CN109954130B - 双靶向配体化力达霉素dtll联合吉西他滨在胰腺癌治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双靶向配体化力达霉素DTLL的单独用药以及与吉西他滨联合给药在胰腺癌治疗中的应用。体内外研究结果表明，我们制备的DTLL能与其受体特异性亲和，同时对高表达EGFR/HER2的胰腺癌细胞MIA‑paca‑2有特异性靶向和极强的细胞毒作用，DTLL与吉西他滨联合用药能够发挥协同作用，明显优于非配体化游离的力达霉素(LDM)。并且，对单独使用吉西他滨不敏感的胰腺癌细胞AsPC‑1，也能够有效逆转胰腺癌对吉西他滨的耐药。

Description

双靶向配体化力达霉素DTLL联合吉西他滨在胰腺癌治疗中的 应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，涉及一种新型重组蛋白组装药物与其他抗癌药物治疗胰腺癌中的应用，特别涉及双靶向配体化力达霉素DTLL 与吉西他滨联合用药在胰腺癌治疗中的应用，尤其是双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨联合在治疗耐药性胰腺癌中的应用。

背景技术：

胰腺癌是当前恶性程度比较高的难治性胃肠道肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈现上升趋势，由于我国患者发现时大部分为晚期，死亡率几乎100％，5年生存率低于4％。胰腺癌早期的确诊率并不高，目前，治疗胰腺癌的首选方法仍然是手术切除，但仅有15％-20％的患者确诊后能进行手术治疗，其余患者多采用化疗的方式。吉西他滨在胰腺癌的化疗中有着极其重要的地位，它作用于DNA合成期的肿瘤细胞，是胰腺癌的标准一线化疗方案。有报道指出，腹腔灌注吉西他滨能有效抑制肿瘤的生长，改善患者生活质量并减轻全身的毒性反应。尽管吉西他滨单药方案已经成为了胰腺癌的辅助治疗标准方案，但其化疗的有效率仅能达到25％，中位生存期仅为5-7个月，1年生存率约为20％，远远不能满足临床的需要。尤其是对无手术指征的局部晚期和转移性胰腺癌，其中位生存期的延长较传统的5-FU/LV而言也仅为数月。造成这种情况的主要原因是由于吉西他滨在临床上出现了越来越多的耐药现象。研究表明，吉西他滨的耐药主要与摄取转运过程障碍，胞浆内活化，分解酶异常以及DNA修复等有关。目前晚期胰腺癌以吉西他滨为基础的一线化疗方案的疗效已停滞于平台期，因此,亟需改进现有对晚期胰腺癌的治疗策略。

分子靶向治疗针对细胞内或者表面特定的分子，特异性强，不良反应少，是目前治疗肿瘤的一个研究热点。表皮生长因子受体EGFR及其相关的信号通路在胰腺癌的发生发展过程中发挥着及其重要的作用。研究选择性抑制EGFR及其相关通路的分子靶向性药物可能会使得胰腺癌的治疗取得突破。目前上市的针对该靶点的药物有酪氨酸激酶抑制剂(埃罗替尼，吉非替尼等)和单克隆抗体(西妥昔单抗)。并且，联合应用吉西他滨和EGFR靶向药物对胰腺癌的治疗已经取得了一些进展。如 EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制剂——厄罗替尼，该药与吉西他滨联合使用，在2005年11月已获美国FDA批准用于治疗局部晚期、不可切除或转移性胰腺癌，并于2007年1月份也被欧盟批准用于转移性胰腺癌。 MOORE和DRAQOVICH等在临床研究中都证实，这一联合用药对于未手术的胰腺癌患者的总存活期为12.5个月，1年存活率为51％。

研究表明，由于ErbB家族受体成员之间的相互关联作用，同时阻断两个受体比只阻断单一受体可能对于有效治疗癌症和限制耐药性更为重要。抗肿瘤抗生素-力达霉素(Lidamycin，LDM)因其有效地抑制肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡等作用，使其可以成为抗体偶联药ADC 等靶向药物的理想弹头。本所前期研究中，通过基因重组和分子强化的技术路线，构建制备了一种抗ErbB通路的双靶向强化融合蛋白 Ec-LDP-Hr-AE，其具体构建过程已申请相关专利(专利号： CN101497666A)。已证明，其对人卵巢癌、乳腺癌及食管癌中均表现出良好的抗肿瘤疗效。

为了提高产量和纯度，增强组装效率和活性，我们改进优化了制备工艺流程，构建相应的质控标准，我们将优化后融合蛋白的中间产品命名为DTLP，其为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，不含下述式(I)发色团。将最产品命名为双靶向配体化力达霉素DTLL，所述的双靶向配体化力达霉素DTLL为SEQ ID NO：1所示的蛋白质和下式(I)所示的发色团的组装产物：

在本发明中，我们尝试将该靶向药物DTLL应用于难治性恶性肿瘤 ---胰腺癌的治疗，并将DTLL与吉西他滨联合用药，为难治性胰腺癌的治疗及逆转吉西他滨的耐药等寻找更好的解决方案，使其有望成为治疗胰腺癌的新型靶向药物。体内外研究结果表明，我们制备的DTLL对高表达EGFR/HER2的胰腺癌细胞有特异性靶向和极强的细胞毒作用， DTLL与吉西他滨联合用药能够发挥协同作用，明显优于非配体化游离的力达霉素(LDM)。并且，对单独使用吉西他滨不敏感的胰腺癌细胞，也能够有效逆转胰腺癌对吉西他滨的耐药。而且，将DTLL与吉西他滨联合处理吉西他滨敏感和不敏感的胰腺癌细胞，其疗效均明显强于已有报道的吉西他滨与厄罗替尼的联合应用。因此，本发明所阐述的治疗策略，是针对EGFR和HER2双靶向作用的联合、配体化靶向肽与强效细胞毒药物LDM的类抗体偶联药物(Antibody-based drug conjugate,ADC) 的新型结合，以及靶向药物与一线化疗药——即双靶向配体化力达霉素 (DTLL)与吉西他滨协同给药的应用。其创新性多重性的联合治疗胰腺癌的应用，有望成为具有良好临床应用前景的发明，迄今为止尚未见有相关报道。

发明内容：

本发明提供了一种药盒，其含有双靶向配体化力达霉素DTLL和吉西他滨，其中SEQID NO：1所示的蛋白质和式(I)所示的发色团的组装产物定义为双靶向配体化力达霉素DTLL。还提供了包含中间产物 DTLP和吉西他滨的药盒，其任选地含有式(I)的发色团。本发明还提供含有双靶向配体化力达霉素DTLL和吉西他滨的组合物。

本发明还提供了前述双靶向配体化力达霉素DTLL在制备胰腺癌治疗药物中的应用。

本发明进一步提供了前述双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨在制备用于治疗胰腺癌治疗药物中的应用。

本发明还提供了前述双靶向配体化力达霉素DTLL在制备用于耐药的胰腺癌的治疗药物中的应用。

而且，本发明进一步提供了前述的双靶向配体化力达霉素DTLL在制备用于吉西他滨耐药的胰腺癌的治疗药物中的应用。

本发明的技术方案包括以下内容:

1.获得融合蛋白DTLP和双靶向配体化力达霉素DTLL。(构建制备过程详见专利(专利号为CN101497666A)，制备工艺改进的流程另有专利正在申请中，其中DTLL是由DTLP与力达霉素发色团经过体外分子重建所得)

2.免疫融合蛋白DTLP与受体EGFR和HER2的亲和性验证：主要利用Biacore实验和受体包被的ElISA实验，分析DTLP与其相应受体的亲和活性，证明了此融合蛋白的特异性靶向作用。

