CN114886878B - 18β-甘草次酸脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种18β‑甘草次酸脂质体及其制备方法和应用，本发明的脂质体采用薄膜分散法、薄膜分散‑探头超声法制备，为单纯包载18β‑甘草次酸脂质体，其中辅料摩尔质量比8.5:1:0.5～6:2:2；本发明脂质体粒径100～1200nm，Zeta电位是‑8.10～‑16.57mv，包封效率为84.41％～88.42％，呈类球形。实验结果证明该脂质体可以增加药物在体内的半衰期，提高药物在小鼠肺内的分布，在动物体内具有较强的靶向性和缓释性；本发明脂质体能有效改善血流动力学，逆转肺血管重构，治疗肺动脉高压，通过雾化吸入给药进行治疗，表现出优良的肺动脉高压治疗效果，在肺动脉高压治疗方面有广阔应用前景。本发明克服了现有传统靶向药物副作用大、给药频繁、病人顺应性差等缺陷。

Description

18β-甘草次酸脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药制剂技术领域，具体涉及18β-甘草次酸(18β-alpha-Glycyrrhetinic acid，18β-GA)脂质体及其制备方法和应用，特别涉及18β-甘草次酸脂质体作为治疗肺动脉高压的用途。

背景技术

肺动脉高压(PAH)是一种严重而致命的肺血管疾病，其特点是肺血管阻力增加，肺血管重塑进行性加重。目前临床使用的靶向治疗药物主要用于抑制血管收缩或降低肺动脉阻力，可以缓解症状，提高运动能力，改善血流动力学,但它们的高价格在很大程度上限制了其全球使用，以及会出现副作用，频繁给药等现象，使它们在延缓疾病进展方面的作用是有限的。由于这些限制，目前处理肺动脉高压的方案并不令人满意。因此，重要的是开发和确定具有同等或更高的疗效新的药物或新的制剂，并且负担得起又易于管理患者的肺动脉高压。

甘草(Glycyrrhiza glabra L)是宁夏特色豆科草本药用植物，因历史悠久、临床应用广泛而有“国老”“十方九草”之誉甘草的有效成分甘草酸在体内水解掉分子葡萄糖醛酸后形成甘草次酸，其中18β-甘草次酸在甘草酸中占比达97％，相比甘草其他有效成份较易合成和提取。课题组前期研究结果表明，18β-甘草次酸通过抑制Rho A/ROCK信号通路及抗氧化应激治疗野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠，能够显著降低肺动脉高压大鼠平均肺动脉压、右心室收缩压、血管壁厚度百分比和血管壁面积百分比，显著改善大鼠右心室重构、肺组织形态结构病变，以上研究结果证明18β-甘草次酸对野百合碱致肺动脉高压大鼠具有很好的治疗作用。但由于18β-甘草次酸在水中的溶解度很低、口服几乎不吸收并且18β-甘草次酸会导致钠滞留和钾流失等副作用。为了减少副作用和维持甘草次酸的有效浓度，将其制备成18β-甘草次酸脂质体，以雾化吸入形式进行给药。

吸入雾化药物是治疗肺动脉高压的一种非侵入性给药途径，可将治疗分子定向输送至肺部。为了更好的与深部肺泡区域更好的结合，从而发挥更佳的疗效，脂质体被用作促进药物吸收和细胞内作用的载体。与传统的吸入给药相比，脂质体是具有优势的，首先具有良好的生物相容性和安全性、其次药物降解速度慢和药物释放可控、最后具有增强的渗透和滞留作用，显示了被动靶向的能力，将药物包载到脂质体中采用雾化吸入给药，提供高负荷能力，保护酶，从而改善大分子稳定性，增强肺部分布和滞留。此外，它们可以主动针对肺部，可在给药部位表现出药物释放的可控性，从而使肺部的治疗浓度维持更长时间并具有控制释放机制，净增益降低给药频率和改善患者依从性。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种18β-甘草次酸脂质体及其制备方法和应用，从而克服现有传统靶向药物副作用大、给药频繁、病人顺应性差等缺陷，使其通过雾化吸入后能有效发挥治疗肺动脉高压的作用。18β-甘草次酸脂质体可通过长时间在肺部靶向释放18β-甘草次酸，达到治疗肺动脉高压的目的。

