CN111671759A - 一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合，所述的药物组合为普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑三药联用。本发明以胰腺癌PANC‑1细胞为对象，本发明作用于胰腺癌干细胞可以降低胰腺癌干细胞的生存能力以及增加胰腺癌干细胞的凋亡，并且可以使干细胞标志物CD133下调。本发明提供的药物组合替代了吉西他滨在胰腺癌上的应用，三种药物与吉西他滨相比，毒副作用更小，并且有效解决了胰腺癌患者对吉西他滨的耐药性问题。
Description
技术领域
本发明涉及联合药物技术领域，尤其是一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合。
背景技术
胰腺癌是常见的致死率极高的消化道恶性肿瘤，尤其在发达国家较为常见，是预后最差的肿瘤之一。全世界每年约有22万人死于此病，其发病率和死亡率近年来明显上升。在我国，胰腺癌的年发病率约为5.1例/10万人，每年新增约5-6万例。其死亡率亦迅速升高，占恶性肿瘤死因的第7-8位。
约有超过85％的胰腺癌患者在初次诊断时就已经出现癌细胞的局部浸润或远处转移。胰腺癌患者的中位存活时间仅有5～6个月，5年内存活率低于5％。吉西他滨在胰腺癌的化疗中有着极其重要的地位，它作用于DNA合成期的肿瘤细胞，是胰腺癌的标准一线化疗方案。吉西他滨的肿瘤缓解率约为15％，治疗后平均可使患者生存期延长仅5周，在胰腺癌的临床上，对于提高胰腺癌患者生存期方面以及临床化疗药物产生的耐药性效果并不令人满意。因此，开发有效治疗胰腺癌的新方法具有很高的临床意义。
多种恶性肿瘤干细胞的发现对肿瘤研究和肿瘤治疗的发展具有重要的意义。癌症细胞的亚群通常被称为肿瘤启动细胞或肿瘤干细胞(CSCs)。CSCs具有在体外形成三维肿瘤球的能力，肿瘤微球形成的方法被广泛应用于CSCs的分离和富集。CSCs具有自我更新和多向分化的能力，胰腺干细胞的异常分化和增值会导致胰腺癌的发生。胰腺癌的起源及致瘤性、恶性程度、耐药性、复发转移等均与胰腺癌干细胞基因的异常表达密切相关。这些特征表明，CSCs可能是癌症治疗的关键靶标，寻找抑制CSCs的新疗法将有望改善胰腺癌的临床管理。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合，本发明以胰腺癌PANC-1细胞为对象，本发明作用于胰腺癌干细胞可以降低胰腺癌干细胞的生存能力以及增加胰腺癌干细胞的凋亡，并且可以使干细胞标志物CD133下调。
本发明的技术方案为：一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合，所述的药物组合为普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑三药联用。
优选的，所述的药物组合物普罗布考：格列吡嗪：咪达唑仑的摩尔比为：2～20：2～20：2～20。
优选的，所述的药物组合物普罗布考：格列吡嗪：咪达唑仑的摩尔比为20：20：20。
优选的，所述的药物组合作用于胰腺癌干细胞，并且可以使干细胞标志物CD133下调。
优选的，所述的药物组合作用于胰腺癌干细胞主要为增加其细胞凋亡率及增强细胞中caspase-3的活性。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供的药物组合物普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑在临床上具有不同的药理学作用，其中，普罗布考具有卓越的抗动脉硬化作用，并且对血管介入术后保护，防止糖尿病的血管并发症，消除黄色瘤均有出色疗效；格列吡嗪可作为降血糖药，并具有降脂和抗凝血作用；咪达唑仑可用来治疗失眠症，是一种短效镇静剂；
2、本发明提供的药物组合替代了吉西他滨在胰腺癌上的应用，三种药物与吉西他滨相比，毒副作用更小，并且有效解决了胰腺癌患者对吉西他滨的耐药性问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中单用普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑及三种药物联用处理胰腺癌PANC-1细胞对细胞肿瘤球的影响图；
图2为本发明实施例2中单用普罗布考(20μM)、格列吡嗪(20μM)、咪达唑仑(20μM)及三种药物联用对胰腺癌干细胞的存活率影响图；
图3为本发明实施例3中单独使用普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑及三种药物联合对胰腺癌干细胞的细胞凋亡率影响图。
图4为本发明实施例3中单独或联合使用三药组合对胰腺癌干细胞的细胞caspase-3活性图；
图5为本发明实施例4中利用Western blot分析三药联合使用对下调胰腺癌干细胞中干细胞标志物CD133的水平图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明：
实施例1
三种药物单独和组合对胰腺癌PANC-1细胞的肿瘤微球形成率的研究。
将胰腺癌PANC-1细胞在超低附着多孔板中培养，所用的培养基为添加了细胞生长因子、胰岛素、牛血清白蛋白等必需物质的DMEM/F12无血清培养基。单独添加普罗布考(2μM、5μM、10μM、20μM)、格列吡嗪(2μM、5μM、10μM、20μM)、咪达唑仑(2μM、5μM、10μM、20μM)三种药物以及三种药物联用处理PANC-1细胞。
实验表明联合治疗组(普罗布考+格列吡嗪+咪达唑仑)对肿瘤球形成明显降低，而普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑之间以20μM:20μM:20μM的剂量比联合使用强烈抑制肿瘤球的形成，因此后续研究均以该剂量比为实验标准探讨三药组合对胰腺癌CSCs的抑制作用。
