CN109678779B - 一种smcc的精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化合物的纯化/精制，具体公开了一种SMCC的精制方法。本发明所述的精制方法通过将化学合成得到的含有式II所示杂质的SMCC粗品采用乙腈作为溶剂进行重结晶，在提高SMCC纯度的同时有效降低该杂质的含量。本发明还进一步通过控制重结晶过程中乙腈的用量，获得一种更为优异的效果，得到SMCC纯度不小于99.9％、杂质含量小于0.1％的高纯度SMCC产品。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的纯化/精制，具体地说，涉及对SMCC的精制方法。
背景技术
SMCC，化学名称：4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(化学结构式如式I所示)，CAS：64987-85-5，是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，可分别将含有巯基和氨基的化合物键接在一起，可作为链接子将抗体与毒素分子连接起来，在免疫实验、肿瘤成像的放射性标记中广泛应用。
Yoshitake等人首次报道以反式胺甲环酸为起始物料合成SMCC，首先将反式氨甲环酸与马来酸酐反应生成反式氨甲环酸的马来酰胺，用乙酸钠/乙酸酐关环，再用氯化亚砜将羧基转化为酰氯，与N-羟基丁二酰亚胺反应得到SMCC粗品，经过丙酮重结晶后得到SMCC纯品，收率25％左右。具体路线如下：
但该工艺中使用了氯化亚砜强腐蚀性的试剂，并且使用了剧毒的苯作为溶剂，不符合绿色化学的理念，尤其不符合药物合成溶剂的使用规范。
Nielsen和Buchardt报道了以反式胺甲环酸在DMF中与马来酸酐反应，再在DCC的作用下与N-羟基丁二酰亚胺反应生成SMCC粗品，产物以二氯甲烷溶解后用水洗涤，蒸除二氯甲烷得到SMCC纯品，收率75％。具体路线如下：
但该工艺中使用了DCC作为缩合剂，处理工艺繁琐且非常难以去除干净。
Paterson和Eggleston报道以TFA-NHS作为酯化试剂合成SMCC，首先马来酸酐与反式氨甲环酸反应生成反式氨甲环酸的马来酰胺，然后再与TFA-NHS反应生成SMCC粗品，再以二氯甲烷-正己烷重结晶后得到SMCC纯品，收率89％。具体路线如下：
不足之处在于，此方法需要单独分离出反式氨甲环酸的马来酰胺，操作繁琐。
之后，Nicholas和Jarmila发现TFA-NHS试剂可以同时促进反式氨甲环酸的马来酰胺环合和酯化，并于2011年报道了“一锅法”合成SMCC，采用水洗及乙醚打浆后，总收率超过90％。具体路线如下：
该方法相对早期报道的方法，操作更为简单，适合工业化生产。
王新增等人采用Nicholas和Jarmila报道的“一锅法”反应生成SMCC，然后水洗、浓缩，得到SMCC固体后，用二氯甲烷和正庚烷重结晶得到SMCC，收率92％，纯度大于99％(偶联试剂SMCC的一锅法合成，广州化学，2016，41(5)，1-4)。
然而，以上报道的SMCC合成方法都未涉及对最大单杂的研究控制。“一锅法”合成SMCC是目前最有效的合成工艺，根据本发明发明人的研究结果，该工艺最容易产生和难以去除的杂质A为4-[[[(2E)-4-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-1，4-二氧代-2-丁烯-1-基]胺基]甲基]-2，5二氧代-1-吡咯烷基反式氨甲环酸酯，其结构如式II所示。
