CN109715669B - T细胞受体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明提供抗原特异性T‑细胞受体(TCR)。此外，本发明涵盖编码其的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体。还提供了包含本发明的分子的宿主细胞。此外，本发明提供用于诊断和治疗特别是癌症的手段和方法。

Description

T细胞受体及其用途

背景技术

形成细胞介导的免疫系统的部分的T淋巴细胞(或T细胞)在消除病原体中起主要作用。T细胞在胸腺中发育并在其表面上表达T细胞受体分子，该T细胞受体分子允许识别在有核细胞上表达的主要组织相容性复合体(MHC)分子上呈递的肽(抗原呈递)。病原体的抗原，即由MHC分子呈递的外源抗原，将引发强的T细胞响应，而由于在此类T细胞发育过程中在胸腺中的自身抗原特异性T细胞的阴性选择，自身抗原通常不会导致T细胞响应。因此，免疫系统可以区分呈递外源抗原或自身抗原的有核细胞，并通过T细胞的强有效的细胞因子释放和细胞毒性机制特异性地靶向和消除受感染的细胞。

免疫系统的力量被认为是未来癌症治疗的一个很有前途的工具。在过去的十年中，研究已经开始通过利用过继细胞转移(ACT)来开发T细胞的独特性质，该过继细胞转移涉及施用离体扩增的供体来源的淋巴细胞。ACT对于癌症的治疗是一个有吸引力的概念，因为它不需要患者的免疫能力，并且被转移的淋巴细胞的特异性可以针对通常不能有效地触发自体T细胞响应的非突变且因此免疫原性差的肿瘤抗原。尽管已证明ACT是各种类型癌症的有效治疗，但其作为临床治疗的广泛应用仍受到对来自每位患者的肿瘤特异性T细胞的定制(custom)分离和表征的需求的阻碍——定制(custom)分离和表征这一过程不仅可能是困难且耗时的，也常常不能产生高亲和力的T细胞(Xue等，Clin Exp Immunol.2005Feb；139(2)：167-172；Schmitt等，Hum Gene Ther.2009 Nov；20(11)：1240-1248)。

肿瘤抗原特异性T细胞受体(TCR)向原代T细胞的遗传性转移可克服ACT当前的一些局限性，因为它允许快速产生具有定义的抗原特异性的肿瘤反应性T淋巴细胞，甚至在免疫受损患者中也是如此。然而，鉴定具有特异性识别肿瘤抗原并在体内显示出预期抗肿瘤作用的TCR的合适T细胞克隆仍然是目前研究的主题。考虑到2012年全球约有1410万新发癌症病例，并且目前癌症是全球约14.6％的人类死亡的原因，因此迫切需要新的和有效的治疗方案。本发明的目的在于满足上述需求。

发明内容

本发明提供抗原特异性T细胞受体以及包含其的核酸、载体、宿主细胞；和其各种用途及应用。

第一方面，本发明涉及一种T细胞受体(TCR)，其包含(i)TCRα链可变区的互补决定区3(CDR3)，该CDR3包含CAVHSTAQAGTALIF(SEQ ID NO；1)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或(ii)TCRβ链可变区的CDR3，该CDR3包含CASSTHRGQTNYGYTF(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

本文提供的TCR能够结合包含在X1LX2GLDX3LL(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列内的表位或其HLA-A*02结合形式，优选结合包含在VLDGLDVLL(SEQ ID NO：32)的氨基酸序列内的表位或其MHC结合形式。上述氨基酸序列对应于PRAME(优先在黑色素瘤中表达的抗原)的氨基酸位置100至108，其被认为由多种不同的癌症表达。

根据本发明，TCR可以例如包含(i)TCRα链可变区，其包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或(ii)TCRβ链可变区，其包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。本发明的TCR还可包含TCRα链和/或TCRβ链中的恒定区。

特别地，本文提供的TCR可包含(i)TCRα链，其包含选自SEQ ID NO：7、9、11或13中任一个的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或包含与SEQ ID NO：7、9、11或13具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或(ii)TCRβ链，其包含选自SEQ ID NO：8、10、12或14中任一个的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或包含与SEQ ID NO：8、10、12或14具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