3.体内外分析免疫融合蛋白DTLP与胰腺癌细胞之间的亲和活性验证：主要利用Western blot实验和细胞的ElISA实验证明了此融合蛋白能够与不同程度表达EGFR和HER-2的胰腺癌细胞亲和性，并用实验结果表明亲和活性与受体表达量呈正相关。细胞免疫化学法证实了此融合蛋白能够结合在EGFR和HER-2高表达的胰腺癌细胞系MIA-paca-2 的细胞膜上并能实现与受体EGFR或HER-2的共定位。再次印证了 DTLP的结合靶点确为EGFR和HER2。体内靶向性分析主要利用活体成像仪分析其在MIA-paca-2荷瘤裸鼠体内的荧光分布，得知DTLP可靶向荷瘤动物的肿瘤部位并积累。

4.双靶向配体化力达霉素DTLL对胰腺癌的抗肿瘤活性分析：主要采用MTS法，检测DTLL对不同胰腺癌细胞的杀伤活性，利用流式细胞术测定DTLL对MIA-paca-2细胞的促凋亡作用。体内实验采用了人胰腺癌MIA-paca-2裸鼠移植瘤模型，观察DTLL对肿瘤生长能力的抑制作用，同时利用HE染色观察药物对实验动物各个脏器的毒性，利用 TUNEL染色分析DTLL对实验动物的肿瘤组织的促凋亡作用。我们还利用RNAseq测序和全转录组microarry的分析数据确定不同胰腺癌患者

异体移植模型(PDX)中的EGFR和HER-2的表达水平，选取EGFR/HER-2表达量不同的胰腺癌PDX模型来评价DTLL的体内作用有无特异性。

5.双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药：体外研究利用克隆形成和MTS实验证明了DTLL与吉西他滨的联合用药具有协同作用，且能逆转胰腺癌细胞系Aspc-1对吉西他滨的耐药，同时联合用药的药效强于吉西他滨和厄罗替尼的联合用药。体内实验采用了人胰腺癌MIA-papa-2(敏感株)和Aspc-1(耐药株)裸鼠移植瘤模型，证实在MIA-papa-2(敏感株)裸鼠移植瘤模型中，两者联用具有协同作用。而在Aspc-1(耐药株)裸鼠移植瘤模型中，虽然单独使用吉西他滨疗效不佳，但与DTLL联用后，能显著抑制肿瘤的生长。同时利用人源性异体移植胰腺癌模型(PDX)来评价联合给药的体内药效学。

发明效果：

本发明的积极效果在于发现了一种新型药物与传统化疗药物吉西他滨的联合用药，能提高药物对难治性恶性肿瘤胰腺癌的治疗疗效，并可改善吉西他滨对部分胰腺癌的耐药性。此发现在胰腺癌的治疗中有良好的应用前景。

附图说明：

图1a:免疫融合蛋白DTLP的蛋白质序列。

图1b:双靶向配体化力达霉素DTLL中发色团的结构式。

图2a:Biacore测定融合蛋白DTLP与EGFR的亲和作用。

图2b:Biacore测定融合蛋白DTLP与HER-2的亲和作用。

图3a:融合蛋白DTLP和辅基蛋白LDP与EGFR的亲和作用。其中：

DTLP，

LDP。重复三次计算标准差值(SD)，数据以平均值(mean) ±标准差值(SD)表示，采用prism 6软件进行数据分析。

图3b:融合蛋白DTLP和辅基蛋白LDP与HER-2的亲和作用。其中：

DTLP，

LDP。重复三次计算标准差值，数据以平均值±标准差值表示，采用prism 6软件进行数据分析。

图4a:6株胰腺癌细胞的EGFR和HER-2的表达量。

图4b:6株胰腺癌细胞的EGFR和HER-2的表达量的灰度扫描结果。其中：■EGFR表达量，

HER-2表达量。利用Image J进行灰度扫描，取三次实验中受体表达量的光密度平均值。相对受体表达量＝本株细胞的受体表达量/六株细胞受体表达总量x 100，重复三次计算标准差值，所得结果的统计图，数据以平均值±标准差值表示，采用prism 6软件进行数据分析。

图5:融合蛋白DTLP与6株胰腺癌细胞之间的亲和活性。其中：

Aspc-1，

MIA-paca-2，

CFPAC1，

panc0403，

Hup-T3

Su86.86。

图6:细胞免疫荧光法检测融合蛋白DTLP结合在胰腺癌细胞 MIA-paca-2的细胞膜上，其中：蓝色荧光代表用DAPI染色的细胞核；绿色荧光代表由FITC标记的融合蛋白DTLP，MERGE为将DAPI图和 DTLP图叠加所得。

图7:用激光共聚焦显微镜检测融合蛋白DTLP与EGFR和HER2在细胞系MIA-paca-2的共定位情况。其中：蓝色荧光代表用DAPI染色的细胞核；绿色荧光代表由FITC标记的融合蛋白DTLP；红色荧光代表由抗EGFR一抗，抗HER2的一抗和荧光二抗检测出的膜蛋白EGFR和HER2；MERGE为将DAPI图，DTLP图以及抗EGFR抗体或抗HER2 抗体图叠加所得。

图8a:活体成像检测不同时间内融合蛋白DTLP在MIA-paca-2荷瘤小鼠体内的分布，图8b:活体成像仪检测72h后荷瘤小鼠肿瘤部位以及各个脏器内的荧光分布。其中：1瘤子，2心，3肺，4肝，5脾，6胃 7肾，8膀胱。

图9:双靶向配体化力达霉素DTLL对6株胰腺癌细胞的生长抑制作用。其中：

DTLL，

LDM，

吉西他滨，

拉帕替尼，LDM、吉西他滨、拉帕替尼作为阳性对照。细胞存活率＝(实验组OD450－调零孔OD450)/(空白对照组OD450－调零孔OD450)x 100％

图10a:双靶向配体化力达霉素DTLL和力达霉素(LDM)对胰腺癌 MIA-paca-2细胞凋亡的影响。其中：分别给予浓度为0.1nM和1nM的 DTLL和LDM作用24h后，用FITC染液和碘化丙啶(PI)染液进行双染后，用流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

图10b:用流式细胞仪检测双靶向配体化力达霉素DTLL和LDM对 MIA-paca-2细胞凋亡影响的统计图。其中：■LDM，

DTLL，重复三次计算标准差值，所得结果的统计图，数据以平均值±标准差值表示，采用prism 6软件进行数据分析，*代表DTLL组与LDM组相比有显著差异，P<0.05；**代表DTLL组于LDM组相比有显著差异，P<0.01。图11a:双靶向配体化力达霉素DTLL对人胰腺癌MIA-paca-2裸鼠移植瘤的生长抑制作用。其中：

对照组，

拉帕替尼(75mg/kg)，

吉西他滨(60mg/kg)，

LDM(0.05mg/kg)，

DTLP(1mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)，

DTLL(0.075mg/kg)。

拉帕替尼口服给药，75mg/kg，每天一次，共25天；吉西他滨腹腔注射给药，60mg/kg，一周一次，给药三次；DTLP,DTLL和LDM经尾静脉注射给药，十天给药一次，共给药两次；纪录裸鼠移植瘤体积的大小。**与对照相比，P<0.01；***与对照相比，P<0.001；###与LDM相比，P<0.001。

图11b:双靶向配体化力达霉素DTLL对人胰腺癌MIA-paca-2荷瘤裸鼠体重的影响。其中：

对照组，

拉帕替尼(75mg/kg)，

吉西他滨(60mg/kg)，

LDM(0.05mg/kg)，

DTLP(1mg/kg)，

DTLL (0.05mg/kg)，

DTLL(0.075mg/kg)。

图12:苏木素－伊红(H&E)染色测定双靶向配体化力达霉素DTLL和 LDM对MIA-paca-2模型动物各个脏器的影响。其中：HE染色(400×) 测定双靶向配体化力达霉素DTLL(0.05mg/kg)和对照组LDM(0.05 mg/kg)对MIA-paca-2异种移植瘤裸鼠各个脏器的影响，实验组与对照组在实验动物的心，肝，脾，肺，肾，肠，胃和骨等部位均无明显的毒性反应。