一方面，本申请提供了一种18β-甘草次酸脂质体，其特征在于，所述脂质体为单纯包载18β-甘草次酸脂质体，采用薄膜分散法、薄膜分散-探头超声法制备。

进一步地，所述18β-甘草次酸脂质体的辅料选自卵磷脂、氢化大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。

进一步地，所述18β-甘草次酸脂质体的辅料为摩尔比为7:2:1的氢化大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。

进一步地，其中所述18β-甘草次酸脂质体粒径分布范围是100～1200nm，Zeta电位是-8.10～-16.57mv，包封效率为84.41％～88.42％。

另一方面，本申请提供了所述的18β-甘草次酸脂质体的制备方法，其特征在于：以18β-甘草次酸脂质体为有效成分，采用薄膜分散法、薄膜分散-探头超声法将18β-甘草次酸脂质体包载于其中。

进一步地，所述薄膜分散法包括如下步骤：将18β-甘草次酸和辅料先溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发，自然干燥除尽有机溶剂，然后加入水化介质，在37～52℃水浴条件下水化孵育2h～12h，得到18β-甘草次酸脂质体。

进一步地，其中所述薄膜分散-探头超声法包括如下步骤：将18β-甘草次酸和辅料先溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发，自然干燥除尽有机溶剂，然后加入水化介质，在100～400W功率条件下超声5min～15min，得到18β-甘草次酸脂质体。

进一步地，其中所述有机溶剂为氯仿、甲醇、异丙醇、丙酮、或乙醇中的一种或几种。

进一步地，所述水化介质为磷酸缓冲盐溶液或N-2羟乙基哌嗪-N”-2乙磺酸缓冲液，其浓度为5～30mmol/L，pH为5～9。

另一方面，本申请提供了所述的18β-甘草次酸脂质体或者所述的方法制备的脂质体在制备治疗肺动脉的药物中的应用。所述的药物是通过雾化方式给药。

将药物采用雾化吸入给药，提供高负荷能力，保护酶，从而改善大分子稳定性，增强肺部分布和滞留。此外，它们可以主动针对肺部，可在给药部位表现出药物释放的可控性，从而使肺部的治疗浓度维持更长时间并具有控制释放机制，净增益降低给药频率和改善患者依从性。

有益效果：

本申请的脂质体可以增加药物在体内的半衰期，提高药物在小鼠肺内的分布，该脂质体在动物体内具有较强的靶向性和缓释性；本发明脂质体(平均粒径800nm；6.25mg/kg，50mg/kg)能有效改善血流动力学，逆转肺血管重构，治疗肺动脉高压。该脂质体通过雾化吸入给药进行治疗，表现出优良的肺动脉高压治疗效果，在肺动脉高压治疗方面有广阔应用前景。

附图说明

图1为18β-甘草次酸脂质体粒径分布图(图1A：A-18β-甘草次酸脂质体；图1B：B-18β-甘草次酸脂质体；图1C：C-18β-甘草次酸脂质体；图1D：D-18β-甘草次酸脂质体)；

图2为18β-甘草次酸脂质体及其溶液的体外释放曲线(图2A和图2B分别为48小时和6小时内的释放曲线)；

图3为血浆药物浓度随时间变化曲线图(Mean±S.D，n＝6，图3A和图3B分别为48小时和2小时内的血浆药物浓度随时间变化曲线图)；图3C为小鼠雾化吸入各组18β-甘草次酸脂质体及18β-甘草次酸溶液后肺中的18β-甘草次酸质量分数(Mean±S.D，n＝5)；注：与溶液组比较，^*,P<0.05；^**,P<0.01；各组脂质体之间与A-18β-甘草次酸脂质体比较，^#,P<0.05；^##,P<0.01；与B-18β-甘草次酸脂质体比较，^{^},P<0.05；^{^^},P<0.01。

图4为B-18β-甘草次酸脂质体透射电镜图(放大倍数×2000)

图5为18β-甘草次酸脂质体显著降低肺动脉高压大鼠平均肺动脉压图(Mean±S.D，n＝2)；注：与正常组比较，^#,P<0.05；^##,P<0.01；,与模型组比较，^*,P<0.05；^**,P<0.01。(18β-G-A-S为18β-甘草次酸溶液，18β-G-A-L为18β-甘草次酸脂质体)。