本发明的TCR可具有多种形式，如所述TCR可以是天然TCR、TCR变体、TCR片段或TCR构建体。本文还设想包含彼此共价连接的TCRα链和TCRβ链的异二聚体和多聚体以及包含一个或多个融合组分的TCR构建体。可用的TCR构建体包括例如TCRα链、TCRβ链(二者彼此共价连接)和抗体或抗体片段(比如svFv)，该抗体或片段针对淋巴细胞表面上的抗原或表位(如CD3、CD28、CD5、CD16或CD56)并通过连接子与TCR链融合。

其它可用的可与本发明的TCR共价连接的部分包含各种标记。本发明的TCR还可以可溶形式提供。

此外，本发明提供一种编码本文提供的TCR中的任一种的核酸，所述核酸例如包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29或30中任一个的核酸序列或由所述核酸序列组成。

此外，本文提供一种载体，其包含根据本发明所述的核酸。示例性载体包括病毒载体，如慢病毒或γ-逆转录病毒载体。

本文还提供了包含本发明的TCR、核酸或载体的宿主细胞。可用的宿主细胞包括淋巴细胞，比如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、γ/δ-T细胞。

此外，本发明提供一种用于获得本发明的TCR的方法。

本文还提供了一种包含本发明的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞的药物组合物或诊断组合物。还设想了本发明的TCR、核酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物作为药物或诊断剂的用途，特别是在癌症的检测、诊断、预后、预防和/或治疗中的用途。一种预防或治疗癌症的可用方法包括以下步骤：(a)提供本文公开的TCR、核酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物中的一种或多种；和(b)向有此需要的受试者施用上述物质中的一种或多种。本发明还设想以下步骤：(a)提供受试者的样品，所述样品包含淋巴细胞；(b)提供本文公开的TCR、核酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物中的一种或多种；和(c)将其引入步骤(a)中得到的淋巴细胞，并由此获得经修饰的淋巴细胞，(d)向有此需要的受试者或患者施用步骤(c)的所述经修饰的淋巴细胞。

本发明进一步涉及一种体外检测受试者中癌症的存在的方法，其包括：(a)提供受试者的样品，所述样品包含一个或多个细胞；(b)使所述样品与本发明的TCR、核酸、载体或宿主细胞接触，由此形成复合物，和(c)检测所述复合物，其中所述复合物的检测指示受试者中癌症的存在。

附图说明

图1示出了采用成熟树突细胞的引发(priming)方法的示意图。将PRAME转染的成熟树突细胞用于在自体健康供体的环境(repertoire)中从头诱导PRAME特异性CD8T细胞。

图2示出了与加载肽的T2细胞共培养的PRAME_100-108特异性T细胞克隆T4.8-1-29的多种细胞因子分泌(IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-5、IL-10、IL-6、IL12p70、IL-4、IL-1β)分析(PRAME_100-108“VLD肽”或PRAME_300-309“ALY肽”作为阴性对照，n.d.＝未检测到)。T4.8-1-29的特征在于具有如SEQ ID NO：1所示的其TCRα链可变区的CDR3和/或具有如SEQ ID NO：2所示的其TCRβ链可变区的CDR3。

图3示出了与多种表达HLA-A*02：01的人肿瘤细胞系共培养的PRAME_100-108特异性T细胞克隆T4.8-1-29的IFN-γ释放，其中如图3的图例所示，肿瘤细胞系中的一些表达PRAME(绿色柱)。不表达PRAME的肿瘤细胞系作为阴性对照(红色柱)。阳性对照：加载了“VLD肽”的T2细胞(黑色柱)，未刺激的T细胞的背景由白色柱表示(“n.d.＝未检测到”)。

图4示出了与加载了滴定量的PRAME_100-108肽的T2细胞共培养的PRAME_100-108特异性T细胞克隆T4.8-1-29的IFN-γ释放。虚线表示在10^-9-10^-10mol/L[M]之间导致半数最大IFN-γ分泌的肽浓度，将其作为测试的T细胞克隆的功能亲合力的量度。

图5为了证明转基因TCR的配对和功能性，通过标准ELISA测量了与加载了PRAME_100-108(VLD)肽的T2细胞或加载了无关肽的T2细胞共培养的PRAME_100-108特异性TCRT4.8-1-29转染的接受体CD8⁺T(接受体T细胞克隆+T4.8-1-29 ivtRNA)细胞的特异性IFN-γ释放。

