藿定C浓度的增加，其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率也逐渐增加。表2为朝藿定C对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用拟合方程与IC₅₀值。当朝藿定C浓度为2mg/mL时，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率高达到91％(图4)。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是糖分解代谢的重要催化剂，可将食物中的淀粉分解成小分子糖类，从而升高餐后血糖水平。通过调控相关酶活力控制餐后血糖水平，对于糖尿病防治具有重要的现实意义。一些α-葡萄糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖)已经应用于糖尿病治疗实践。本研究证明，朝藿定C具有较好α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性，提示其在糖尿病防治中具有应用潜力。

表2朝藿定C对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用拟合方程与IC₅₀值

三、朝藿定C对II型糖尿病(T2DM)小鼠“三多一少”典型症状的影响

实验动物：昆明种小鼠120只，4-5周龄，体重16-20g，雌雄各半，由西安交通大学实验动物中心提供，并通过伦理学审查。

小鼠模型的制备和分组处理方法：采用实验鼠普通饲料适应性饲养小鼠1周后，逐一称重，随机分成2个类群：实验类群110只，正常类群(正常组，NC组)10只。实验类群饲喂糖尿病小鼠专用饲料(高糖高脂饲料)，正常类群继续饲喂实验鼠普通饲料。5周后所有小鼠禁食不禁水12h(过夜)，测空腹血糖(FBG)并称重，然后给实验类群小鼠腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)，正常类群给予等体积的生理盐水。72h后禁食12h，测定小鼠空腹血糖，将FBG≥11.0mmol·L^-1的小鼠确定为T2DM小鼠。将造模成功的T2DM小鼠随机分为7组：模型组(MC组)，二甲双胍、格列美脲组(PC1、PC2组)(阳性对照)，5、10、20、30mg/kg朝藿定C组(EC5、EC10、EC20、EC30组)。其中，二甲双胍组、格列美脲组和朝藿定C组分别给予相应药物治疗。给药期间，除正常组外，其余小鼠继续采用糖尿病专用饲料喂养，实验期间观察、记录小鼠的被毛、精神状态以及排尿量，测量、记录饮食、饮水量，每隔一周测定一次空腹血糖值。

统计学处理方法：使用SPSS13.0软件进行组间、组内实验数据的统计分析，实验结果以平均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用One-Way ANOVA分析方法，P<0.05和P<0.01分别表示差异显著和极显著。

实验结果：研究发现，T2DM模型小鼠在给药之前均出现了空腹血糖水平升高的现象(数据未列出)，饮水量增加(图5)，饮食量增加(图6)，排尿量增多(数据未列出)，体重减少(图7)，表现出明显的“三多一少”症状。与NC组相比，随着时间的延长，MC组小鼠的饮食、饮水量不断增加，而体重却不断降低。与MC组相比，PC1、PC2、EC30、EC20、EC10组小鼠的体重呈现上升趋势，饮水量和饮食量则呈现降低趋势。此外，朝藿定C治疗后小鼠FBG水平明显下降。这说明朝藿定C能使T2DM小鼠“三多一少”的糖尿病典型症状得到缓解。

四、朝藿定C对T2DM小鼠肝脏指数的影响

T2DM小鼠肝脏指数研究方法：按照试验例3方法进行小鼠模型的制备和分组处理。取小鼠肝脏等，按照下列公式测算肝脏指数：

肝脏指数＝肝脏重量/体重*100％

实验结果：肝脏、肾脏等器官异常是T2DM的重要并发症临床表现。肝脏是糖和脂质代谢的主要器官，持续的高血糖可能导致脂肪肝、肝纤维化甚至肝癌等疾病。糖尿病患者在长期高血糖时，常伴有肝肿大，发生率在糖尿病中达到12％-90％，酮症时几乎100％会出现肝肿大，肝内脂肪、糖原沉积明显。肝脏指数是肝脏湿质量与体质量之间的比例，主要用于反映药物处理前后肝损伤导致的质量变化。通常，肝脏受到损伤时，肝脏指数会随之增大。由表3可以看出，MC组小鼠的肝脏指数显著高于NC组(P<0.05)。朝藿定C干预后，T2DM小鼠的肝脏指数相对于MC组出现不同程度的下降(P<0.05)，这说明朝藿定C对T2DM小鼠的肝脏有一定的保护作用，同时也从侧面反映了朝藿定C对T2DM的治疗作用。