它是由该工艺生成的中间体反式氨甲环酸马来酰胺与TFA-NHS反应生成，按照已有文献报道的精制方法，该杂质很难去除。同时由于该杂质为活性酯结构，很容易在与毒素和抗体的反应中引入其他杂质，因此需要严格控制。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种SMCC的精制方法，提高SMCC产品的纯度至99.9％以上，本发明的目的之二是严格控制SMCC产品中的杂质含量，控制式II所示的杂质A(为最大单杂)的含量<0.10％，且总杂质含量(后文简称总杂)<0.10％。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种SMCC的精制方法，将化学合成得到的SMCC粗品，采用乙腈作为溶剂进行重结晶，所述SMCC粗品含有式II所示的杂质。
所述SMCC粗品中，杂质主要包括：杂质A(如式II所示)、杂质B(式III，化学名：反式-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸)，杂质C(式IV，化学名：反式氨甲环酸)，杂质D(式V，化学名：N-羟基丁二酰亚胺)等。其中，以杂质A最难去除。
本发明经试验研究发现，采用乙腈作为溶剂进行重结晶，相对于采用丙酮和二氯甲烷-正己烷等溶剂进行重结晶，所得SMCC产品的纯度更高，且产品中杂质A的含量更低。
进一步地，在本发明的SMCC精制方法中，第一次重结晶时乙腈的用量典型但非限制性地优选为底物(即SMCC粗品)的3当量、4当量、5当量、6当量；最优选为底物的4当量。第二次重结晶时乙腈的用量典型但非限制性地优选为底物(即第一次重结晶后的SMCC固体)的4当量、5当量、6当量、7当量，8当量；最优选为底物的6当量。
本发明中，术语“当量”为w/v，指乙腈的体积(v)与底物的质量(w)与质量比。
更为具体地，所述精制方法包括：
第一次精制(即第一次重结晶)：将SMCC粗品和乙腈溶剂加入到设有回流冷凝装置的加热容器中，加热回流至溶清，之后降至室温，在10℃～15℃水浴中析晶6～8h，过滤，用乙腈洗涤滤饼，并将洗涤后的滤饼在40℃～45℃下真空干燥1～2h，得到SMCC固体；
第二次精制(即第二次重结晶)：将第一次精制得到的SMCC固体和乙腈溶剂加入到设有回流冷凝装置的加热容器中，加热回流至溶清，趁热过滤，滤液自然冷却至室温后，在10℃～15℃水浴中析晶6～8h，过滤，用乙腈洗涤滤饼，并将洗涤后的滤饼在40℃～45℃下真空干燥4～6h，得到高纯度的SMCC固体。
进一步地，所述第一次精制和第二次精制中的加热回流至溶清，优选在72℃～82℃条件下加热。
可选地，本发明所述的SMCC粗品为一锅法合成的SMCC粗品，即为：将反式氨甲环酸、马来酸酐在DMF作溶剂的条件下反应生成反式氨甲环酸的马来酰胺，再与三氟乙酸酐、N-羟基丁二酰亚胺、三甲基吡啶等反应生成的SMCC粗品。
其制备方法可参考王新增等人发表的文献(偶联试剂SMCC的一锅法合成，广州化学，2016，41(5)，1-4)。
在本发明的一个具体实施方式中，作为示例性说明，该SMCC粗品的制备方法可以为：
步骤1：在装有温度计的三口烧瓶中加入反式氨甲环酸31.44g(200mmol)，马来酸酐19.60g(200mmol)和DMF 1L，15℃～25℃搅拌反应6～8h。降温至-5～0℃，滴加2,4,6-三甲基吡啶50.09g(420mmol)；滴加过程中保持温度在-5℃～5℃之间，滴加完毕，在此温度下搅拌20min，待用；
步骤2：在装有温度计的反应瓶中加入N-羟基丁二酰亚胺92.08g(800mmol)和1LDMF，冷却至-5～0℃，搅拌下滴加168.04g(800mmol)三氟乙酸酐，滴加过程中控制反应温度在-5℃～5℃之间，滴加完毕，在此温度下搅拌15-20min。然后滴加96.84g(800mmol)2,4,6-三甲基吡啶，滴加过程中控制温度在-5℃～5℃之间，滴加完毕，待用；