图13:Tunel染色检测双靶向配体化力达霉素DTLL和LDM对 MIA-paca-2模型动物肿瘤细胞凋亡的影响。其中：蓝色荧光代表用DAPI 染色的细胞核；红色荧光代表由tunel染色的断裂的DNA，MERGE为将DAPI图和TUNEL图叠加所得。

图14:免疫组化测定双靶向配体化力达霉素DTLL和LDM对 MIA-paca-2模型动物肿瘤增值的影响；其中：用荧光显微镜(400×)观察染色结果，棕色深染部分为ki67染色区，蓝色染色为细胞核。

图15a:RNAseq测序和全转录组芯片分析数据确定不同胰腺癌患者

异体移植模型(PDX)中的EGFR的表达水平。

其中：红色代表PA1338模型细胞中EGFR的表达水平；

黄色代表PA3029模型细胞中EGFR的表达水平；

图15b:RNAseq测序和全转录组芯片分析数据确定不同胰腺癌患者

异体移植模型(PDX)中的HER-2的表达水平。

其中：红色代表PA1338模型细胞中EGFR的表达水平；

黄色代表PA3029模型细胞中EGFR的表达水平；

图16a:双靶向配体化力达霉素DTLL对人源性PA1338异种移植瘤的生长抑制作用。其中：

对照组，

DTLL(0.1mg/kg)，从分组的第一天开始给药，共给药3周，对照组尾静脉给予PBS，每周给药一次，共3 周；DTLL经尾静脉注射给药，每周给药一次，共给药三周；纪录裸鼠移植瘤体积的大小,***与对照组相比，P<0.001

图16b:双靶向配体化力达霉素DTLL对人源性PA1338异种移植瘤的荷瘤裸鼠体重的影响。其中：

对照组，

DTLL(0.1mg/kg)。

图17a:双靶向配体化力达霉素DTLL对人源性PA3029异种移植瘤的生长抑制作用。其中：

对照组

DTLL(0.1mg/kg)。从分组第一天开始给药，共给药3周，停药后观察，39天时处死动物。对照组尾静脉给予PBS，每周给药一次，共3周；DTLL经尾静脉注射给药，每周给药一次，共给药两周，第三周给予0.05mg/kg，一周2次；纪录裸鼠移植瘤体积的大小。

图17b:双靶向配体化力达霉素DTLL对人源性PA3029异种移植瘤的荷瘤裸鼠体重的影响。其中：

对照组，

DTLL(0.1mg/kg)。

图18a:双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药对胰腺癌细胞系MIA-paca-2克隆形成的影响。其中：

DTLL，

LDM，

吉西他滨，

DTLL+吉西他滨，^代表联合给药组与吉西他滨组相比有显著差异，P<0.05。

图18b:双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药对胰腺癌细胞系AsPC-1克隆形成的影响。其中：

DTLL，

LDM，

吉西他滨，

DTLL+吉西他滨，^^代表联合给药组与吉西他滨组相比有显著差异，P<0.01。

图19a:双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药与厄罗替尼和吉西他滨联合用药对MIA-paca-2体外疗效的比较。其中：

DTLL，

厄罗替尼，

吉西他滨，

厄罗替尼+吉西他滨，

DTLL+吉西他滨，^^代表联合给药组与吉西他滨组相比有显著差异，P<0.01。

图19b:双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药与厄罗替尼和吉西他滨联合用药对AsPC-1体外疗效的比较。其中：

DTLL，

厄罗替尼，

吉西他滨，

厄罗替尼+吉西他滨，

DTLL+吉西他滨， ^^代表联合给药组与吉西他滨组相比有显著差异，P<0.01。

图20a:双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药对人胰腺癌MIA-paca-2裸鼠移植瘤的生长抑制作用。其中：

对照组，

吉西他滨(60mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)+吉西他滨(60mg/kg)，**与对照相比，P<0.01；***与对照相比，P<0.001， ^^与吉西他滨组相比,p<0.01。

图20b:双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药对人胰腺癌MIA-paca-2荷瘤裸鼠体重的影响。其中：

对照组，

吉西他滨 (60mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)+吉西他滨 (60mg/kg)。

图21a:双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药对人胰腺癌AsPC-1裸鼠移植瘤的生长抑制作用。其中：

对照组，

吉西他滨(60mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)+吉西他滨(60mg/kg)，**与对照相比，P<0.01；^^与吉西他滨组相比,p<0.01。图21b:双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药对人胰腺癌AsPC-1荷瘤裸鼠体重的影响。其中：

对照组，

吉西他滨 (60mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)+吉西他滨 (60mg/kg)，**代表吉西他滨组和联合给药组的动物体重与对照组相比， P<0.01。

图22a:双靶向配体化力达霉素DTLL和吉西他滨联合用药对人源性 PA3142异种移植瘤的生长抑制作用。其中：

对照组，

吉西他滨 (60mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)，

吉西他滨(60mg/kg)+DTLL (0.025mg/kg)，***与对照组相比，P<0.001，^与吉西他滨组相比,p<0.05。图22b:双靶向配体化力达霉素DTLL对人源性PA3142异种移植瘤的荷瘤裸鼠体重的影响。其中：

对照组，

吉西他滨(60mg/kg)，

DTLL(0.05mg/kg)，

吉西他滨(60mg/kg)+DTLL(0.025mg/kg)。

图23a:双靶向配体化力达霉素DTLL和吉西他滨联合用药对人源性 PA1233异种移植瘤的生长抑制作用。其中：

对照组，

吉西他滨 (60mg/kg)，

DTLL(0.1mg/kg)，

吉西他滨(60mg/kg)+DTLL (0.05mg/kg)，*与对照组相比，P<0.05，^与吉西他滨相比,p<0.05。

图23b:双靶向配体化力达霉素DTLL对人源性PA1233异种移植瘤的荷瘤裸鼠体重的影响。其中：

对照组，

吉西他滨(60mg/kg)，

DTLL(0.1mg/kg)，

吉西他滨(60mg/kg)+DTLL(0.05mg/kg)。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述，但所述内容是对本发明的解释而不是限定。

1原料的获得：融合蛋白的构建过程和双靶向配体化力达霉素的体外重建过程参考同时正在申请的专利中有详细阐述(IDC170214)。

<制备例1>融合蛋白DTLP的制备工艺与中试发酵：所用质粒来源于已申请专利(专利公开号：CN101497666A)的保存菌株。表达载体 pET-Ec-LDP-Hr经质粒测序和氨基酸序列的鉴定验证，在发酵温度37℃， IPTG诱导终浓度为0.1mM、菌体起始浓度OD600＝0.6、菌体质量约为 2.6～3.4g时，发酵表达最高产量的融合蛋白DTLP，经定量分析表明每升发酵液最高可获得29.63mg粗提蛋白。正确折叠的融合蛋白DTLP表达于周质腔和胞质可溶性组分，通过Ni+亲和层析柱粗提和分子排阻层析分离纯化后，以HPLC色谱检测其蛋白纯度可达到99.7％。

<制备例2>双靶向配体化力达霉素DTLL的制备工艺与质量标准：采用高活性的力达霉素纯品(专利号：00121527.2)和半制备C4反相色谱柱(Jupiter C4 150mm x 10.0mm

