淫羊藿次苷Ⅱ在制备防治生殖功能障碍的产品中的用途
技术领域
本发明涉及淫羊藿次苷Ⅱ的用途,具体涉及淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗生殖功能障碍、预防和/或治疗精液质量异常、预防和/或治疗选自少精症、弱精症、畸形精子症中的一种或多种所引起的不育症、或者用于改善睾丸生殖功能障碍及其病理变化、提高精子数量和/或精子活动力的产品中的用途。
背景技术
国际卫生组织(WHO)对生殖功能障碍的定义是夫妻未采取避孕措施而有规律性生活一年以上配偶未怀孕,也称为不育症。男性不育症发病原因包括精液输出障碍以及各种原因导致的睾丸精子发生功能障碍及精液质量异常。除了精液量和精浆理化成分异常,精子质量异常的主要原因包括精子数量减少(≤<2000万/毫升)、精子活动力下降(<50%)、畸形精子数量多(>30%)以及同时合并上述精子数量减少、活力降低、畸形三联症等。流行病学调查表明大约13-18%的夫妇由于生殖功能障碍而困惑。传统观念将其归咎为女方的原因,但现代研究表明由男方原因导致的不育大约占所有不育症占总体的30-50%。
生殖功能障碍的主要原因包括遗传性疾病、内分泌性疾病、糖尿病、高血压等疾病、精索静脉曲张等原因导致睾丸血液循环障碍,细菌病毒感染、环境污染毒性物质、食物饮料中毒性物质、放射线、磁场、化学物质及化学药物毒性作用等原因引起睾丸、附睾及精囊腺损伤性病理变化引起其结构和功能障碍,特别是睾丸间质细胞、支持细胞以及精原细胞发生损伤性病理变化,最终导致曲细精管生精上皮萎缩,精子发生障碍或精子活性障碍而导致生殖功能障碍引起不育症,不仅影响优生优育,而且给夫妻带来极大的生活压力,影响家庭和谐。
目前,临床上缺乏防治生殖功能障碍的安全有效药物,一些药物动物实验研究报道,枸杞多糖能通过提高睾丸组织超氧化物歧化酶的水平、降低睾丸组织DNA损伤,达到促进睾酮分泌、增加睾丸和附睾质量及修复睾丸组织损伤的目的;大蒜、洋葱植物提取物可通过抑制脂质过氧化、修复精子抗氧化功能提高精子抗氧化能力、改善精子发生和保护精子正常结构;服用含有发酵木瓜、维生素C、维生素E、乳铁蛋白、葡聚糖的片剂,可以通过抗氧化作用保护精子,一定程度上能够改善正常形态精子率和精子活动力,但是其药理药效有限,作用机制不清楚,有待于深入研究。
尽管一些中成药在生殖功能障碍治疗中有应用,但是由于其所含成分复杂,难于研究证实其药理药效作用机制。淫羊藿次苷Ⅱ是淫羊藿苷的代谢产物,关于淫羊藿苷对生殖功能障碍的作用,目前有一些相关动物实验研究报告,但目前还没有有关淫羊藿次苷Ⅱ改善睾丸生殖功能障碍及其病理变化,提高精子数量和/或精子活动力的研究报告。
发明内容
本发明通过实验证明了淫羊藿次苷Ⅱ能够促进生精细胞增殖,防止生精细胞凋亡,对雄性哺乳动物生殖功能障碍的睾丸功能具有修复作用,进而提高睾丸精子生成数量和活动力,从而改善哺乳动物的生殖功能,由此完成了本发明。
本发明第一方面涉及淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗哺乳动物生殖功能障碍、或者改善哺乳动物生殖功能的产品中的用途。
根据本发明第一方面任一项的用途,其中所述的哺乳动物为雄性哺乳动物。
本发明第二方面涉及淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗精液质量异常的产品中的用途。
根据本发明第二方面任一项的用途,其中所述精液质量异常是指精子活力异常和/或精子数量异常。
本发明第三方面涉及淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐在制备用于提高精子数量和/或精子质量的产品中的用途。
本发明第四方面涉及淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐在制备用于修复和/或改善睾丸生殖功能障碍(特别是生精功能障碍)及其病理变化的产品中的用途。
本发明第五方面涉及淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗选自少精症、弱精症、畸形精子症中的一种或多种所引起的不育症的产品中的用途。
在本发明中,所述临床少精症、弱精症、畸形精子症中的一种或多种例如为少精症、弱精症、畸形精子症、少精弱精症、少精-弱精-畸形精子三联症。
根据本发明以上任一项的用途,其中所述淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐与其它用于治疗生殖功能障碍的药物联用。
根据本发明以上任一项的用途,其中所述淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐以单位剂量为、例如0.1-100毫克/公斤体重/日的量使用。
根据本发明以上任一项的用途,其中所述产品通过肠道或非肠道形式使用。