步骤3：SMCC粗品的制备：将步骤1得到的反应液加至步骤2得到的反应液中，升温至15℃～20℃，搅拌16～18h。反应结束后加入加入8L纯化水，以2.5L×3乙酸乙酯萃取，分液，合并有机相，再分别以1N HCl(2.5L×2)，水(2.5L)，饱和食盐水(2.5L)洗涤，无水硫酸钠300g干燥3～4h后，过滤，滤液在40～45℃下减压浓缩至干，45℃减压干燥得SMCC粗品66.12g，收率98.9％，纯度97.2％(HPLC)，杂质A含量1.35％(HPLC)。
应当理解的是，本发明旨在提高SMCC产品的纯度并降低SMCC合成中产生的杂质A的含量，例如一锅法合成SMCC时由于中间体反式氨甲环酸马来酰胺与TFA-NHS反应而生成的杂质A。因此，凡是含有杂质A的SMCC粗品均可使用本发明所述精制方法进行精制纯化，而所述SMCC粗品的制备方法具体如何，对本发明所述的SMCC的精制方法不构成限定作用。
由于本发明所述精制方法提高了SMCC产品中SMCC的纯度并降低了SMCC产品中式II所示杂质的含量，因此，由本发明所述精制方法制备得到的高纯度、低杂质含量的SMCC产品也属于本发明的保护范围。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种SMCC的精制方法，通过采用特定用量的乙腈溶液作为溶剂进行两次重结晶，成功实现了在有效控制杂质(尤其是杂质A)含量<0.1％的同时，将SMCC产品纯度提高至99.9％以上。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用于说明SMCC粗品的制备。
步骤1：在装有温度计的三口烧瓶中加入反式氨甲环酸31.44g(200mmol)，马来酸酐19.60g(200mmol)和DMF 1L，15℃～25℃搅拌反应6-8h。降温至-5～0℃，滴加2,4,6-三甲基吡啶50.09g(420mmol)；滴加过程中保持温度在-5℃～5℃之间，滴加完毕，在此温度下搅拌20min，待用；
步骤2：在装有温度计的反应瓶中加入N-羟基丁二酰亚胺92.08g(800mmol)和1LDMF，冷却至-5～0℃，搅拌下滴加168.04g(800mmol)三氟乙酸酐，滴加过程中控制反应温度在-5℃～5℃之间，滴加完毕，在此温度下搅拌15-20min。然后滴加96.84g(800mmol)2,4,6-三甲基吡啶，滴加过程中控制温度在-5℃～5℃之间，滴加完毕，待用；
步骤3：SMCC粗品的制备：将步骤1得到的反应液加至步骤2得到的反应液中，升温至15℃～20℃，搅拌16～18h。反应结束后加入加入8L纯化水，以2.5L×3乙酸乙酯萃取，分液，合并有机相，再分别以1N HCl(2.5L×2)，水(2.5L)，饱和食盐水(2.5L)洗涤，无水硫酸钠300g干燥3～4h后，过滤，滤液在40～45℃下减压浓缩至干，45℃减压干燥得SMCC粗品66.12g，收率98.9％，纯度97.2％(HPLC)，杂质A含量1.35％(HPLC)。
HPLC检测方法如下：
取本品，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，用辛基硅烷键合硅胶(C8或C18)色谱柱，以磷酸盐缓冲液(pH值约为3.0)为流动相A，乙腈为流动相B，流速为每分钟1.0ml，按下表进行线性梯度洗脱；检测波长为220nm；柱温为30℃。
实施例2
本实施例用于说明对SMCC粗品(以实施例1制备的SMCC粗品为例)的纯化精制，包括：
第一次精制：在装有回流冷凝管的500mL单口烧瓶中加入SMCC粗品66g和244mL(4当量)乙腈，72-82℃加热回流至溶清，撤去加热源，温度降至室温后，在10℃～15℃水浴中析晶6～8h，过滤，用25mL乙腈洗涤滤饼。滤饼在40℃～45℃下真空干燥1～2h，得到淡黄色-类白色固体51.08g，收率77.4％，纯度99.8％(HPLC)，杂质A含量0.16％(HPLC)。