图6示出了通过标准ELISA测量的与加载了自身肽(总共131种与HLA-A*02：01编码分子结合的普遍存在的自身肽)的T2细胞共培养的PRAME_100-108特异性富集CD8+的PBMC的特异性IFN-γ释放，该PBMC被工程化以表达PRAME_100-108特异性TCR T4.8-1-29。

图7示出了富集CD8+的PBMC对加载了PRAME_100-108-肽(“VLD-肽”)或无关肽SLLQHLIGL(“SLL-肽”)的T2细胞的裂解，该PBMC被工程化以表达PRAME_100-108特异性TCRT4.8-1-29。

图8示出了表达PRAME_100-108特异性TCR T4.8-1-29的人PBMC对表达PRAME_100-108的靶细胞的裂解。(A)另外加载了PRAME_100-108-肽(“VLD肽”)的HLA-A*02：01转染的、内源性PRAME阳性人K562肿瘤细胞的裂解。(B)另外被编码PRAME的ivtRNA转染的HLA-A*02阴性、内源性PRAME阳性人K562细胞作为阴性对照，未被裂解。(C)示出了另外被编码PRAME的ivtRNA转染的、HLA-A*02转染的、内源性PRAME阳性人K562细胞的裂解。(D)示出了HLA-A*02转染的、内源性PRAME阳性人K562的裂解。

图9示出了T细胞受体α和β链的可用实例的氨基酸序列(SEQ ID NO：11和12)和人PRAME的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。在α链和β链中，CDR1和CDR2序列加下划线，CDR3序列为灰色和粗体，可变区为常规字体，恒定区为斜体。

图10示出了如通过活化诱导的IFN-γ释放所指示和通过标准ELISA测量的，表达TCR T4.8-1-29HLA-A*02的富集CD8+的PBMC识别不同HLA-A*02和PRAME阳性肿瘤细胞系。

图11示出了健康供体的未转导的PBMC和用本文所述含有TCT T4.8-1-29构建体的质粒转导的健康供体的相同PBMC。

图12示出了在T细胞克隆T4.8-1-29(虚线)或采用T4.8-1-29转导的效应PBMC(实线)与加载肽的T2细胞共培养后，通过检测IFN-γ分泌测量的功能T细胞对PRAME_100-108(VLD)肽的亲合力。

图13示出了T4.8-1-29转导的效应PBMC和未转导的对照PBMC的抗原特异性分析。对肿瘤细胞系OPM-2和U937(HLA-A2-阴性和PRAME-阴性)在未经修饰或用编码HLA-A2的ivtRNA转染的情况下进行测试。

图14示出了抗原特异性分析，T4.8-1-29-转导的效应PBMC和未转导的对照PBMC与不同的靶细胞系共培养。对肿瘤细胞系K562(HLA-A2-阴性和PRAME-阳性)以及K562_A2和Mel 624.38(HLA-A-阳性和PRAME-阳性)和647-V(HLA-A2-阳性和PRAME-阴性)进行测试。

图15示出了采用IncuCyte

-活细胞分析系统(Essenbiosciences)(基于显微镜的系统，允许对细胞进行活成像)对T4.8-1-29-转导的效应物针对肿瘤细胞的细胞毒性活性进行分析。

图16示出了表达T4.8-1-29的PBMC的安全性情况(profile)分析。

发明详述

本发明人已经鉴定了能够特异性识别表达肿瘤相关抗原(TAA)PRAME的细胞的T细胞克隆；并且这些T细胞克隆显示出有利的效应功能，比如细胞因子产生和靶细胞的细胞溶解。因此，所述T细胞克隆及其T细胞受体是用于高度特异性和有效地治疗癌症的有希望的工具。因此，所鉴定的PRAME特异性TCR适用于癌症的过继性T细胞疗法。由此，能够以高度特异性方式结合PRAME的TCR的鉴定允许离体“武装”T细胞并将它们重新引入供体，在其中它们可以有效地识别并特异性地消除表达PRAME的癌细胞。此外，本文提供的新型TCR的抗原结合区可用于设计可溶性构建体，该构建体包含易于直接施用的其它功能部分(比如药物、标记或吸引其它免疫细胞的结合结构域)。