图6为18β-甘草次酸脂质体显著降低肺动脉高压大鼠右心室收缩压图(Mean±S.D，n＝2)；注：与正常组比较，^#,P<0.05；^##,P<0.01；,与模型组比较，^*,P<0.05；^**,P<0.01。(18β-G-A-S为18β-甘草次酸溶液，18β-G-A-L为18β-甘草次酸脂质体)。

图7为18β-甘草次酸脂质体显著降低肺动脉高压大鼠右心肥厚指数图(Mean±S.D，n＝6)；注：与正常组比较，^#,P<0.05；^##,P<0.01；,与模型组比较，^*,P<0.05；^**,P<0.01。(18β-G-A-S为18β-甘草次酸溶液，18β-G-A-L为18β-甘草次酸脂质体)。

具体实施方式

以下通过实例对本发明做进一步的阐述。但实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：薄膜分散法制备18β-甘草次酸脂质体

将18β-甘草次酸和辅料分别置于50mL茄形瓶中，两个茄形瓶各加入5mL甲醇和10mL氯仿，搅拌后倒于一个茄形瓶中，40℃恒温水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀的脂质薄膜，再放入4℃冰箱中大于48h，除尽残留溶剂。然后加入12mL浓度为5mM的HEPES缓冲液(pH为7.4)，37℃下水化4h，过膜，得到粒径约为300～1200nm的18β-甘草次酸脂质体，备用。用马尔文激光粒度仪测粒径、电位。采用透射电镜(TEM)观察18β-甘草次酸脂质体的形态，观察拍照。采用直接过膜实验考察18β-甘草次酸脂质体包封率、载药量；采用动态透析法考察18β-甘草次酸脂质体体外释放特征；观察稳定性。

实施例2：薄膜分散-探头超声法制备18β-甘草次酸脂质体

将18β-甘草次酸和辅料分别置于50mL茄形瓶中，各加入5mL甲醇和10mL氯仿，40℃恒温水浴加热下减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成均匀的脂质薄膜，再放入4℃冰箱中大于48h，除尽残留溶剂。然后加入12mL浓度为5mM的HEPES缓冲液(pH为7.4)，25℃、200W下超声破碎10min，过膜，得到粒径约为100～300nm的18β-甘草次酸脂质体，备用。用马尔文激光粒度仪测粒径、电位。采用透射电镜(TEM)观察18β-甘草次酸脂质体的形态，观察拍照。采用直接过膜实验考察18β-甘草次酸脂质体包封率、载药量；采用动态透析法考察18β-甘草次酸脂质体体外释放特征；观察稳定性。

根据单因素考察制备工艺参数最终确定四组优选处方见表1，平行制备三组进行理化性质评价。

表1 优选处方

结果如图1(A-D)所示，结果表明可以成功构建18β-甘草次酸脂质体，粒径为100～1200nm(A-18β-甘草次酸脂质体，B-18β-甘草次酸脂质体，C-18β-甘草次酸脂质体，D-18β-甘草次酸脂质体)。透射电镜图像也显示成功制备了脂质体(图4)。结果如表2所示，各组的脂质体处方包封率和载药量，均符合要求。

表2 各组的脂质体处方包封率和载药量(Mean±S.D，n＝3)

结果如图2(A、B)所示，结果表明构建成功的18β-甘草次酸脂质体在体外具有良好的缓释效果和增加18β-甘草次酸溶解度等优点。

实施例3：18β-甘草次酸脂质体药物代谢动力学性质的研究

1、试验动物：SD大鼠，雄性，体重(220-250)g。

2、给药与样品采集：大鼠雾化吸入给药：每组SD大鼠8只，雄性，体重220-250g，随机分为五组18β-甘草次酸溶液，A-18β-甘草次酸脂质体，B-18β-甘草次酸脂质体，C-18β-甘草次酸脂质体，D-18β-甘草次酸脂质体。雾化给药前禁食不禁水12h，雾化给药后4h可给予大鼠水和饲料。采用压缩雾化机对SD大鼠进行给药，雾化吸入量为25mg/kg(以18β-甘草次酸计)，分别于雾化给药前和雾化给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48h于大鼠眼眶静脉丛处毛细管取血0.5mL，置于含有肝素的离心管中，上下稍晃匀，静置后，4000rpm/min离心10min，分离上清液血浆样品，置于-80℃保存。

