CN108434139B - 缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的应用 - Google Patents

缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缺氧诱导因子HIF脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的用途。进一步的，所述的HIF脯氨酰羟化酶活性的抑制剂为Roxadustat(FG‑4592)。本发明的HIF脯氨酰羟化酶活性抑制剂是HIF家族选择性抑制剂，可减轻顺铂诱导的急性肾损伤肾脏病理损害，改善肾功能。FG‑4592可通过激活HIF1α、促进EPO以及HO‑1的表达、抑制细胞凋亡同时下调炎症因子的释放，从而减少肾小管细胞的凋亡和小管扩张坏死，改善肾脏病理损伤和肾功能，起到保护急性肾损伤中肾脏结构和功能的作用。由于FG‑4592目前在防治慢性肾性贫血领域已处于三期临床研究，我们的发现将极有可能为防治AKI提供有效的临床药物。

Description

缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损 伤药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种缺氧诱导因子(Hypoxia-Inducible Factor，HIF)脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的应用。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney in jury,AKI)是一种常见的临床综合征，主要表现为肾功能的迅速下降及代谢废物的积聚，血清肌酐(serum creatinine,Scr)的升高和尿量的减少是AKI的诊断依据。AKI的发病率高，且呈逐年上升趋势，2013年一项横断面研究表明，我国住院病人AKI检出率高达2％，预测有290万AKI病人住院治疗，约有70万患者死于AKI。目前尚无治疗AK1的特效药物，严重时需进行肾脏替代治疗。AKI患者发展成为慢性肾脏病的风险大大增加，有部分患者会直接进展到终末期肾病，给患者家庭和社会带来了极大的经济负担。如果及时识别、去除危险因素或积极干预，许多AKI的肾功能可完全或部分恢复，并脱离透析，因此，早期诊断、早期干预是改善AKI预后的关键。
20世纪70年代开始，在临床上，顺铂被广泛用于治疗多种恶性肿瘤，包括膀胱癌、宫颈癌、头颈部恶性肿瘤以及小细胞或非小细胞肺痛等，是治疗实体肿痛最有效和常用的药物之一，但其对正常组织严重的不良反应限制了其临床应用。顺铂的不良反应主要有耳毒性、胃肠道毒性、骨髓抑制、变态反应及肾毒性，其中肾毒性最常见，在用顺铂治疗后，约1/3患者出现肾功能障碍导致急性肾衰竭，其剂量相关的肾毒性大大限制了顺铂临床应用。长久以来，顺铂致肾损伤机制仍未完全明确，众多研究发现炎症介质、坏死、凋亡、氧化应激、自噬等均可能是顺铂导致急性肾损伤原因。
尽管如此，近年来，越来越多的研究表明肾组织缺氧也是各种急性肾损伤包括顺铂诱导的肾损伤的重要原因。在肾脏的外髓质以及皮质，生理水平的氧分压就比较低，在肾脏急性损伤期间，肾脏组织中的氧分压会快速下降，直接导致了细胞能量供应的中断进而促进了肾脏细胞的损伤，加剧了肾脏的损伤。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)通过调控数百个靶基因，诸如促红细胞生成素，血管内皮生长因子，葡萄糖转运体等的表达，使肾脏细胞具备适应低氧的环境。诸多的研究表明，缺氧诱导因子在AKI发生时肾脏皮质显著上调，更为重要的是已有研究发现激活缺氧诱导因子能够保护肾脏损伤。尽管如此，由于细胞中缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶的存在导致了缺氧诱导因子被快速泛素化降解。目前的研究认为，通过抑制缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶可能可以保护肾脏的急性损伤，但目前仍未找到一种具备临床应用前景的缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂。
Roxadustat为一种HIF脯氨酰羟化酶活性的抑制剂，别名为FG-4592，化学名为：N-[(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-3-异喹啉)羰基]甘氨酸。FG-4592目前处于III期临床测试阶段，用于治疗慢性肾病和终末期肾病相关的贫血症。但目前木有证据表明其对急性肾损伤具有治疗效果。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种HIF脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的应用，所述的这种HIF脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的应用，解决了现有技术中没有合适的药物用于治疗由于急性肾损伤引起的肾脏结构和功能损害的技术问题。