)，以流动相为水：乙腈：三氟乙酸(75％：25％：0.025％)，监测350nm处吸光值，进行力达霉素发色团的分离，再与融合蛋白DTLP以5：1分子比进行体外组装。通过绘制力达霉素发色团标准曲线，代入公式计算峰面积，检测获得DTLL的等效力达霉素浓度的发色团含量；以DTLL中发色团与融合蛋白DTLP分子数的比例计算组装效率为68.33％±7.12％，再以ToxinEraser^TM内毒素去除试剂盒和ToxinSensor^TM Chromogenic LAL内毒素检测试剂盒去除内毒素，采用光度测定法检测样品中内毒素含量，表明符合中国药典关于生物制品中注射剂内毒素限值含量的相关规定。并制定质量控制标准，全程避光冻干，获得每支含等效力达霉素发色团的DTLL，标记日期并保存样品于-80℃低温冰箱。

在本发明中，融合蛋白DTLP为SEQ ID NO：1所示的蛋白质。后续实施例中的融合蛋白DTLP来自前述制备例，双靶向配体化力达霉素DTLL为SEQ ID NO：1所示的蛋白质和下式(I)所示的发色团的组装产物：

后续实施例中的双靶向配体化力达霉素DTLL来自前述制备例。

实施例1.融合蛋白DTLP与受体EGFR和HER2的亲和性

1.Biacore分析融合蛋白与受体的亲和性

为了确证融合蛋白对受体的靶向性，我们分别将EGFR和HER-2受体与C₅芯片耦合后，将制备例得到的DTLP配制不同浓度，利用生物大分子相互作用仪分析此蛋白与两种受体的亲和活性，分别计算亲和常数。

(1)配体预富集

将配体---蛋白EGFR和HER2(Sino Biological,Life Technologies) 偶联到芯片上时，需要把蛋白溶解在PH值低于其等电点的溶液中，此时蛋白表面的净电荷值为正。在流经芯片表面时，可以通过静电吸附的作用结合到芯片表面的羧基(电荷为负)上，但是过低的PH值会影响蛋白的活性，因此我们用预富集的方式，寻找最佳浓度和PH值等合适的条件。

(2)配体偶联

通过预富集寻找到最佳偶联条件后，将蛋白EGFR和HER2分别与 C₅芯片进行偶联，保证R_L值在适合的范围内。

(3)进样

将我们在制备例1中制备的融合蛋白DTLP依次进行二倍梯度稀释 (4.58μM,2.29μM,1.15μM,0.57μM,0.29μM)后分别进样，测定融合蛋白 DTLP与其受体EGFR和HER-2的亲和性。

Biacore结果显示融合蛋白DTLP可以与EGFR(图2a)和HER-2 (图2b)相结合，其对两种受体的亲和速率、解离速率以及平衡常数分别如下：EGFR：k_a(M^-1s^-1)＝3.35x10⁴，k_d(s^-1)＝2.29x10^-3，KD(M)＝6.84x10^-8； HER-2：k_a(M^-1s^-1)＝2.05x10⁴，k_d(s^-1)＝1.62x10^-3，KD(M)＝7.90x10^-8，证明了我们的融合蛋白与受体有很强的亲和活性，且融合蛋白对EGFR的亲和力强于对HER-2的亲和力。

2.受体包被的ELISA实验分析融合蛋白与受体的亲和性

(1)分别配制1μg/ml的EGFR和HER-2受体溶液，100μl/孔铺与ElISA 板上，4℃包被过夜。

(2)包被好的板子用PBS洗3次后，用1％BSA/PBS溶液以200μl/孔于室温下封闭2小时。

(3)用PBST缓冲液(PBS中含有0.05％的Tween-20)洗3次。

(4)将制备例制备中得到的融合蛋白以及阴性对照蛋白LDP(力达霉素辅基蛋白，是一种重组蛋白，来源于我所制备)分别以相同浓度倍比稀释加入到ElISA板上，50μl/孔，每个浓度设3个平行孔，4℃孵育过夜。

(5)用PBST洗3次后，加入抗LDP单抗(1：1000)稀释，50μl/孔， 37℃温育2小时。

(6)用PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(1： 1000)稀释，50μl/孔，37℃温育2小时。

(7)用PBST洗板5次，加入100μl/孔的底物反应液TMB，室温避光反应20分钟。以2M的硫酸100μl/孔终止反应，立即在酶标仪上测定 450nm的吸光值。

结果表明，融合蛋白DTLP与EGFR(图3a)和HER2(图3b)的亲和性远强于LDP蛋白，且其亲和活性在一定范围内程浓度依赖性，并最终达到饱和。再次验证了此融合蛋白DTLP具有靶向特异性。

实施例2.融合蛋白DTLP能够与胰腺癌细胞亲和且其亲和活性与细胞上受体表达量成正相关

1.Western检测6株胰腺癌细胞表面EGFR和HER2的表达量

(1)制备蛋白样品

取对数生长期的细胞(本发明所述所有细胞均来自梅奥医学中心，分子药理学与实验治疗系的汪教授馈赠)，用预冷的PBS洗3次，在冰上用细胞刮子轻轻的刮下细胞。加入RIPA裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)，于冰上裂解30分钟。之后在4℃，12000rpm离心20分钟，收集上清液。用BCA试剂盒进行蛋白定量。取适量蛋白溶液与5x loding混合后，沸水浴中变性5分钟。

(2)Western blot

配制10％的PAGE胶，上样前述不同胰腺癌细胞制备好的蛋白样品， 80V电泳过浓缩胶后转120V电泳至溴酚蓝扩散出胶。转膜(250mA 2 小时)，转膜完成后于5％牛奶中封闭2小时，切取相应条带后封EGFR 和HER2的一抗，4℃过夜，洗膜后封二抗2小时，洗膜后曝光。

2.ELISA法分析融合蛋白对6株胰腺癌细胞的免疫反应性

(1)人胰腺癌细胞系AsPC-1；MIA-paca-2；CFPAC-1；Panc 0403； Hup-T3和SU86.86以3×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板(不同细胞的大小以及生长速度有差异，本数量是以AsPC-1细胞为例，其他的细胞以24小时长满96孔板为准)，37℃培养24小时后用PBS洗3次(3 分钟/次)，加入4℃预冷的0.05％戊二醛50μl/孔，于4℃固定细胞30分钟。

(2)固定好的细胞用PBS洗3次后，用1％BSA/PBS溶液以200μl/孔于4℃封闭2小时。

(3)用PBST缓冲液(PBS中含有0.05％的Tween-20)洗3次。

(4)将融合蛋白倍比稀释加入到96孔板中，50μl/孔，每个浓度设3个平行孔，4℃孵育过夜。

(5)用PBST洗3次后，加入抗His-tag单抗(1：1000)稀释，50μl/ 孔，37℃温育2小时。

(6)用PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(1： 1000)稀释，50μl/孔，37℃温育2小时。

(7)用PBST洗板5次，加入100μl/孔的底物反应液TMB，室温避光反应20分钟。以2M的硫酸100μl/孔终止反应，立即在酶标仪上测定 450nm的吸光值。

结果显示，Werstern blot(图4)检测出了6株胰腺癌细胞系中EGFR和 HER-2的表达量，ELISA结果(图5)显示融合蛋白DTLP能够与不同程度表达EGFR和HER-2的胰腺癌细胞亲和，且亲和活性与受体表达量呈正相关。

实施例3.融合蛋白DTLP能够结合到胰腺癌MIA-paca-2细胞的膜上并与受体实现共定位

1.细胞免疫荧光法分析融合蛋白DTLP与MIA-paca-2细胞的结合活性将MIA-paca-2细胞(EGFR与HER2均高表达)以4×10⁴的密度接种到放有盖玻片的六孔板中，37℃培养24小时后用PBS洗3次，加入甲醇于室温固定10分钟，吸弃甲醇，再次加入甲醇置于-20℃固定10分钟， PBS洗3次；加入FITC标记的融合蛋白DTLP(1μM)，于4℃避光孵育1小时，然后PBS洗5次。用含有封片剂DIPA封片后于激光共聚焦显微镜下观察并照相。