可变区

CDR3结构域

因此，在第一方面，本发明涉及一种T细胞受体(TCR)，其包含(i)T细胞受体α链CDR3，该CDR3包含CAVHSTAQAGTALIF(SEQ ID NO：1)的序列或由所述序列组成；和/或(ii)T细胞受体β链CDR3，该CDR3包含CASSTHRGQTNYGYTF(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

此外，本文还设想包含CDR3α和/或CDR3β的TCR序列变体，所述CDR3α包含与SEQ IDNO：1具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；所述CDR3β包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；条件是所述TCR保留在所附实施例中评估的TCR的有利能力，即能够结合本文所述的抗原靶标。

如本文所用的术语“T细胞受体”或“TCR”包括天然TCR以及TCR变体、片段和构建体。因此该术语包括包含TCRα链和TCRβ链的异二聚体以及多聚体和单链构建体；任选地包含其它结构域和/或部分。

在TCR的天然形式中，其作为T细胞表面上的若干蛋白质的复合物存在。T细胞受体由两条(单独的)蛋白质链组成，这些蛋白质链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生，并被称为α(α-)和β(β-)链。TCR的每条链具有一个N-末端免疫球蛋白样(Ig)-可变(V)结构域/区域，一个Ig-恒定样(C)结构域/区域，将链锚定在质膜中的跨膜/细胞膜跨越区域，和C-末端的短细胞质尾。

抗原特异性是由α和β链的可变区赋予的。TCRα链和β链的两个可变结构域均包含由框架(FR)区包围的三个高变或互补决定区(CDR1α/β、CDR2α/β和CDR3α/β)。CDR3是抗原识别和特异性(即识别特异性抗原并与之相互作用的能力)的主要决定簇，而CDR1和CDR2主要与呈递抗原肽的MHC分子相互作用。

天然TCR识别抗原肽，该抗原肽与抗原呈递细胞表面处的主要组织相容性复合体(MHC)分子结合(“在MHC分子上呈递/展示”)。在MHC分子上呈递的抗原肽在本文中也称为“肽：MHC复合物”。存在两种不同类别的MHC分子：MHC I和MHC II，其呈递来自不同细胞区室的肽。MHC I类分子在人体所有有核细胞的表面上均有表达，并展示从细胞内区室到细胞毒性T细胞的肽或蛋白质片段。在人类中，MHC也称为人白细胞抗原(HLA)。MHC I类有三种主要类型：HLA-A、HLA-B和HLA-C。一旦TCR结合其特异性肽：MHC复合物，则T细胞被活化并发挥生物效应功能。

如下面将详细讨论的，本文提供的TCR能够有利地(特异性)识别PRAME，特别是其MHC结合形式的PRAME_100-108。当抗原肽与MHC分子(可能存在于抗原呈递细胞比如树突细胞或肿瘤细胞的表面上，或通过例如涂布到珠子或板上而被固定)形成复合物时，则称该抗原肽以其“MHC结合形式”存在。

CDR1和CDR2结构域

如前所述，特别设想，当本发明的TCR的抗原靶标PRAME_100-108在MHC分子、具体在MHC-I分子、特别是HLA-A、优选HLA-A*02和具体而言在由等位基因HLA-A*02：01编码的HLA-A2分子上呈递时，本发明的TCR识别所述抗原靶标(T细胞或TCR被称为“限制”于特定的MHC分子)。还可以想到，本发明的TCR识别在其他HLA-A*02等位基因上呈递的它们的抗原靶标。如前所述，认为TCRα和β链的CDR1和CDR2主要参与MHC识别。存在已知参与HLA-A*02限制性抗原识别的CDR1和CDR2序列的有限的“池(pool)”，并且设想本发明的CDR3结构域原则上可以与SEQ ID NO：34-224所示的CDR1和CDR2结构域中的任一个组合，条件是所述TCR保留其识别其抗原靶标(优选以其HLA-A*02结合形式)的能力，保留的程度与所附实施例中评估的TCR相似、相同、甚至更高。CDR1和CDR2结构域的可用实例包括包含SEQ ID NO：5所示的序列VSGLRG或由所述序列组成的CDR1α，包含SEQ ID NO：3所示的序列LYSAGEE或由所述序列组成的CDR2α，包含SEQ ID NO：6所示的序列SGDLS或由所述序列组成的CDR1β，和包含SEQ IDNO：4所示的序列YYNGEE或由所述序列组成的CDR2β。图9也示出了所述CDR序列。