本发明提供了一种HIF脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的应用。
进一步的，所述的HIF脯氨酰羟化酶活性的抑制剂为Roxadustat(FG-4592)。
我们在顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型上使用HIF脯氨酰羟化酶活性抑制剂Roxadustat(FG-4592)，来探讨通过抑制HIF脯氨酰羟化酶活性对急性肾损伤的保护作用及其机制。结果发现，对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型使用HIF脯氨酰羟化酶活性抑制剂FG-4592进行干预治疗，可显著减轻小鼠急性肾损伤肾脏病理损害，改善肾功能。FG-4592通过激活HIF1α、促进EPO以及HO-1的表达、抑制细胞凋亡同时下调炎症因子的释放，从而减少肾小管细胞的凋亡和小管扩张坏死，改善肾脏病理损伤和肾功能，起到保护急性肾损伤中肾脏结构和功能的作用。由于FG-4592目前在防治慢性肾性贫血上已处于三期临床研究，我们的发现将极有可能为防治AKI提供有效的临床药物。
附图说明：
图1显示了FG-4592可改善顺铂诱导急性肾损伤模型中的肾脏损伤和肾脏功能；
图2显示了在顺铂诱导的急性肾损伤模型中，FG-4592下调肾脏组织中NGAL和Kim-l表达水平；
图3显示了FG-4592显著上调HIF1α蛋白水平，上调了HIF1α靶基因的表达，同时下调了Bax以及cleaved caspase3蛋白水平，说明其可以改善AKI时肾脏细胞的死亡；
图4显示了FG-4592本身对肾脏无毒副作用；
图5显示了FG-4592抑制了cox2以及IL-1β,TNFα，mcp-1和IL-6等炎症因子的表达分泌水平；
图6显示了FG-4592在顺铂处理的小鼠肾小管上皮细胞中的保护作用及机制。
具体实施方式
实施例1材料和方法
1)材料和试剂
抑制剂FG-4592购于Selleck公司。Cleaved caspase3,Bax抗体均购于CellSignaling Technology公司。NGAL和Kim-l抗体购于ABCAM公司。HIF1α,β-actin购于南京巴傲得公司。荧光二抗购于Invitrogen公司。细胞凋亡检测试剂盒购于BD公司。顺铂，WesternBlot所需二抗以及其他试剂均购于Sigma公司。炎症因子ELISA试剂盒购于达科为生物技术公司。
2)细胞培养和处理
小鼠肾小管上皮细胞(mPTCs)用含10％胎牛血清，0.5％青霉素和链霉素的DMEM/F12培养基培养，培养条件为37℃，5％二氧化碳和95％空气。为研究FG-4592对于顺铂引起的肾脏损伤的作用机制，我们将mPTC在完全培养基中加入0μM、5μM、15μM,25μM四个浓度的FG-4592预处理24h,之后培养基换成无血清的培养基加入上述浓度的FG-4592，同时加入终浓度为5μg/ml的顺铂模拟急性肾损伤诱导的细胞死亡，最后收集细胞进行Western Blot检测以及进行细胞凋亡的流式细胞分析。
3)急性肾损伤模型和实验分组
小鼠随机分为三组，每组8只。空白对照组腹腔注射PBS；顺铂模型组注射PBS；FG4592组腹腔注射10mg/kg的FG-4592预处理48小时，FG-4592先溶于DMNSO中配成50mg/ml,后用PBS稀释到1mg/ml。模型组腹腔注射20mg/kg剂量的顺铂，顺铂溶于0.9％的生理盐水中，建立小鼠急性肾损伤模型；模型加药组在顺伯注射后每天继续腹腔注射FG-4592(10mg/kg).72小时后处死小鼠，收集肾脏标本和血液标本。另外再设立两组实验动物，每组六只，一组每天腹腔注射PBS，另外一组每天腹腔注射10mg/kg的FG-4592，连续注射五天，收集肾脏标本和血液标本。所有动物实验均遵守中国实验动物管理和使用条例。
4)肾功能检测
小鼠血液标本经离心后收集血清成分，在南京市儿童医院全自动生化仪上检测血清肌酐和血清尿素氮指标。
5)小管损伤评分
在肾脏PAS病理染色中观察小管损伤程度，并根据半定量损伤评分标准进行小管损伤评估，正常肾小管组织为0分，肾小管损伤程度水于30％的为1分，肾小管损伤程度在30％-60％之间的为2分，大于60％的为3分。
6)组织学和免度荧光染色
肾脏组织经多聚甲醛固定、石蜡包理，组织切片后进行组织学和免疫荧光染色。
HIF1α等一抗浓度均为1:100，荧光二抗浓度为1:400.DAPI染色根据标作说明进行。
7)蛋白质免疫印迹
肾脏组织提取蛋白，按照文献方法操作。蛋白质免疫印迹(Western blot)结果用ImageJ软件进行灰度分析。