3、仪器条件和血浆样品测定：

仪器：日本Shimadzu公司Shimadzu 30A超快速高效液相色谱仪串联美国AppliedBiosystems公司API 4000四极杆串联质谱仪

血样样品处理：向100μL大鼠血浆样品中加入100μL内标溶液、100μL甲醇水(1:1)和5mL乙酸乙酯，涡流混合15min，离心10min(4000G)，取上清，氮气吹干，加入150μL甲醇水(6:4)，涡流混合1min，超声2min，离心10min(14000G)，取100μL进行LC/MS/MS分析。

配置标准曲线：取大鼠空白血浆100μL，依次加入受试化合物标准系列溶液100μL，配制相当于血浆浓度为2，5，10，100，500，1000，2000ng/mL的受试化合物血浆样品，按“血浆样品处理”项下操作，建立标准曲线。以待测物浓度(x)为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值(y)为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程，即为标准曲线。根据标准曲线，LC/MS/MS法测定大鼠血浆中受试化合物的线性范围为2-2000ng/mL。

4、试验结果：

血浆药物浓度随时间变化曲线图(Mean±S.D，n＝6)为图3A、B所示；

18β-甘草次酸脂质体药代动力学数据见表3

表3 18β-甘草次酸脂质体药代动力学数据

注：与溶液组比较，^*,P<0.05；^**,P<0.01；各组脂质体之间与A-18β-甘草次酸脂质体比较，^#,P<0.05；^##,P<0.01；与B-18β-甘草次酸脂质体比较，^{^},P<0.05；^{^^},P<0.01。

试验结果表明各组不同粒径18β-甘草次酸脂质体有缓释现象，增加18β-甘草次酸在体内的吸收，延缓18β-甘草次酸在体内的消除速率，增加在体内的循环作用时间，提高18β-甘草次酸的生物利用度。

实施例4：18β-甘草次酸脂质体组织分布学特征的研究

1、试验动物：小鼠，雄性，体重(22-25)g。

2、给药与样品采集：小鼠雾化吸入给药：小鼠200只，雄性，体重22-25g，随机分为五组18β-甘草次酸溶液，A-18β-甘草次酸脂质体，B-18β-甘草次酸脂质体，C-18β-甘草次酸脂质体，D-18β-甘草次酸脂质体。雾化给药前禁食不禁水12h，雾化给药后4h给予小鼠水和饲料。采用压缩雾化机对小鼠进行给药，雾化吸入量为35mg/kg(以18β-甘草次酸计)，分别于雾化给药前和雾化给药后0.5、1、2、4、6、12、24、48h剖取脏器组织心、肝、脾、肺、肾，脑。每个时间点平行剖取5只小鼠。

3、组织样品处理：用生理盐水冲洗干净小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑组织，待干燥后，称量0.2-0.3g，置于研磨管中，不足0.3g的组织全部放于研磨管中，记录称量数据，均加入800μL生理盐水，进行匀浆，-80℃储存备用。精密量取组织匀浆液100μL，加入100μL内标溶液、100μL甲醇水(1:1)和5mL乙酸乙酯，涡流混合15min，离心10min(4000G)，取上清，氮气吹干，加入150μL甲醇水(6:4)，涡流混合1min，超声2min，离心10min(14000G)，取100μL进行LC/MS/MS分析。

LC/MS/MS法测定大鼠组织中受试化合物的条件如同血浆样品测定。

4、试验结果：

小鼠雾化吸入各组18β-甘草次酸脂质体及18β-甘草次酸溶液后肺中的18β-甘草次酸质量分数(Mean±S.D，n＝5)为图3C所述；其在肺组织靶向参数见表4

表4为18β-甘草次酸脂质体肺组织分布靶向参数数据

试验结果表明各组不同粒径18β-甘草次酸脂质体在雾化吸入后在肺部分布程度有所增加，提高18β-甘草次酸在肺组织中的分布，A-18β-甘草次酸脂质体和B-18β-甘草次酸脂质体具有较强的肺靶向性。