根据前述内容，本发明尤其提供了包含两条多肽链的TCR，每条多肽链包含人可变区，所述人可变区包含TCR的至少一个互补决定区(即特别是CDR3，和优选CDR1和/或CDR2)。具有特别有利性质的TCR(如所附实施例中所示)包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含含有SEQ ID NO：5(CDR1α)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR1，含有SEQ ID NO：3(CDR2α)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR2，和含有SEQ ID NO：1(CDR3α)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR3；所述第二多肽链包含含有SEQ IDNO：6(CDR1β)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR1，含有SEQ ID NO：4(CDR2β)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR2，和含有SEQ ID NO：2(CDR3β)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的CDR3。

完整的可变区

本发明进一步提供一种包含TCRα链可变区和/或TCRβ链可变区的TCR，所述TCRα链可变区包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述TCRβ链可变区包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。所述α和β链序列还示于图9(常规字体)。

本文还设想了包含α链可变区和/或TCRβ链可变区的TCR序列变体，所述α链可变区包含与SEQ ID NO：15具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列，所述TCRβ链可变区包含与SEQ ID NO：16具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；条件是所述TCR保留在所附实施例中评估的TCR的有利能力，即能够结合本文所述的抗原靶标。

恒定区

TCR在其α和/或β链上还包含恒定(C)区。所述恒定区可以是人恒定区或衍生自另一物种，从而产生“嵌合的”TCR。例如，人α和/或β链可以被它们的鼠对应物取代(“鼠源化”)，已经发现所述鼠对应物通过支持TCRα和β链的优先配对来增强人TCR的表面表达以及增强与CD3共受体更稳定的结合。合适的α链恒定区可以例如选自SEQ ID NO：17(人)、19(最小鼠源化)和21(鼠)。合适的β链恒定区可选自SEQ ID NO：18(人)、20(最小鼠源化)和22(鼠)。代替用它们的鼠对应物来取代完整的人恒定区，还可以如本文中的“TCR序列变体”部分所阐述的，仅将人恒定区中的若干氨基酸交换为鼠恒定区的相应氨基酸(“最小鼠源化”)。

α和β链

本发明的TCR的可用实例包括包含α链和β链的那些，所述α链包含如SEQ ID NO：7、9、11或13所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述β链包含如SEQ ID NO：8、10、12或14所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。因此，本发明尤其提供了一种包含α链和β链或由α链和β链组成的TCR，所述α链包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述β链包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；提供一种包含α链和β链或由α链和β链组成的TCR，所述α链包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述β链包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；提供一种包含α链和β链或由α链和β链组成的TCR，所述α链包含如SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述β链包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成(两者还示于图9)；和提供一种包含α链和β链或由α链和β链组成的TCR，所述α链包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，所述β链包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

本文还设想了包含α链和/或TCRβ链的TCR序列变体，所述α链包含与SEQ ID NO：7、9、11或13具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列，所述TCRβ链包含与SEQ ID NO：8、10、12或14具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；条件是所述TCR保留在所附实施例中评估的TCR的有利能力，即能够结合本文所述的抗原靶标。

抗原靶标

本文提供的TCR能够有利地结合(人)PRAME。PRAME(优先在肿瘤中表达的黑色素瘤抗原，Uniprot Acc.No.P78395)，也称为MAPE(在肿瘤中优先表达的黑色素瘤抗原)和OIP4(OPA-相互作用蛋白4)，其被报道为一种具有未知功能的癌睾丸抗原(CTA)。

特别地，本发明提供了能够(特异性)结合这样的表位的TCR，该表位包含在对应于如SEQ ID NO：33所示的PRAME氨基酸序列的氨基酸位置100-108(图9，粗体)的氨基酸序列内。由如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列组成的PRAME肽在本文中也称为PRAME_100-108或“抗原靶标”或“VLD肽”。如本文其它地方所述，本发明的TCR-优选识别由MHC、特别是HLA-A*02结合的PRAME_100-108。