8)统计分析
使用均值士SD表示数据。多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，两组间数据比较用T检验。以P<0.05为具有统计学意义。
实施例2 FG-4592改善顺铂诱导急性肾损伤模型中的肾脏损伤和肾功能
为了评估检测FG-4592在保护AKI中的作用，我们检测了小鼠肾脏相关生化指标，顺铂造模72小时后，血清肌和和尿素氮指标明显升高，而小管扩张坏死等肾脏病理损伤表现也较为严重，而FG-4592治疗后，其相应肾脏损伤和肾功能指标都显著下降(图1A-1C)。此外，肾小管损伤评分也提示FG-4592治疗可改善顺铂引起的肾脏病理损伤(图1D)。因此，FG-4592不仅可以改善肾功能，还能减轻肾脏病理损伤。这些结果表明FG-4592可以保护急性肾损伤引起的肾脏损害。
实施例3 FG-4592下调急性肾损伤模型中NGAL和Kim-l表达水平。
为了进一步证明FG-4592对顺铂诱导的急性肾损伤具有保护作用，我们检测了急性肾损伤早期特异性生物指标，NGAL和Kim-1。如图2A到2C的荧光定量PCR以及westernblot检测显示，kim1以及NGAL在急性肾损伤小鼠的肾脏中高表达，在FG-4592治疗后，其表达水平显著下降，说明FG-4592在急性肾损伤模型中对于肾脏组织有一定的保护作用。
实施例4在顺铂诱导的急性肾损伤模型中，FG-4592上调了HIF1α的活性并抑制了细胞凋亡。
为证明FG-4592对于HIF脯氨酰羟化酶活性的特异性抑制效果，我们检测了FG-4592治疗之后肾脏组织HIF1α的蛋白水平及其靶基因表达水平。免疫荧光和免疫印迹结果显示，在正常小鼠肾脏中，HIF1α表达很低或者不表达，在顺铂诱导的急性肾损伤模型中，HIF1α的表达显著升高，而使用FG-4592治疗后，其蛋白水平进一步上调(图3A-F)。此外，凋亡检测发现，FG-4592显著抑制了凋亡相关蛋白的表达活化进而抑制了肾脏细胞的凋亡。这些结果提示，在顺铂诱导的急性肾损伤模型中，FG-4592能够抑制肾脏中HIF脯氨酰羟化酶活性上调HIF1α蛋白水平。
实施例5 FG-4592本身对肾脏功能不会造成毒副作用。
为进一步评估FG-4592的安全性，我们构建了动物模型，单纯给予FG-4592治疗，并设置对照组，发现FG-4592不会对肾脏功能造成影响(图4)。
实施例6 FG-4592显著抑制顺铂诱导的急性肾损伤炎症因子的表达和分泌。
炎症反应是急性肾损伤重要的发生机制之一，通过荧光定量PCR以及ELISA检测分析，我们发现顺铂诱导的急性肾损伤模型中，cox2,mcp-1，TNFa,IL-1b以及IL-6等炎症相关基因表达显著上调，在FG-4592治疗之后炎症水平显著下调(图5)。
实施例7 FG-4592在顺铂处理的小鼠肾小管上皮细胞中的保护作用及机制。
为了进一步验证FG-4592对于顺铂诱导的急性肾损伤的保护作用及其机制，我们用顺铂处理小鼠肾小管上皮细胞mPTC，模拟急性肾损伤中的细胞损伤环境。用FG-4592预处理了mPTC之24小时后加入5μg/ml的顺铂来模拟细胞损伤环境，同时我们使用了四个个浓度梯度(0，5，15，25μM的FG-4592来观察其作用效果，加药处理24小时后收集细胞做细胞凋亡分析，如图6所示，FG-4592能够显著上调HIF1α的蛋白水平，抑制了BAX以及caspase 3等的凋亡相关蛋白的活化，进而抑制顺铂诱导的细胞凋亡，由此说明FG-4592在体外能够保护肾小管上皮细胞在顺铂诱导下的细胞凋亡。
综上所述，本发明提供了一种缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶活性抑制剂在制备防治急性肾损伤药物中的应用，该抑制剂通过腹腔注射的方式给药，通过抑制缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶活性进而上调HIF1α蛋白水平，进而增强了HIF1α靶基因的表达，抑制了肾脏细胞在顺铂作用下的凋亡，从而发挥防治急性肾损伤的目的。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶活性抑制剂作为唯一活性成分在制备防治急性肾损伤药物中的应用，其中，所述的缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶活性抑制剂为Roxadustat，其化学名为N-[(4-羟基-1-甲基-7-苯氧基-3-异喹啉)羰基]甘氨酸，所述防治急性肾损伤为防治顺铂诱导的急性肾损伤，所述防治顺铂诱导的急性肾损伤是指改善顺铂引起的肾脏病理损伤、通过下调NGAL和Kim-l表达水平来保护肾脏组织、通过上调HIF1α的活性并抑制细胞凋亡、抑制顺铂诱导的急性肾损伤炎症因子的表达和分泌。
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