本发明还涉及产品或组合物,其含有有效量的淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐,以及药学上可接受的载体或赋形剂;所述产品或组合物用于预防和/或治疗哺乳动物生殖功能障碍,改善哺乳动物生殖功能,预防和/或治疗精液异常,预防和/或治疗选自少精症、弱精症、畸形精子症中的一种或多种所引起的不育症,或者用于提高精子数量和/或精子质量、修复或改善睾丸生殖功能障碍及其病理变化。
本发明还涉及预防和/或治疗哺乳动物生殖功能障碍,改善哺乳动物生殖功能,预防和/或治疗精液质量异常,预防和/或治疗选自少精症、弱精症、畸形精子症中的一种或多种所引起的不育症,或者提高精子数量和/或精子质量、修复或改善睾丸生殖功能障碍及其病理变化的方法,所述方法包括给有需要的受试者预防和/或治疗有效量的淫羊藿次苷Ⅱ或其药学上可接受的盐的步骤。
在本发明的实施方案中,其中所述的哺乳动物为雄性哺乳动物。
在本发明中,淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ)的分子式为C27H32O10,分子量514.54,CAS号是113558-15-9,结构式如下所示:
在本发明中,术语“生殖功能障碍”意指与正常雄性哺乳动物的精子数量或质量相比,精子数量低于正常精子数量或精子数量正常但精子质量低于正常精子质量或精子数量和质量均低于正常精子水平。
在本发明中,所述改善生殖功能包括但不限于提高精子数量和/或质量、修复和/或改善睾丸生殖功能障碍(特别是生精功能障碍)及其病理变化。
在本发明的实施方案中,利用腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)制备生殖功能障碍动物模型。
腹腔注射链脲佐菌素不仅损伤胰岛细胞诱导糖尿病,也可损伤睾丸生精上皮诱导生殖功能障碍,Bose R(2012)等研究发现该模型是睾丸生殖功能障碍的有效动物模型(Bose R,Adiga SK,D'Souza F,Salian SR,Uppangala S,Kalthur G,Jain N,Radhakrishnan RA,Bhat N,Krishnamurthy H,Kumar P.Germ cell abnormalities instreptozotocin induced diabetic mice do not correlate with blood glucoselevel.J Assist Reprod Genet.2012;29(12):1405-1413.)
在本发明中,所述精液质量异常是指精子数量和/或精子活力异常,例如数量和或质量降低。
在本发明中,所述精子质量包括精子活动力、精子形态、精子存活率等。
在本发明中,所述睾丸生殖功能障碍例如包括,通过精液分析,精子数量减少(<2000万/毫升),临床诊断为少精症;或者精子活动力下降(<50%),临床诊断为弱精症;或者畸形精子数量多(>30%),临床诊断为畸形精子症;或者同时合并上述精子减少、活力不足、畸形症三种,临床诊断为少精-弱精-畸形精子症。
在本发明中,所述睾丸生殖功能障碍的病理学变化包括睾丸质量、附睾质量和精囊腺质量均显著下降;分子生物学变化包括睾丸生曲细精管生精上皮中增殖细胞数量显著减少,生精上皮增殖增加凋亡细胞数量显著增多,氧化应激相关MDA活性增加,SOD活性下降以及Wnt1和β-catenin信号通路表达量显著增;临床表现为精液异常,例如精子质量和/或数量下降,进而引起不育症。
在本发明中,所述产品例如为药物、保健品或食品。
在本发明中,所述组合物例如为药物组合物。
在本发明中,所述哺乳动物例如为人、狗、猴、牛、马、猫、熊、虎、羊、鼠等。
本发明的含淫羊藿次苷II的产品可通过肠道或非肠道途径给予需要的宿主如人。通过肠道给予的本发明产品可通过口服制剂的形式给予,口服制剂举例有:片剂,胶囊,颗粒剂,悬浮剂,缓释剂等。通过非肠道给予的本发明产品可以为注射剂,局部给药制剂如皮肤贴剂,或喷雾剂等形式。
通常本发明药物组合物含有0.1-90重量%的有效成分(淫羊藿次苷Ⅱ)。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时,如果需要,可将有效成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合,制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药,给药途径可为肠道或非肠道,如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等;湿润剂与粘合剂,如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等;崩解剂,例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等;崩解抑制剂,例