当根据本发明使用时，术语“位置”是指本文描述的氨基酸序列中的氨基酸的位置或本文描述的核酸序列中的核苷酸的位置。本文所用的术语“对应”或“相应”还包括这样的位置，该位置不仅由前面的核苷酸/氨基酸的数目决定，而是在所述序列的周边部分的情况下察看。因此，由于在所述序列中其它位置处的氨基酸或核苷酸的缺失或添加，根据本公开的给定氨基酸或核苷酸的位置可能改变。因此，当位置被称为根据本公开的“对应/相应位置”时，应理解核苷酸/氨基酸根据指定数字可能不同，但仍可能具有相似的相邻核苷酸/氨基酸。为了确定给定序列中的氨基酸残基(或核苷酸)是否对应于“亲本”氨基酸/核苷酸序列的氨基酸序列中的某个位置，技术人员可以采用本领域熟知的手段和方法，如手动地或通过使用比如本文所示例的计算机程序的序列比对。

术语“表位”通常是指抗原上的位点，通常是结合结构域识别的(多)肽。术语“结合结构域”以其最广义是指“抗原结合位点”，即表征与抗原靶标上的特定表位结合/相互作用的分子的结构域。抗原靶标可以包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并且根据抗原的大小、构象和类型，抗原靶标可以包括任何数量的表位。术语“表位”通常包括线性表位和构象表位。线性表位为包含在氨基酸一级序列中的连续表位，并且其通常包括至少2个氨基酸或更多个氨基酸。构象表位是由通过靶标抗原、并且特别是靶(多)肽的折叠而并排的非连续氨基酸形成的。

在本发明的上下文中，术语“结合结构域”特别是指TCRα和/或β链的可变区，特别是TCR的CDR3α和CDR3β。

本发明人发现，本发明的TCR识别的最小氨基酸序列对应于氨基酸序列X1LX2GLDX3LL(SEQ ID NO：31)，其中X选自任何氨基酸。具体而言，如所附实施例中所示，已经证明本发明的TCR(特异性地)识别包含氨基酸序列VLDGLDVLL(SEQ ID NO：32)或由所述氨基酸序列组成的氨基酸序列。因此，本发明的TCR能够结合这样的氨基酸序列，该氨基酸序列包含氨基酸序列X1LX2GLDX3LL(SEQ ID NO：31)或由所述氨基酸序列组成，优选包含氨基酸序列VLDGLDVLL(SEQ ID NO：32)或由所述氨基酸序列组成或它们的MHC结合形式。例如，设想所识别的肽可包含位于SEQ ID NO：31、特别是SEQ ID NO：32所示的识别基序的C-和/或N-末端的其他C氨基酸。具体而言，设想本文描述的TCR识别上述氨基酸序列中的至少一个表位。所有语法形式的术语“结合”和“识别”在本文中可互换使用。特别设想当抗原靶标被MHC I类分子、特别是HLA-A分子和优选HLA-A*02分子、特别是HLA-A*02：01分子结合时，其被本发明的TCR识别。所述MHC分子、特别是HLA-A和HLA-A*02分子，可以存在于细胞、例如肿瘤细胞的表面上，或存在于(固体)载体上。

优选地，本发明的TCR特异性地结合它们的抗原靶标。术语“特异性(地)结合”通常表明相比于与随机的、不相关的非靶标抗原结合，TCR通过其抗原结合位点更容易与其预期的抗原靶标结合。特别地，术语“特异性结合”表示TCR对其靶标抗原的结合特异性与其对其非靶标抗原的结合特异性相比，是至少约5倍、优选10倍、更优选25倍、甚至更优选50倍、最优选100倍高或更高。