细胞免疫荧光化学法(图6)显示，融合蛋白DTLP能够结合在EGFR 和HER-2皆高表达的细胞系MIA-paca-2的细胞膜上。

2.利用激光共聚焦显微镜检测融合蛋白与EGFR和HER2在细胞系 MIA-paca-2的共定位情况

(1)选择EGFR和HER2都高表达的细胞株MIA-paca-2进行检测，以 4×10⁴的密度接种到放有盖玻片的六孔板中，37℃培养24小时。

(2)用PBS洗3次，加入甲醇于室温固定10分钟，吸弃甲醇，再次加入甲醇置于-20℃固定10分钟。

(3)PBS洗3次，用5％的BSA于室温下封闭2小时。

(4)PBS洗3次，加入抗EGFR或HER2抗体(1:500稀释)200μl/ 孔，4℃孵育1小时。

(5)PBS洗3次，用红色荧光标记的羊抗兔的荧光二抗(1:200稀释) 200μl/孔，再避光孵育半小时。

(6)PBS洗3次，加入FITC标记的融合蛋白DTLP(1μM)，于4℃避光孵育1小时，然后PBS洗5次。用含有封片剂DIPA封片后于激光共聚焦显微镜下观察并照相。

结果显示，融合蛋白DTLP在细胞系MIA-paca-2上与EGFR和HER2 能共定位(图7)。再次印证了融合蛋白DTLP的结合靶点确为EGFR和 HER2。

实施例4.融合蛋白DTLP可靶向荷瘤动物的肿瘤部位并积累

利用FITC标记融合蛋白DTLP，调整标记后的浓度为1.5mg/ml，尾静脉注射MIA-paca-2荷瘤裸鼠200μl/只，按照1h，2h，4h，8h，12h， 24h，48h和72h的时间间隔分别在活体成像仪上分析荧光的体内分布情况。72h后处死小鼠，分别摘取实验小鼠的心，肺，肝，脾，胃，肾，膀胱和瘤子，利用活体成像仪分析各个脏器中的荧光含量。

实验结果显示(图8a)，注射1小时后，已有融合蛋白DTLP达到肿瘤内部。随着时间的延长，该融合蛋白在肿瘤部位积累量逐渐增加， 24小时达到峰值，随后逐渐减弱。72h后摘取荷瘤小鼠的肿瘤，心，肝，脾，胃，肠，肾，肺等脏器，进一步分析其荧光强度，结果可见(图8b) 荧光主要聚集在肿瘤部位。证明了此融合蛋白在体内也具有良好的靶向特异性，从而能更好的发挥其靶向肿瘤(多数高表达EGFR/HER-2)的作用。

实施例5.双靶向配体化力达霉素DTLL对多种胰腺癌细胞具有增殖抑制作用

取对数生长期的AsPC-1、MIA-paca-2、CFPAC-1、panc04.03、 Hup-T3和SU86.86细胞用胰酶消化后计数，以5000个细胞/孔接种于96 孔板中(本数量是以AsPC-1细胞为例，不同细胞的生长速度不同，接种量也不相同，以未加药的细胞72小时长满96孔板为原则)，37℃培养 24小时后吸弃培养液，加入以培养液稀释的不同浓度的双靶向配体化力达霉素DTLL(来自我们在制备例2中所制备的药品)，力达霉素，吉西他滨和拉帕替尼各200μl/孔，每个药物浓度设三个平行孔，继续培养 48小时后，每孔加入MTS反应液20μl，37℃继续培养1-4小时后，在酶标仪上测定450nm处的吸光值。每次实验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔，按下面公式计算细胞的存活率：细胞存活率＝(A加药组-A 空白组)/(A对照组-A空白组)×100％

MTS法测定结果(图9)表明，双靶向配体化力达霉素DTLL对胰腺癌细胞系AsPC-1、MIA-paca-2、CFPAC-1、panc04.03、Hup-T3和 SU86.86均有强烈的杀伤作用。对于不同的细胞系，DTLL的杀伤作用与该细胞表面EGFR和HER2的表达水平存在一定的相关性，EGFR和HER2高表达的细胞系对DTLL表现出比力达霉素更高的敏感性。

实施例6.双靶向配体化力达霉素DTLL诱导胰腺癌MIA-paca-2细胞凋亡

MIA-paca-2细胞以4×10⁴/ml的密度铺于6孔板中，24h后加药。分别加入终浓度为0.1nM和1nM的DTLL和LDM，另设置对照组。给药处理24h后把各组细胞培养液吸出至合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。加入之前收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g离心5 分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞；加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果，之后用流式细胞仪进行检测。

细胞凋亡实验(图10)表明双靶向配体化力达霉素DTLL和LDM均可诱导胰腺癌MIA-paca-2细胞的凋亡，且在等摩尔浓度的条件下DTLL 表现出比LDM更强的促凋亡作用，且具有统计学差异。

实施例7.双靶向配体化力达霉素DTLL抑制人胰腺癌MIA-paca-2裸鼠移植瘤的生长(编号：Yss-2017-D07-0018)

选取对融合蛋白DTLP亲和活性和双靶向配体化力达霉素DTLL敏感性都较强的MIA-paca-2细胞进行体内抗肿瘤活性评价。取体重为 18-22g的雌性BALB/c裸鼠35只，将人胰腺癌MIA-paca-2细胞接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种1×10⁷个细胞。待瘤子长至100mm³大小时，将裸鼠按照瘤子大小和体重进行分组，使每组瘤子大小平均值约为100mm³，且各组体重平均值接近，每组5只裸鼠。同时灌胃给予拉帕替尼(75mg/kg)，每天一次。在第一天和第十天时腹腔注射吉西他滨(60mg/kg)，尾静脉注射力达霉素(0.05mg/kg)，融合蛋白DTLP(1mg/kg)和不同浓度的双靶向配体化力达霉素DTLL (0.05mg/kg、0.075mg/kg)，以上药物均给药两次，每只裸鼠注射200μl，对照组不做任何处理。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V＝ab²/2计算肿瘤体积(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线，观察体重变化。实验第25天处死动物，分离肿瘤并称重，计算抑瘤率。

实验结果表明(图11a，表1)，双靶向配体化力达霉素DTLL可显著的抑制人胰腺癌MIA-paca-2裸鼠移植瘤的生长，其中0.05mg/kg和 0.075mg/kg剂量组的抑瘤率分别为85.9％±3.7％和88.9％±4.8％，均表现出比0.05mg/kg(耐受剂量)的力达霉素(抑瘤率为68.1％±5.5％)更强的肿瘤生长抑制作用，具有显著统计学差异，P<0.001。在整个实验治疗期间，0.05mg/kg和0.075mg/kg剂量组的动物体重变化分别为 -1.41％±0.34％和-6.61％±0.14％，体重变化未超过10％，下降不明显(图 11b)，可耐受所给的剂量。证明双靶向配体化力达霉素DTLL能显著的抑制人胰腺癌MIA-paca-2裸鼠移植瘤的生长。

表1.双靶向配体化力达霉素DTLL对人胰腺癌MIA-paca-2裸鼠移植瘤的生长抑制

**与对照组相比，P<0.01；***与对照组相比，P<0.001；

###与LDM组相比，P<0.001

实施例8.苏木素－伊红(H&E)染色测定双靶向配体化力达霉素DTLL 和LDM对MIA-paca-2模型动物各个脏器的影响

实验结束后处死动物，摘取MIA-paca-2模型小鼠心，肝，脾，肺，肾，肠，胃，骨和瘤等，进行固定后石蜡包埋。将石蜡切片置于烘箱中烤1h，进行梯度脱蜡脱水。在苏木素中染10分钟，在流水中冲洗去除余色。1％的盐酸酒精分化数秒后流水冲洗，返蓝15-30分钟。酒精性伊红染色30s，洗去浮液。95％酒精放置2min，重复一次，无水乙醇中脱水2min，重复三次。二甲苯中透化3-5min，重复二次。中性树胶封片，平置晾干后于显微镜下进行观查并拍照。