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等;吸收促进剂,例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等;润滑剂,例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片,例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片,或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如稀释剂与吸收剂,如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等;粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等;崩解剂,如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂,可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是,例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊,将有效成分与上述的各种载体混合,并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂,混悬于水性介质中形成混悬剂,亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂,如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂,可以使用本领域常用的所有稀释剂,例如,水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外,为了制备等渗注射液,可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油,此外,还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
此外,如需要,也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素,例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度,患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应,给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个,例如二、三或四个剂量形式给药。剂量水平须根据具体的给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史等来选定。但是,本领域的做法是,给药剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始,逐渐增加剂量,直到得到所需的效果。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
但应认识到,本发明的药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者,具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定,所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度;所采用的具体组合物;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;给药时间、给药途径和排泄率;治疗持续时间;与组合使用或同时使用的药物;及医疗领域公知的类似因素。例如,本领域的做法是,给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始,逐渐增加剂量,直到得到所需的效果。一般说来,本发明的药物组合物以有效成分(淫羊藿次苷Ⅱ)计算用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001-1000mg/kg体重/天,例如介于0.01-100mg/kg体重/天,例如介于0.01-10mg/kg体重/天。
本发明通过实验证明了淫羊藿次苷Ⅱ通过睾丸调节Wnt/β-catenin信号通路促进生精细胞增殖,防止生精细胞凋亡,对雄性哺乳动物生殖功能障碍、睾丸及其病理变化和功能具有修复作用,进而提高睾丸精子生成数量和活动力,从而改善哺乳动物的生殖功能。
附图说明:
图1是淫羊藿苷在体内和体外转化成淫羊藿次苷Ⅱ的示意图及淫羊藿苷(上图)和淫羊藿次苷Ⅱ(下图)的HPLC图。