实施例5：18β-甘草次酸脂质体治疗肺动脉高压研究

1、实验动物和药物：成年雄性大鼠，喂养条件包括标准饲料,自来水,室温保持在20士2℃，湿度50％-60％，每日光照与黑暗时间各12h。实验前，将动物置于实验环境适应3天。大鼠随机分为正常对照组、模型组、吸入NO阳性药物组、雾化18β-甘草次酸溶液组(18β-GA-S)(6.25mg/kg)、雾化18β-甘草次酸脂质体不同剂量组(18β-GA-L)(6.25mg/kg、50mg/kg)。18β-甘草次酸脂质体选择B-18β-甘草次酸脂质体。正常对照组腹部皮下注射生理盐水，其余各组大鼠在腹部皮下一次性SU5416(20mg/kg/只)，低氧8h(每周6d，共计3周)造模，造模后的第22天开始,18β-甘草次酸溶液组、18β-甘草次酸脂质体(B-18β-甘草次酸脂质体)不同剂量组(雾化吸入给药，每24小时一次)及吸入NO药物组给药(雾化吸入给药，一次30min，每24小时一次)。正常对照组和模型组同法给予等的生理盐水。在连续给药后的第22天进行血流动力学和右心肥厚指数的药效学评价。

2、大鼠肺动脉高压模型建立：称取SU5416后置于15mL离心管中，用0.5％羧甲基纤维素钠助溶。取280g左右的大鼠，一次性腹部皮下注射SU5416(20mg/kg)，放入低氧箱(氧浓度9.5％—10.5％)8h(每周6d，共计3周)。

4、血流动力学测定：实验末次给药24h后，乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，分离右颈外静脉，结扎远心端，在近心端倾斜45°剪一小口，将与压力换能器相连接并充满肝素的大鼠专用右心导管插入右颈外静脉，左旋并向前推进进入右心室，记录右心室收缩压，转向肺动脉，记录平均肺动脉压。

实验结果：由图5-6,可以看出在低氧造模后的第42天,与对照组大鼠相比,模型组大鼠平均肺动脉压和右心室收缩压显著上升(P<0.01)。与模型组相比,给予甘草次酸溶液和脂质体后治疗的大鼠平均肺动脉压和右心室收缩压显著降低(P<0.05,P<0.01)。提示甘草次酸溶液及脂质体(6.25mg/kg、50mg/kg)可以改善低氧诱导的大鼠肺动脉高压。

5、右心肥厚指数检测：大鼠血流动力学指标检测结束后，打开胸腔，将连接灌注装置的针头经右心室插入至肺动脉，用生理盐水冲洗肺。取出心脏，分离右心室、左心室加室间隔，分别称重，计算右心室肥厚指数＝右心室/左心室+室间隔。

实验结果：由图7可以看出在低氧造模后的第42天,与对照组大鼠相比,模型组大鼠右心肥厚指数显著上升(P<0.01)。与模型组相比,给予甘草次酸溶液和脂质体治疗的大鼠右心肥厚指数显著降低(P<0.01),右心室重构得到改善。提示甘草次酸溶液及脂质体(6.25mg/kg、50mg/kg)可以改善野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压。

Claims (5)

1.一种通过雾化给药的18β-甘草次酸脂质体，其特征在于，所述脂质体为仅包载18β-甘草次酸一种成分的脂质体；所述脂质体使用摩尔比为7:2:1的氢化大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000为辅料，采用薄膜分散法制备；

所述脂质体通过以下方法制备：

将18β-甘草次酸和辅料先溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发，自然干燥除尽有机溶剂，然后加入水化介质，在37～52℃水浴条件下水化孵育2h～12h，得到18β-甘草次酸脂质体；所述水化介质为N-2羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸缓冲液，其浓度为5～30mmol/L，pH为5～9。

2.根据权利要求1所述的脂质体，其中所述脂质体粒径分布范围是100～1200nm，Zeta电位是-8.10～-16.57mv，包封效率为84.41％～88.42％。

3.根据权利要求1所述的脂质体，其中所述有机溶剂为氯仿、甲醇、异丙醇、丙酮、或乙醇中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的脂质体在制备治疗肺动脉高压的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物通过雾化方式给药。