表3朝藿定C对T2DM小鼠肝脏指数的影响

组别	肝脏指数(％)
		NC	3.96±0.23<sup>d</sup>
MC	6.68±0.64<sup>a</sup>
		PC1	6.41±0.84<sup>a</sup>
PC2	5.39±0.85<sup>c</sup>
		EC30	6.22±0.71<sup>b</sup>
EC20	6.38±1.22<sup>b</sup>
		EC10	6.17±0.80<sup>b</sup>
EC5	6.23±0.88<sup>b</sup>

注：同列中数字右侧的不同字母上标表示差异显著(P<0.05)。

五、朝藿定C对T2DM小鼠脂质代谢的影响

T2DM小鼠肝脏中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)分析方法：按照试验例3方法进行小鼠模型的制备和分组处理。取小鼠肝脏等，按照试剂盒说明书方法测定肝脏中HDL-C和LDL-C的含量。

实验结果：糖尿病引发的肝损伤可使肝脏结构和肝细胞受到不同程度的破坏，从而造成脂质代谢异常。“脂毒性”是糖尿病发病机制中最重要的获得因素，HDL-C水平的降低和LDL-C水平的升高是糖尿病脂质代谢紊乱的重要表现。由表4可以看出，与NC组相比，MC组小鼠肝脏中的HDL-C水平显著降低，而LDL-C含量极显著升高(P<0.01)。给药之后，PC1、PC2组以及EC30、EC20、EC10组小鼠肝脏中的HDL-C含量均显著高于MC组(P<0.05)，LDL-C含量显著低于MC组(P<0.05)，其中EC30组小鼠肝脏中LDL-C的含量与NC组相比无显著差异。由此可知，朝藿定C有助于提升T2DM小鼠肝脏中HDL-C水平、降低LDL-C水平，缓解糖尿病脂质代谢紊乱问题。

表4朝藿定C对T2DM小鼠肝脏中HDL-C和LDL-C水平的影响

注：同列中数字右侧的不同字母上标表示差异显著(P<0.05)。

六、朝藿定C对T2DM小鼠肝功能的影响

T2DM小鼠肝脏中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活力分析方法：按照试验例3方法进行小鼠模型的制备和分组处理。取小鼠肝脏等，按照试剂盒说明书方法测定肝脏中ALT和AST的活力。

实验结果：谷丙转氨酶和谷草转氨酶是评价肝功能的重要指标。由表5可以看出，MC组的AST和ALT活力极显著高于NC组(P<0.01)，说明糖尿病小鼠的肝功能严重受损。经过朝藿定C治疗后，与MC组相比，EC30、EC20组小鼠肝脏AST和ALT活力显著下降(P<0.05)。EC30组小鼠的AST活力与阳性对照PC1、PC2组差异不大。说明朝藿定C可以有效恢复糖尿病引起的肝功能异常，缓解糖尿病肝损伤症状。

表5朝藿定C对T2DM小鼠肝脏ALT和AST活力的影响

注：同列中数字右侧的不同字母上标表示差异显著(P<0.05)。

七、朝藿定C对T2DM小鼠肝脏氧化应激的影响

T2DM小鼠肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)分析方法：按照试验例3方法进行小鼠模型的制备和分组处理。取小鼠肝脏等，按照试剂盒说明书方法测定肝脏SOD、GSH-Px活力以及MDA含量。