HE染色结果显示(图12)，双靶向配体化力达霉素DTLL(0.05mg/kg) 和对照组LDM(0.05mg/kg)实验动物的心脏内膜层，心肌层和外膜层结构完整，均匀致密；肝小叶结构完整，纹理清晰，肝细胞排列规则；脾脏的脾小体结构清晰，无细胞核固缩现象。肺泡区无炎性浸润，膈无增厚现象且间质无水肿，出血和坏死等现象；肾小球结构完整，无肿胀，坏死和炎性浸润等等现象；小肠基底细胞排列整齐；骨密度没有明显变化，造红细胞，粒细胞和巨核细胞等分布均匀。以上各切片观察与对照组相比无明显差异，证明给药组对于实验动物的各个脏器组织均无明显的毒性反应。

实施例9.Tunel染色检测双靶向配体化力达霉素DTLL和LDM对 MIA-paca-2模型动物肿瘤细胞凋亡的影响

取对照组，LDM组和DTLL组实验动物肿瘤组织的石蜡切片，进行梯度的脱蜡脱水。置于二甲苯中浸泡10min×3次；去除多余的液体后, 置于无水乙醇中,浸泡3min×3次；去除多余的液体后,置于95％乙醇中, 浸泡3min×2次；去除多余的液体后,置于75％乙醇中,浸泡3min×2次；蒸馏水冲洗1min。在37℃用蛋白酶K处理切片15min，PBS缓冲液洗涤3min×3次。加入配制好的tunel反应液(50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP)适量，37℃湿盒内反应1h，PBS缓冲液洗涤3min×3次。用含封片剂的DAPI封片后，于荧光显微镜下观察并拍照。

基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)的催化下，加上荧光素(FITC)标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜进行检测，因此我们利用TUNEL法来检测动物肿瘤组织中的细胞凋亡，它可以在动物组织样本中进行凋亡小体的原位染色，在荧光显微镜下，凋亡的DNA呈现红色荧光。Tunel染色结果显示(图13)， DTLL组较LDM组有更强的促凋亡的作用。也就是说，DTLL表现出比LDM更强的药效，其机制可能主要是通过与肿瘤细胞更强的亲和性，使DTLL能更多的吸附于肿瘤细胞表面，从而能特异的发挥其所携带的“弹头”药物的作用，对肿瘤组织的抑制增殖和促凋亡的影响更显著。

实施例10.免疫组化测定双靶向配体化力达霉素DTLL和LDM对 MIA-paca-2模型动物肿瘤增殖的影响

取对照组，LDM组和DTLL组实验动物肿瘤组织的石蜡切片，置于二甲苯中浸泡10min×3次；去除多余的液体后,置于无水乙醇中,浸泡3 min×3次；去除多余的液体后,置于95％乙醇中,浸泡3min×2次；去除多余的液体后,置于75％乙醇中,浸泡3min×2次；蒸馏水冲洗1min。加入适量配制好的抗原修复液(1mmol/L EDTA PH 9.0)至没过所有切片,放入微波炉中高火加热至沸腾2min,继续转中火加热10min。取出后自然冷却至室温PBS缓冲液洗涤3min×3次。加入适量的内源性过氧化物酶阻断剂,室温孵育10min；PBS缓冲液冲洗3min×3次。加入0.5％的 Trition-100至没过切片，摇床上透化1h,PBS缓冲液冲洗3min×3次。用5％的BSA室温封闭2h，PBS缓冲液冲洗3min×3次。根据组织大小,滴加100μl的ki-67一抗,4℃孵育过夜；PBS缓冲液冲洗3min×3次。滴加100μl或适量的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG聚合物,室温孵育1h,PBS缓冲液冲洗3min×3次。加入适量新鲜配制的DAB显色液, 室温孵育5～8分钟。自来水冲洗,苏木素染色液孵育3min后，用1％的盐酸酒精分化数秒后流水冲洗，返蓝15-30分钟。脱水，透明，用中性树胶封片，平置晾干后于显微镜下进行观查并拍照。

Ki67是一种核抗原，它的表达与细胞分裂周期具有紧密的联系。已知静止期的细胞不表达Ki67，而处于分裂期的细胞则大量表达Ki67。因此，它已成为判断肿瘤细胞活跃程度的一个非常重要的指标。免疫组化的结果显示(图14)，LDM组和DTLL组较对照组相比ki67的表达量减少，且DTLL组比LDM组呈现更显著的减少，表明DTLL比LDM 更能抑制荷瘤小鼠中肿瘤细胞的增值。

实施例11.双靶向配体化力达霉素对人源性异体移植胰腺癌模型(PDX) 的体内药效学研究。

1.双靶向配体化力达霉素DTLL对人源性PA1338异种移植瘤的生长抑制作用

利用RNAseq测序和全转录组microarry分析数据确定不同胰腺癌患者

异体移植模型(PDX)中的EGFR和HER-2的表达水平，选取EGFR和HER-2高表达的胰腺癌PDX模型---PA1338(图15；红色) 进行实验。从

胰腺癌异体移植模型PA1338荷瘤小鼠中收取肿瘤组织，切成[2-4mm]直径的瘤块接种于Balb/c裸小鼠右前部皮下。当荷瘤鼠平均肿瘤体积到达200mm³左右时,将小鼠随机分为2组，每组5 只。各组间的肿瘤体积的变异系数(CV)用公式CV＝SD/MTV×100％计算，应小于40％。分组当天设为实验第0天，给药开始于第0天。实验分为阴性对照组和药物治疗组，对照组尾静脉注射不含药的溶媒PBS，每周给药一次，共给药3次；双靶向配体化力达霉素DTLL(0.1mg/kg) 经尾静脉注射给药，每周给药一次，共给药3次。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V＝ab2/2计算肿瘤体积(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线，观察体重变化。给药周期结束后，于分组后的第26天处死动物，分离肿瘤并称重，计算抑瘤率。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)方法进行肿瘤体积分析,方差齐时采用 Tukey检验，方差不齐时采用Games-Howell检验进行事后检验。

2.双靶向配体化力达霉素DTLL对人源性PA3029异种移植瘤的生长抑制作用

利用RNAseq测序获得的全转录组数据，分析确定不同胰腺癌患者

异体移植模型(PDX)中的EGFR和HER-2的表达水平，选取EGFR和HER-2低表达的胰腺癌PDX模型---PA3029(图15；黄色) 进行实验，具体步骤如上。分组当天设为实验第0天，给药开始于第0 天。实验分为阴性对照组和药物治疗组，对照组尾静脉注射不含药的溶媒PBS，每周给药一次，共给药4次；双靶向配体化力达霉素DTLL (0.1mg/kg)经尾静脉注射给药，每周给药一次，给药2周后剂量减半，为0.05mg/kg，一周给药两次，给药一周。由于药物抑瘤效果不明显，给药周期结束后进行停药观察。实验结束于分组后的第39天。

本实验主要评价了雌性B/C nude小鼠中双靶向配体化力达霉素 DTLL治疗

异体移植胰腺癌模型PA1338和PA3029的药效。在PA1338移植瘤实验(图16a，表2)中，溶媒对照组和给药组荷瘤小鼠平均体重变化率(图16b)分别为-1.19％和-9.75％，整个实验过程中未出现小鼠死亡的现象，实验动物对药物的耐受性良好。溶媒对照组在给药三周后(第25天)平均肿瘤体积达到1961.25±202.51mm³。受试药 ELHA在给药三周后，平均肿瘤体积达到850.59±95.25mm³，最大抑瘤率可达56.63±9.71％，与溶媒组相比有显著性差异(P<0.001)。综上所述, 受试药DTLL对