从图1中可以看出，与对照组相比，联合治疗组(普罗布考+格列吡嗪+咪达唑仑)的肿瘤形成率明显降低。其中对照组与普罗布考组、对照组与格列吡嗪组、对照组与咪达唑仑组之间的肿瘤形成差异无统计学意义(P>0.05)；a表明与对照组、普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)；b表明与对照组(P<0.001)，与普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；c表明与对照组、普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组相比，差异具有统计学意义(P<0.001)。
实施例2
三种药物单独和组合对胰腺癌干细胞的存活率分析。
分别用普罗布考(20μM)、格列吡嗪(20μM)、咪达唑仑(20μM)及三种药物组合联用处理胰腺癌干细胞72h。用台盼蓝测定法测定细胞活力，将80μl细胞悬液和20μl 0.4％台盼蓝溶液混合，通过死细胞吸收染料为蓝色，活细胞不被染色，用血小球计数板在光学显微镜下计数判断活细胞数量。
结果表明单独使用普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑可减少胰腺癌CSCs的细胞数，而三药联合使用可以是胰腺癌CSCs的活细胞数强烈减少。
从图2中可以看出，单用普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑对处理胰腺癌干细胞对减少活细胞数量的影响小，三药联合处理胰腺癌干细胞对细胞数量强烈减少。其中，对照组与普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组之间的活细胞数差异无统计学意义(P>0.05)；a表明与对照组(P<0.001)，与普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。
实施例3
三种药物单独和组合对胰腺癌干细胞的凋亡率分析
分别用普罗布考(20μM)、格列吡嗪(20μM)、咪达唑仑(20μM)及三种药物组合联用处理胰腺癌干细胞72h。通过碘化丙啶染色法测定细胞凋亡，实验时，细胞用胰蛋白酶消化，制成细胞涂片，经丙酮/甲醇(1:1)溶液固定10min后，用碘化丙啶PBS溶液(1μg/mL)染色10min，使用荧光显微镜对其进行观察和形态分析。
使用EnzoLyte AMC Caspase-3测定荧光试剂盒进行caspase-3活性测定。
caspase-3在细胞凋亡中起着重要作用，通过对各组caspase-3的活性检测，发现联合用药组的caspase-3活性大大增强，这证实了三药联合对胰腺癌CSCs的细胞凋亡具有促进作用。
从图3中可以看出，尽管单独使用普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑都会增加胰腺癌CSCs的细胞凋亡，但统计分析表明，对照组与普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组之间的凋亡差异无统计学意义(P>0.05)；a表明与对照组、普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组之间相比差异具有统计学意义(P<0.001)。
从图4中可以看出，普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑联合使用可大大增强细胞中的caspase-3活性。其中，对照组与普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组之间的凋亡差异无统计学意义(P>0.05)，a表明与对照组、普罗布考组、格列吡嗪组、咪达唑仑组之间具有统计学差异(P<0.001)。
实施例4
将普罗布考，格列吡嗪和咪达唑仑联合处理CSC 24h，通过Western blot分析检测CSC相关标记CD133。
CD133为研究最多的是在干细胞和多种组织肿瘤干细胞表面独立表达的特异标记分子，是肿瘤干细胞的一种广谱标志物，通过CD133可以分选干细胞、前体细胞和肿瘤干细胞。Western blot是对提取的蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳，转移到硝酸纤维膜上，用封闭缓冲液封闭非特异性结合位点后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜。以β-actin作为内参。除去一抗后，将膜在室温下用TBS(含0.05％Tween的PBS)缓冲液洗涤3次后用二抗孵育1h，再TBS洗涤3次，检测结果由Odyssey红外成像系统完成。
通过Western blot分析检查胰腺癌CSCs相关标记CD133，发现单独使用普罗布考，格列吡嗪或咪达唑仑处理的细胞中CD133的含量无明显变化，而联用普罗布考，格列吡嗪和咪达唑仑处理细胞会导致CD133水平大大降低，这表明三药组合可以强烈抑制胰腺癌干细胞，参见图5。
上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (5)
1.一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合，其特征在于：所述的药物组合为普罗布考、格列吡嗪、咪达唑仑三药联用。
2.根据权利要求1所述的一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合，其特征在于：所述的药物组合物普罗布考：格列吡嗪：咪达唑仑的摩尔比为：2～20：2～20：2～20。
3.根据权利要求2所述的一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合，其特征在于：所述的药物组合物普罗布考：格列吡嗪：咪达唑仑的摩尔比为20：20：20。
4.根据权利要求3所述的一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合，其特征在于：所述的药物组合作用于胰腺癌干细胞，并且可以使干细胞标志物CD133下调。
5.根据权利要求4所述的一种协同抗胰腺癌干细胞的药物组合，其特征在于：所述的药物组合作用于胰腺癌干细胞主要为增加其细胞凋亡率及增强细胞中caspase-3的活性。
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