图2是HE染色检测淫羊藿次苷Ⅱ对生精上皮厚度的影响;*p<0.05,STZ组比较NC组、STZ+ICAⅡ组及STZ+ICA组具有显著统计学差异;#p<0.05,STZ+ICAⅡ组比较STZ+ICA组比较具有显著统计学差异。
图3是Ki67免疫组化染色检测淫羊藿次苷Ⅱ对生精上皮细胞增殖的影响;*p<0.05,STZ组比较NC组、STZ+ICAⅡ组及STZ+ICA组具有显著统计学差异;#p<0.05,STZ+ICAⅡ组比较STZ+ICA组具有显著统计学差异。
图4是TUNEL染色法检测淫羊藿次苷Ⅱ对生精上皮细胞凋亡的影响;*p<0.05,STZ组比较NC组、STZ+ICAⅡ组及STZ+ICA组具有显著统计学差异;#p<0.05,STZ+ICAⅡ组比较STZ+ICA组具有显著统计学差异。
图5是Western blot检测淫羊藿次苷Ⅱ对睾丸组织β-catenin表达的影响;*p<0.05,STZ组比较NC组、STZ+ICAⅡ组及STZ+ICA组具有显著统计学差异,#p<0.05,STZ+ICAⅡ组比较STZ+ICA组具有显著统计学差异。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的制备
参照Xia Q等(2010)文献(Xia Q,Xu D,Huang Z,Liu J,Wang X,Wang X,LiuS.Preparation of icariside II from icariin by enzymatic hydrolysismethod.Fitoterapia.2010;81(5):437-442.)的方法制备得到淫羊藿苷和淫羊藿次苷II。
淫羊藿苷制备:利用乙醇提取,利用大孔树脂纯化从淫羊藿中提取分离淫羊藿苷并按照文献方法进行提纯。可获得大量淫羊藿苷(Icariin,ICA)。利用HPLC分析其纯度为98.0%。
淫羊藿次苷Ⅱ制备:
在体外利用葡萄糖苷酶(β-glucosidase)酵解,将淫羊藿中淫羊藿苷转化成淫羊藿次苷Ⅱ(IcarisideⅡ,ICAⅡ),并按照文献方法进行提纯。利用HPLC分析其纯度为98.0%(如图1)。
制备得到的淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ用于以下各实施例。
实施例2淫羊藿次苷II对生殖功能的影响
腹腔注射链脲佐菌素不仅损伤胰岛细胞诱导糖尿病动物模型,也可损伤睾丸生精上皮诱导生殖功能障碍动物模型。Bose R(2012)等经研究发现该模型是睾丸生殖功能障碍的有效动物模型(Bose R,Adiga SK,D'Souza F,Salian SR,Uppangala S,Kalthur G,JainN,Radhakrishnan RA,Bhat N,Krishnamurthy H,Kumar P.Germ cell abnormalities instreptozotocin induced diabetic mice do not correlate with blood glucoselevel.J Assist Reprod Genet.2012;29(12):1405-1413.)。
24只雄性Sprague-Dawley大鼠,8w龄,200-250克。空腹16h后,经腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ),60毫克/公斤,制备生殖功能障碍动物模型,24只大鼠随机均分为4组,正常对照组(NC组)、STZ组(STZ组)、淫羊藿苷治疗STZ组(STZ+ICA组)、淫羊藿次苷Ⅱ治疗STZ组(STZ+ICAⅡ组)。STZ注射72h后通过尾静脉检测血糖,空腹血糖浓度不小于300mg/dl者为造模成功。ICA和ICAⅡ治疗糖尿病通过连续灌胃方式,每天一次,用量为1mg/kg,连续治疗四周,对照组(NC组)、STZ组口服溶剂(DMSO),每天一次,连续四周。连续治疗四周后停药一周,检测动物体重和血糖,获取血液标本、睾丸、附睾、精囊腺。
精液常规:将每只实验动物的双侧附睾头称重并剪碎,加入10ml37℃预热的HAM'sF12培养液(L0136,Lonza,USA),温箱孵育10min。改良牛鲍血球计数板估测双侧附睾中精子总数,用相应的附睾质量对精子数量标准化,以“个/kg”为单位。精子活动力:用来自于同一份精液的两份不同的10μl标本重复计数200条精子,并比较两次独立计数各级精子所占的百分数。在显微镜焦点平面上由标线形成的区域内,或者在精子密度低时取整个视野,首先计数a和b级精子,随后在同一视野计数不动的c级精子。借助于实验室计数器的帮助,计数每类精子的数目(即活动率)。较大的差异提示出现计数错误或精子并非随机分布在载玻片上。这种情况下,应再制备两片新的载玻片重新评估精子活动率。