实验结果：糖尿病及其肝损伤并发症与氧化应激密切相关。有研究指出，氧化应激会产生过量的自由基，具有细胞毒性，可能影响胞内信号传导通路，引发线粒体功能紊乱，造成肝脏脂质代谢紊乱，诱发肝损伤。SOD和GSH-Px是机体重要的抗氧化防御体系，MDA是评价氧化应激水平常用的观察指标。由表6可知，与NC组相比，MC组小鼠肝脏中的MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px活力极显著降低(P<0.01)，提示糖尿病小鼠处于较严重的氧化应激状态。朝藿定C治疗后，SOD和GSH-Px活力升高，MDA含量降低。朝藿定C剂量越高，GSH-Px活力也越高，呈现出明显的剂量依赖性。EC30、EC20组小鼠肝脏的SOD和GSH-Px活力显著高于MC组(P<0.05)，而MDA含量则显著低于MC组(P<0.05)。这些研究结果提示朝藿定C具有较强的体内抗氧化活性，可以缓解T2DM小鼠的氧化应激状态。

表6朝藿定C对T2DM小鼠肝脏氧化应激的影响

注：同列中数字右侧的不同字母上标表示差异显著(P<0.05)。

八、朝藿定C处理后的T2DM小鼠肝脏病理切片分析

T2DM小鼠肝脏组织学分析方法：按照试验例3方法进行小鼠模型的制备和分组处理。取小鼠肝脏等，用4％多聚甲醛溶液固定72h后，再用不同浓度的乙醇进行梯度脱水，依次进行二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、苏木精-伊红染色(HE染色)，在400倍光镜下观察、拍照。

实验结果：肝脏病理切片分析是了解肝脏病理状况的重要手段。图8是T2DM小鼠肝脏病理切片的代表性照片，图中，A、B、C、D、E、F、G和H分别代表NC组(正常组)、MC组(模型组)、PC1组(二甲双胍组)、PC2组(格列美脲组)、EC30组(30mg/kg朝藿定C组)、EC20组(20mg/kg朝藿定C组)、EC10组(10mg/kg朝藿定C组)和EC5组(5mg/kg朝藿定C组)。由HE染色结果可以看出，NC组小鼠肝小叶结构清晰，肝索排列层次分明，肝窦规则有序，胞质均匀，无颗粒、脂肪或纤维变性等。而MC组小鼠肝组织结构凌乱，部分肝细胞水肿，存在较大的白色脂质包裹，肝索、肝窦排列不规则，类似乳滴的空泡现象较多，细胞轮廓模糊。朝藿定C治疗后，小鼠肝组织趋于正常，空泡变形较少，肝索、肝窦排列趋于规则，其中EC30组的治疗效果最好。提示朝藿定C能阻碍T2DM小鼠肝组织的病变进程，对肝脏具有较好的保护作用。

以上结果说明，朝藿定C对α-葡萄糖苷酶受体有较高的分子对接亲和活性，对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用，能够有效缓解II型糖尿病小鼠“三多一少”的典型症状，提升糖尿病小鼠肝脏中高密度脂蛋白胆固醇水平，降低肝脏中低密度脂蛋白胆固醇水平，缓解糖尿病小鼠脂质代谢紊乱问题，降低肝脏指数，改善肝脏氧化应激状态，维护肝细胞、组织正常形态和结构，促进肝功能修复，对肝脏具有明显的保护作用。朝藿定C具有治疗糖尿病肝损伤的作用。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.朝藿定C在制备治疗糖尿病肝损伤的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为提升肝脏中HDL-C水平、降低LDL-C水平的药物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为提升肝脏中SOD和GSH-Px活力、降低肝脏中MDA含量的药物。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低肝脏中ALT和AST的活力水平的药物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为对α-葡萄糖苷酶受体具有分子对接亲和活性的药物。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制α-淀粉酶活性的药物。

7.一种治疗糖尿病肝损伤的药物，其特征在于，该药物由朝藿定C和药学上可接受的药用辅料制成药学上可接受的剂型。

8.如权利要求7所述的治疗糖尿病肝损伤的药物，其特征在于，所述的剂型为口含片、包衣片和硬胶囊。

9.如权利要求7或8所述的治疗糖尿病肝损伤的药物，其特征在于，口含片采用阿拉伯糖和/或甜菊糖苷作为甜味剂；包衣片采用蒸馏水作为粘合剂、采用甜菊糖苷作为甜味剂；硬胶囊采用明胶硬胶囊壳作为载体、采用膳食纤维作为填充物料辅料。

Images