第二次精制：在装有回流冷凝管的500mL单口烧瓶中加入51.0g第一次精制产品和306mL(6当量)乙腈，72-82℃加热回流至溶清，趁热过滤。滤液自然冷却至室温后，在10℃～15℃水浴中析晶6～8h，过滤，用20mL乙腈洗涤滤饼。滤饼在40℃～45℃下真空干燥4～6h，得到类白色-白色固体36.40g，收率71.4％，纯度99.95％(HPLC)，杂质A含量0.03％(HPLC)，杂质B，C，D均未检出(检测限：0.01％)两步总收率：55.2％。
对比例1
本对比例与实施例2的区别仅在于：将第一次精制和第二次精制中的乙腈替换为丙酮。
对比例2
本对比例与实施例2的区别仅在于：将第一次精制和第二次精制中的乙腈替换为二氯甲烷-正己烷。
对比实验例1
通过对比实施例2、对比例1、对比例2的SMCC纯度及杂质A含量发现，采用乙腈作为溶剂进行重结晶后的SMCC产品总纯度更高，杂质A含量更低。详见表1。
表1：筛选不同的溶剂
| 纯化溶剂 | SMCC纯度 | 纯化后杂质A含量 |
| 丙酮 | 98.9％ | 0.84％ |
| 二氯甲烷-正己烷 | 99.4％ | 0.42％ |
| 乙腈 | 99.9％ | 0.03％ |
实施例3
本实施例参照实施例2，对二次精制中乙腈溶剂的用量分别进行筛选优化，具体数据如下：
表2第一次精制的乙腈用量
结论：以上数据显示，第一次精制采用4当量乙腈结晶后，产品的纯度达到了99.8％，杂质A的含量明显降低，继续增大乙腈用量，产品纯度没有明显提高，但产率有明显降低。
表3第二次精制的乙腈用量
结论：以上数据显示，第二次精制采用6当量乙腈结晶后，产品的纯度达到了99.9％，杂质A的含量降低至0.03％，继续增大乙腈用量，产品纯度没有明显提高，但产率有明显降低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种SMCC的精制方法，其特征在于，将化学合成得到的SMCC粗品，采用乙腈作为溶剂进行两次重结晶，所述两次重结晶的步骤包括：
第一次精制：将SMCC粗品和乙腈溶剂加入到设有回流冷凝装置的加热容器中，加热回流至溶清，之后降至室温，在10℃～15℃水浴中析晶6～8h，过滤，用乙腈洗涤滤饼，并将洗涤后的滤饼在40℃～45℃下真空干燥1～2h，得到SMCC固体；
第二次精制：将第一次精制得到的SMCC固体和乙腈溶剂加入到设有回流冷凝装置的加热容器中，加热回流至溶清，趁热过滤，滤液自然冷却至室温后，在10℃～15℃水浴中析晶6～8h，过滤，用乙腈洗涤滤饼，并将洗涤后的滤饼在40℃～45℃下真空干燥4～6h，得到高纯度的SMCC固体；
其中，所述SMCC粗品含有式II所示的杂质，精制后得到的SMCC固体纯度达99.9%以上，且式II所示的杂质含量小于0.1%；
（式II）。
2.根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，第一次重结晶时乙腈的用量为底物的3当量~6当量。
3.根据权利要求2所述的精制方法，其特征在于，第一次重结晶时乙腈的用量为底物的4当量。
4.根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，第二次重结晶时乙腈的用量为底物的4当量~8当量。
5.根据权利要求4所述的精制方法，其特征在于，第二次重结晶时乙腈的用量为底物的6当量。
6.根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述第一次精制和第二次精制中，均在72-82℃条件下加热回流至溶清。
7.根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述SMCC粗品的制备方法包括：
将反式氨甲环酸、马来酸酐在DMF作溶剂的条件下反应生成反式氨甲环酸的马来酰胺，再与三氟乙酸酐、N-羟基丁二酰亚胺、三甲基吡啶反应生成SMCC粗品。
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