实验结果显示,STZ组大鼠造模后附睾精子储存数量、精子活动力显著降低,经ICA和ICAⅡ治疗后附睾精子数量(p=0.005)和精子活动力较STZ组(p=0.045)均显著改善。ICAⅡ治疗组比较ICA治疗组,附睾精子数量(p=0.568)和精子活动力(p=0.472)改善更显著,接近正常水平。(见表1)
表1 ICA和ICAⅡ治疗对大鼠模型精液常规的影响
*p<0.05,STZ组比较NC组、STZ组+ICA组及STZ+ICAⅡ组具有显著统计学差异;
#p<0.05,STZ+ICAⅡ组比较STZ组+ICA组具有显著统计学差异。
生殖腺质量测定:用生殖腺质量/体重来表示生殖腺的相对重量。SD大鼠造模后体重、睾丸质量、附睾质量和精囊腺质量均显著下降,经ICA和ICAⅡ治疗后,体重无显著变化(p=0.472)。与ICA治疗组相比,ICAⅡ治疗后能显著提高大鼠模型的睾丸质量(p=0.000)、精囊腺质量(p=0.024)、附睾质量(p=0.013),结果见表2。
表2 ICA和ICAⅡ治疗对大鼠模型体重和生殖腺质量的影响
*p<0.05,STZ组比较NC组、STZ+ICA组和STZ+ICAⅡ组具有显著统计学差异;
#p<0.05,STZ+ICA组比较STZ+ICAⅡ组具有显著统计学差异。
实施例3淫羊藿次苷II治疗生殖功能障碍大鼠模型睾丸组织病理学变化的效果
取实施例2模型大鼠的睾丸组织进行睾丸组织病理学检测:按苦味酸饱和液(1.22%)75ml、福尔马林25ml、冰醋酸5ml配制bouin氏液固定睾丸组织,Bouin液的用量大约为组织的10倍,固定时间为24h。组织从bouin液取出后直接移入70%酒精中冲洗。常规石蜡包埋,切片厚度5μm,HE染色。观察发现,正常对照组SD大鼠生精上皮厚度为5.0±1.1层细胞,但是STZ组较正常对照组生精上皮厚度显著降低(2.7±0.8层,p=0.000)。STZ+ICA治疗组和STZ+ICAⅡ治疗组,生精上皮厚度较STZ组均有不同程度提高。但与ICA组相比,ICAⅡ治疗后,生精上皮厚度较STZ组显著提高(4.2±1.2,p=0.004)(图2),接近正常对照组水平(p=0.1),曲细精管内有大量的精子存在,在生精上皮中可观察到处于精子发育不同时期的细胞(结果见图2)。
实施例4:淫羊藿次苷II对睾丸组织氧化还原水平的影响
采用MDA检测试剂盒(S0131,碧云天,中国)对睾丸组织的脂质氧化水平进行评估,探讨脂质氧化水平与睾丸生精功能之间的相关性。简要步骤为:在离心管内加入0.1ml裂解液或PBS作为空白对照,加入0.1ml不同浓度标准品MDA用于制作标准曲线,加入0.1ml样品用于测定;随后加入0.2ml MDA检测工作液;混匀后,100℃或沸水浴加热15分钟。水浴冷却至室温,1000g室温离心10分钟。取200微升上清加入到96孔板中,随后用酶标仪在532nm测定吸光度。计算出样品溶液中的MDA含量后,通过单位重量的蛋白含量来表示最初样品中的MDA含量,单位为mmol/g蛋白。
根据WST-1法检测睾丸组织中SOD活性。根据试剂盒说明书(S0102,碧云天,中国)说明操作,将待测样品和其他溶液加入到96孔板中,37℃孵育30分钟,在波长450nm处测定吸光度。抑制百分率计算公式为:抑制百分率=[(A空白对照1-A空白对照2)-(A样品-A空白对照3)]/(A空白对照1-A空白对照2)照/(A制。SOD酶活力的计算:待测样品中SOD酶活力单位=抑制百分率/(1-抑制百分率)units。根据样本中蛋白浓度和稀释倍数,将SOD活力单位换算为Units/mg蛋白。
SD大鼠造模后,STZ组较正常对照组脂质氧化水平(MDA含量)显著升高(p=0.006)。但是,STZ+ICA治疗组和STZ+ICAⅡ治疗组较STZ组MDA含量相比显著降低;STZ+ICAⅡ治疗组(p=0.009)更优于STZ+ICA治疗组,(p=0.034)。
SD大鼠造模后,STZ组较正常对照组睾丸组织内SOD酶活力降低明显(p=0.015)。但是,STZ+ICA治疗组和STZ+ICAⅡ治疗组较STZ组SOD酶活力相比显著提高;STZ+ICAⅡ治疗组(p=0.022)更优于STZ+ICA治疗组(p=0.649)。结果提示淫羊藿次苷Ⅱ比淫羊藿苷能更加有效的降低生殖功能障碍睾丸组织氧化还原水平,其机制可能与自身的抗氧化水平有关,而并不是因为提高了SOD活力水平。
表3 ICA和ICAⅡ治疗对STZ大鼠睾丸氧化还原水平的影响
*p<0.01,STZ组比较NC组、STZ+ICA组和STZ+ICAⅡ组具有显著统计学差异;
#p<0.05,STZ+ICA组比较STZ+ICAⅡ组具有显著统计学差异。
实施例5淫羊藿次苷II增强生殖功能障碍大鼠模型睾丸曲细精管精子生成标记物Ki67表达的效果
取实施例2模型大鼠的睾丸组织进行睾丸组织增殖情况检测:睾丸石蜡包埋组织4μm切片(参见实施例3),二甲苯脱蜡,梯度酒精水化。以免疫组织化学染色法检测睾丸内细胞增殖情况,切片微波修复,于微波炉中高火3min,低火10min;室温下在切片滴加H2O2封闭内源性过氧化物酶;3%山羊血清封闭;一抗为抗Ki67抗体(abcam公司,ab15580,1:500),4℃过夜,二抗用即用型快捷免疫组化试剂盒(KIT-5001,迈新,中国),37℃孵育20min,DAB显色。