胰腺癌异体移植模型PA1338的肿瘤生长具有良好的抑制作用。

在PA3029移植瘤实验中，荷瘤鼠对DTLL耐受性不是很好，故调整第三周的给药方案，尾静脉注射DTLL 0.05mg/kg，一周内给药2次。实验期间溶媒对照组和给药组荷瘤小鼠的平均体重变化率(图17b)分别为4.78％和-0.34％。DTLL处理组一只小鼠于实验第35天发现死亡。溶媒对照组在给药三周后(第28天)平均肿瘤体积达到857.24±81.95mm³。受试药DTLL在给药三周后，平均肿瘤体积达到604.87±59.23mm³，最大抑瘤率为29.44±13.82％，平均肿瘤体积低于溶媒对照组但与之相比无显著性差异(P>0.05)。综上所述,受试药DTLL对

胰腺癌异体移植模型PA3029的肿瘤生长仅具有轻微抑制作用。

表2.DTLL对人源性异体移植胰腺癌模型(PDX)的体内药效学研究

***与本组对照组相比，P<0.001；

PDX模型是一种来源于人体新鲜肿瘤组织的移植模型。这种模型能够保持与病人相似的遗传特性和肿瘤异质性，同时反应患者肿瘤的遗传多样性，在抗肿瘤药物开发和分子生物学机制研究中发挥了重要作用。我们都知道，在肿瘤治疗研究中，面临的最大挑战是临床前试验的模型不能完全的模拟临床上的状况，因而造成实验结果无法成功的应用于临床。事实上，尽管很多治疗方法在小鼠模型上非常有效，但应用于人体时，疗效就会大大减低，甚至不足10％，其原因主要是缺乏响应个性化药物的敏感人群。而PDX模型能复制病人肿瘤的异质性，建立反应患者自身特征的药物评价体系，较好的解决了上述临床预见性的问题，因此在肿瘤的研究领域拥有广泛的应用前景。

我们的PDX模型动物实验结果显示，首先通过RNAseq测序获得的全转录组数据，分析了PA1338(红色)和PA3029(黄色)中的EGFR (图15a)和HER-2(图15b)的表达水平，由图中可见，两者的HER-2 表达水平差别不大，而EGFR的表达量PA1338(红色)明显高于PA3029(黄色)。而在药效方面，与低表达EGFR的PDX模型(PA3029)相比，该双靶向配体化力达霉素对EGFR高表达的PDX模型(PA1338)有更显著的抑制胰腺癌生长的作用。由此可见，双靶向配体化力达霉素DTLL 具较好的靶向特异性，且肿瘤组织中的EGFR的表达量起了关键性作用。我们的双靶向配体化力达霉素DTLL能够有效地抑制EGFR高表达的 PDX模型的胰腺癌生长，为此药的临床前药效学研究奠定了可靠的实验基础。

实施例12.克隆形成实验检测双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药对胰腺癌细胞的作用

在MTS实验中我们发现，胰腺癌细胞系AsPC-1对于化疗药物吉西他滨和双靶向配体化力达霉素DTLL的敏感度均不高，杀伤效果不佳。那么二者联合用药时是否能够改变其耐药的现象呢，因此我们尝试进行联合给药来逆转AsPC-1对于吉西他滨的耐药。

将胰腺癌细胞系AsPC-1和MIA-paca-2分别接种于6孔板中，每孔 2000个细胞，细胞贴壁后给药。24小时后弃去含药的培养基，用胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，计数后重新铺于6孔板中，每孔500个细胞。轻轻混匀后放入细胞培养箱中，静置培养7-10天。出现符合要求的克隆时终止培养，弃去培养基，用PBS小心的洗一次，加入甲醇固定细胞15 分钟。弃去固定液，用结晶紫染液染色10-30分钟后，用少量的水缓慢洗去染色液，于空气中干燥。计数，根据公式计算克隆形成率。

克隆形成率(％)＝克隆数/接种细胞数×100％

结果显示，双靶向配体化力达霉素DTLL和吉西他滨对MIA-paca-2 细胞(图18a)的抑制克隆形成的作用较强，但联合用药时，表现出更强的抑制效果，与吉西他滨单独给药组相比有显著性差异，p<0.05。证明双靶向配体化力达霉素与吉西他滨的联合给药对于敏感性胰腺癌细胞 MIA-paca-2的作用具有协同性。而对于AsPC-1细胞系(图18b)而言，吉西他滨对其抑制效果并不明显，表现出耐药的现象。双靶向配体化力达霉素DTLL虽然能显著抑制AsPC-1细胞系的克隆形成，但其敏感性明显低于其他细胞。而双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨联合用药时表现出极强的抑制效果，其抑制克隆形成的能力与吉西他滨单独给药组相比有显著性差异，p<0.01，联合给药改变了AsPC-1对于药物的敏感性，逆转了它对于吉西他滨的耐药现象。

实施例13.MTS实验检测DTLL/吉西他滨的联合用药与厄罗替尼/吉西他滨联合用药对胰腺癌细胞体外疗效的比较

由于厄罗替尼与吉西他滨的联合给药已经获得美国FDA批准上市用于不可切除或晚期转移性胰腺癌的治疗，那么我们的药物与吉西他滨的联合给药与上述联合给药方式相较有没有优势呢？为了解决这个问题，我们选取对吉西他滨敏感度不同的MIA-paca-2和AsPC-1细胞，进行两种不同方式联合给药的体外药效研究，希望能找到更好的联合给药治疗胰腺癌的方式。MTS的具体操作同实例5，但是用厄罗替尼代替了力达霉素，且新增两组联合给药组－厄罗替尼与吉西他滨的联合给药和 DTLL和吉西他滨的联合给药。联合给药组的给药浓度如图19中横坐标所示，即联合组中两个药物分别以不同稀释度的浓度处理细胞。以MTS 法测定结果(图19)表明，不管是对吉西他滨敏感的MIA-paca-2细胞，还是吉西他滨耐药的AsPC-1细胞，双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药都表现出了惊人的优势，其对细胞的体外杀伤作用远强于厄罗替尼和吉西他滨的联合用药，二者有显著性差异，p<0.01。体外药效实验证明，DTLL与吉西他滨的联合用药，比厄罗替尼和吉西他滨的联合用药更具有优势。

实施例14.双靶向配体化力达霉素和吉西他滨联合给药对于人胰腺癌 MIA-paca-2(敏感株)和AsPC-1(耐药株)裸鼠移植瘤的生长的影响(编号：Yss-2016-D07-0156)

选取对胰腺癌临床一线用药吉西他滨耐受程度不同的胰腺癌细胞 MIA-paca-2(敏感株)和AsPC-1(耐药株)进行裸鼠移植瘤生长抑制实验，评价联合给药的体内抗肿瘤活性。分别选取体重为18-22g的雌性 BALB/c裸鼠各35只，将人胰腺癌MIA-paca-2和AsPC-1细胞接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种1×10⁸个细胞。待瘤子长至100mm³大小时，将裸鼠按照瘤子大小和体重进行分组，使每组瘤子大小平均值约为100 mm³，且各组体重平均值接近，每组5只裸鼠。在第一天和第十天时腹腔注射吉西他滨(60mg/kg)，尾静脉注射双靶向配体化力达霉素DTLL (0.05mg/kg)，联合给药给予吉西他滨(60mg/kg)和DTLL(0.05mg/kg)，以上药物均给药两次，每只裸鼠注射200μl，对照组不做任何处理。实验期间每3天测量一次肿瘤直径和体重，根据公式V＝ab²/2计算肿瘤体积(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)，绘制肿瘤生长曲线，观察体重变化。实验第25天处死动物，分离肿瘤并称重，计算抑瘤率。

实验结果表明(图20a，表3)，吉西他滨和双靶向配体化力达霉素 DTLL的联合给药组对于敏感型胰腺癌MIA-paca-2裸鼠移植瘤模型的抑瘤率可达到90.8％±6.4％，与对照组相比具有统计学差异。与吉西他滨单独给药组相比，也提高了药物的抗肿瘤疗效，存在统计学差异。而动物的体重变化未超过10％，下降不明显(图20b)，可耐受所给的剂量。

图21a显示，吉西他滨和双靶向配体化力达霉素DTLL对于人胰腺癌AsPC-1裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为24.3％±11.8％和37％±2.4％，与对照组相比没有统计学差异。而联合给药组的抑瘤率可达到71.6％±5.6％，远高于对照组和其他给药组且存在统计学差异。表明双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨的联合用药可逆转胰腺癌细胞AsPC-1对于吉西他滨的耐药，此发现对于耐药性胰腺癌的研究提供了新的思路。

表3.双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨联合给药对人胰腺癌MIA-paca-2(敏感株) 和AsPC-1(耐药株)裸鼠移植瘤的生长抑制作用

**与本组对照相比，P<0.01；***与本组对照相比，P<0.001；

^^联合给药组与本组吉西他滨组相比,p<0.01。

实施例15.双靶向配体化力达霉素与吉西他滨联合用药对人源性异体移植胰腺癌模型(PDX)的体内药效学研究。

选取对胰腺癌临床一线用药吉西他滨耐受程度不同的PA3142(敏感株)和PA1233(耐药株)的PDX模型进行联合给药实验，具体实验步骤参照实施例7。分组小鼠为4组，每组3只。敏感株PA3142实验共给药3周，结束于分组后17天，耐药株PA1233实验共给药6周，结束于分组后44天。

在PA3142(吉西他滨敏感株)移植瘤实验(图22，表4)中，荷瘤小鼠平均体重未出现明显下降(图22b)且整个实验过程中未出现小鼠死亡的现象，可见实验动物对药物的耐受性良好。溶媒对照组在给药三周后(第17天)平均肿瘤体积达到2601.04±30.14mm³。吉西他滨在60 mg/kg,每4天给药一次的给药方案下具有显著的肿瘤生长抑制作用。给药三周后(第17天)，平均肿瘤体积达992.24±102.29mm³，最大抑瘤率可达61.86±3.93％，与溶媒对照组相比有显著性差异(P<0.001)。受试药 DTLL在0.05mg/kg,每周给药一次，给药三周的给药方案下也具有显著的肿瘤生长抑制作用。给药三周后，平均肿瘤体积达到 1206.69±301.66mm³，最大抑瘤率可达53.61±11.60％，与溶媒组相比也具有显著性差异(P<0.001)。联合给药组DTLL 0.025mg/kg,每周给药一次 +吉西他滨60mg/kg，每4天给药一次的联合治疗方案表现出显著的肿瘤生长抑制作用。给药三周后，平均肿瘤体积达到515.95±186.46mm³ (第17天)，最大抑瘤率可达80.16±7.17％，与溶媒对照组相比有显著性差异(P<0.001)，而且与吉西他滨单独给药组相比，也存在显著性差异(P<0.05)，由此可见联合给药时提高了药物的治疗效果，更有效的抑制了肿瘤的生长。综上所述,受试药DTLL对

胰腺癌异体移植模型PA3142的肿瘤生长具有良好的抑制作用，且与吉西他滨联合给药时两药具有协同作用。

在PA1233(吉西他滨耐药株)移植瘤实验(图23，表4)中，荷瘤小鼠对DTLL及吉西他滨均可以耐受。实验期间溶媒对照组、吉西他滨 60mg/kg组、DTLL 0.1mg/kg组及吉西他滨+DTLL联合给药组的平均体重变化率(图22b)均未超过10％。溶媒对照组在给药四周后(第28天)平均肿瘤体积达到719.47±153.04mm³。吉西他滨在60mg/kg,每四天给药一次的方案下没有肿瘤生长抑制作用。给药四周后，平均肿瘤体积达635.64±123.43mm³(第28天)，抑瘤率仅为11.65±17.16％，肿瘤体积虽然低于溶媒对照组但与之相比无显著性差异(P>0.05)。受试药 DTLL在0.1mg/kg,每周给药一次，第三周开始调整至0.05mg/kg，每周给药一次的给药方案下也没有肿瘤生长的抑制作用，给药四周后，平均肿瘤体积达到489.03±185.26mm³(第28天)，抑瘤率为32.03±25.75％，肿瘤体积虽低于溶媒对照组但与之相比无显著性差异(P>0.05)。联合给药组DTLL 0.05mg/kg,每周给药一次+吉西他滨60mg/kg,每4天给药一次的联合治疗方案表现出很强的肿瘤生长抑制作用。给药四周后，平均肿瘤体积仅为199.68±112.07mm³(第28天)，抑瘤率达到了72.25±15.58％，药效强于对照组以及各个给药组，与溶媒组和吉西他滨单独给药组相比均具有显著性差异(P<0.05)。综上所述,对于吉西他滨耐药的PDX模型而言，受试药物DTLL与吉西他滨的联合应用也能表现出很强的肿瘤生长抑制作用。二者的联合在人源性异体移植胰腺癌模型(PDX)中仍然能发挥协同作用，在吉西他滨敏感的模型动物中起到增强疗效的作用，而在吉西他滨耐药的模型动物中能改善其耐药现象。为临床上二者的联合用药提供了坚实的依据。

表4.双靶向配体化力达霉素DTLL与吉西他滨联合用药对人源性异体移植胰腺癌模型 (PDX)的体内药效学研究

*与本组对照组相比，P<0.05；***与本组对照组相比，P<0.001；

^与本组吉西他滨组相比,p<0.05。

序列表

<110> IDC170214

<120> 双靶向配体化力达霉素DTLL联合吉西他滨在胰腺癌治疗中的应用

<141> 2017-12-11

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 182

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ala Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg

1 5 10 15

Glu Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Ser Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp

35 40 45

Gly Gln Ser Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr

50 55 60

Tyr Tyr Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn

65 70 75 80

Pro Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser

85 90 95

Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly

100 105 110

Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly

115 120 125

Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Asp Val Gly Tyr Cys

145 150 155 160

Thr Asp Arg Ser Cys Ala Lys Trp Pro Glu Trp Leu Gly Val Leu Glu

165 170 175

His His His His His His

180

Claims (3)

1.药盒在制备用于耐药性胰腺癌的治疗药物中的应用，其中，所述耐药性胰腺癌为吉西他滨耐药的胰腺癌，所述药盒含有SEQ ID NO：1所示的蛋白质和吉西他滨，以及能够与所述蛋白质形成组装产物的下式(I)所示的发色团：

2.药盒在制备用于耐药性胰腺癌的治疗药物中的应用，其中，所述耐药性胰腺癌为吉西他滨耐药的胰腺癌，所述药盒含有双靶向配体化力达霉素DTLL和吉西他滨，其中双靶向配体化力达霉素DTLL为SEQ ID NO：1所示的蛋白质和下式(I)所示的发色团的组装产物：

3.药物组合物在制备用于耐药性胰腺癌的治疗药物中的应用，其中，所述耐药性胰腺癌为吉西他滨耐药的胰腺癌，所述药物组合物含有双靶向配体化力达霉素DTLL和吉西他滨，其中双靶向配体化力达霉素DTLL为SEQ ID NO：1所示的蛋白质和下式(I)所示的发色团的组装产物：

Images