观察结果发现(图3),正常对照组(NC)睾丸精曲小管生精上皮中有大量生精细胞增殖;STZ组比较NC组,诱导糖尿病合并生殖功能障碍模型大鼠睾丸生精上皮中增殖细胞数量显著减少(p<0.05),仅靠近生精小管基底膜的一层细胞存在增殖现象;STZ+ICA治疗组和STZ+ICAⅡ治疗组比较STZ组,增殖生精细胞经ICA和ICAⅡ治疗,增殖细胞数量均有不同程度提高。其中STZ+ICAⅡ组较STZ+ICA组,治疗后增殖细胞数量增加更显著(p<0.05)(结果见图3)。
实施例6淫羊藿次苷II防治生殖功能障碍大鼠模型睾丸曲细精管精子凋亡的效果
取实施例2模型大鼠的睾丸组织进行睾丸组织凋亡情况检测:睾丸石蜡包埋组织4μm切片,二甲苯脱蜡,梯度酒精水合。切片放入1%Triton X-100通透液中,室温5min,1×PBS漂洗3次,每次5min。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,室温10min,1×PBS漂洗3次,每次5min。睾丸组织凋亡检测使用凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(KGA7035,凯基,中国)进行检测,具体过程见试剂说明书(KGA7035)。观察发现(图4),正常对照组(NC)睾丸精曲小管凋亡细胞罕见;STZ组较NC组睾丸生精上皮中凋亡细胞数量显著增多(p<0.05);STZ+ICA治疗组和STZ+ICAⅡ治疗组较STZ组凋亡细胞数量均有不同程度减少。STZ+ICAⅡ组较STZ+ICA组凋亡细胞数量减少更显著(p<0.05)(结果见图4)。
实施例7淫羊藿次苷II防治生殖功能障碍大鼠模型睾丸曲细精管精子生成相关Wnt/β-catenin信号通路的效果
Wnt/β-catenin信号通路在ICAⅡ影响睾丸生精功能中的作用:全细胞蛋白提取试剂盒提取蛋白(P0033,碧云天,中国),检测蛋白浓度并按实验分组标记。将样品放入钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳,随后转移到聚偏二氟乙烯膜上,封闭后分别加入一抗GAPDH(FL-335,santa cruz,USA,1:2000)、Wnt1(ab15251,Abcam,USA,1:1000)及β-catenin抗体(ab32572,Abcam,USA,1:200)。4℃过夜,次日加入二抗,电化学发光后通过MolecularAnalyst图像分析软件分析每条条带的整合密度值(Integrated density value,IDV)。观察发现(图5),正常对照组(NC)睾丸组织中Wnt/β-catenin信号通路被激活,信号分子Wnt1和β-catenin高表达;STZ组较NC组睾丸生精上皮中凋亡细胞数量显著增多(p<0.05);STZ+ICA治疗组和STZ+ICAⅡ治疗组较STZ组Wnt1和β-catenin表达量均有不同程度降低。其中STZ+ICAⅡ组较STZ+ICA组Wnt1和β-catenin表达量的影响更显著(p<0.05)。
小结:
以上实施例的实验数据表明,按剂量浓度1mg/kg连续口服4周,ICAⅡ可以改善生殖功能障碍睾丸生精功能,增加精子数量,提高精子活动力,提高生殖腺质量(睾丸、精囊)。与STZ组相比,经ICA、ICAⅡ治疗后,睾丸组织脂质过氧化水平(MDA)显著降低,组织中SOD酶活力显著升高,提示ICA、ICAⅡ改善睾丸功能的机制,与调节睾丸组织的抗氧化酶活性有关。
文献报道,Wnt/β-catenin通路对睾丸生精功能有重要影响,成熟睾丸中sertoli细胞过量表达β-catenin可显著降低精原性母细胞的活性,促进生殖细胞的凋亡。本研究中,与STZ组相比,ICA、ICAⅡ治疗后,睾丸生精上皮中增殖细胞数量均有所增加,凋亡细胞数量显著减少。但是,与ICA相比,ICAⅡ在调节增殖细胞数量和凋亡细胞数量方面更佳。此外,STZ组睾丸组织信号分子Wnt1和β-catenin表达量显著增加(p<0.05);ICA、ICAⅡ治疗后Wnt1和β-catenin表达量有所降低,但ICAⅡ治疗后,与ICA治疗组相比,Wnt1和β-catenin表达量降低更明显,结果提示ICA、ICAⅡ可能通过抑制Wnt/β-catenin通路,减轻对生精上皮细胞增殖的抑制作用,并减少生精上皮细胞的凋亡,ICAⅡ效果更好。
综上所述,ICAⅡ在一定程度上可改善SD大鼠的生精功能降低。其机制可能与抗氧化作用以及ICAⅡ对Wnt/β-catenin通路的抑制作用有关。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
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