设想表达如本文所述的天然TCR的效应宿主细胞以高功能亲合力结合它们的抗原靶标(即优选由抗原呈递细胞在HLA-A*02上呈递的PRAME_100-108)。术语“功能亲合力”是指TCR表达细胞(特别是表达如本文所述的天然TCR的T细胞)在体外响应于给定浓度的配体的能力，并且认为其与TCR表达细胞的体内效应能力相关。根据定义，具有高功能亲合力的TCR表达细胞在体外试验中响应于非常低的抗原剂量，而较低功能亲合力的这类细胞在达到类似于高亲合力的TCR表达细胞的免疫响应之前，则需要更高量的抗原。因此，可以将功能亲合力看作是TCR表达细胞的活化阈值的定量决定因素。这通过将此类细胞在体外暴露于不同量的同源抗原来测定。具有高功能亲合力的TCR表达细胞响应于低抗原剂量。例如，如果TCR表达细胞在与抗原阴性HLA-*02表达靶细胞共培养时分泌至少约200pg/mL或更多(如200pg/mL或更多、300pg/mL或更多、400pg/mL或更多、500pg/mL或更多、600pg/mL或更多、700pg/mL或更多、1000pg/mL或更多、5,000pg/mL或更多、7,000pg/mL或更多、10,000pg/mL或更多、或20,000pg/mL或更多)干扰素γ(IFN-γ)，则通常认为该TCR表达细胞以“高”功能亲合力结合其抗原靶标，其中所述抗原阴性HLA-*02表达靶细胞以956g/mol的PRAME_100-108肽的分子量加载了范围为约10^-5至约10^-11M(即，约0.05ng/mL至约5ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL或5ng/mL)的低浓度的PRAME_100-108肽。

测定本发明TCR的特异性结合的其它方法包括由Gertner-Dardenne等J Immunol188(9)：4701-4708描述的⁵¹Cr-释放分析、由Leisegang等Clin.Cancer Res 2010.16：2333-2343描述的CD107a/b动员(mobilization)和由Wilde等J Immunol 2012；189：598-605描述的肽：MHC多聚体结合分析。

变体

如前所述，术语“TCR”包括TCR变体，其包括TCR序列变体、片段和构建体。设想所有TCR变体均为本发明TCR的功能变体。如本文所用的术语“功能变体”是指与亲本TCR、其可变区或其抗原结合区具有实质或显著序列同一性或相似性的TCR、多肽或蛋白质，并共有其生物活性，即所述功能变体特异性结合本发明的亲本TCR对其具有抗原特异性的抗原靶标的能力，结合的程度与本文公开的并在所附实施例中评估的TCR相似、相同、甚至更高。

序列变体

术语“TCR变体”包括本文公开的TCR的“序列变体”，即基本上包含上述本发明的TCR(也称为“亲本”TCR)的氨基酸序列但与该“亲本”TCR氨基酸序列相比含有至少一个氨基酸修饰(即置换、缺失或插入)的变体，条件是所述变体优选保留本发明“亲本”TCR的抗原特异性。本发明的TCR序列变体通常通过将合适的核苷酸改变引入编码“亲本”TCR的核酸中，或通过肽合成来制备。一般而言，上述氨基酸修饰可以引入或存在于TCR的可变区或恒定区，并且可以用于调节诸如结合强度和特异性、翻译后加工(例如糖基化)、热力学稳定性、溶解度，表面表达或TCR组装的性质。

如前所述，氨基酸修饰包括，例如，使亲本TCR的氨基酸序列中的残基缺失，和/或向亲本TCR的氨基酸序列中插入残基和/或置换亲本TCR的氨基酸序列中的残基。本发明的TCR的示例性插入变体包括所述TCR与酶或另一种功能多肽的融合产物。本发明的TCR的示例性置换变体是在α和/或β链的可变区或CDR中、在框架区或恒定区中包括氨基酸置换的变体。本文特别设想的是保守氨基酸置换。保守氨基酸置换是本领域已知的，并且包括氨基酸置换，其中一个具有一定物理和/或化学性质的氨基酸被交换为另一个具有相同化学或物理性质的氨基酸。例如，所述保守氨基酸置换可以是酸性氨基酸置换另一个酸性氨基酸(如，Asp或Glu)，具有非极性侧链的氨基酸置换另一个具有非极性侧链的氨基酸(如，Ala、Gly、Val、He、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)，碱性氨基酸置换另一个碱性氨基酸(Lys、Arg等)，具有极性侧链的氨基酸置换另一个具有极性侧链的氨基酸(Asn、Cys、Gin、Ser，Thr，Tyr等)等，所述保守置换可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行。

半胱氨酸修饰

据报道，在恒定区添加二硫键可促进TCRα和β链的正确配对(Kuball J等Blood.2007 Mar 15；109(6)：2331-8)。因此，本文还设想在恒定区中添加一个或多个半胱氨酸键。

鼠源化

如前所述，TCR的鼠源化(即将α链和β链中的人恒定区交换为它们的鼠对应物)是一种常规应用的技术，以便改善宿主细胞中TCR的细胞表面表达。不希望受特定理论的束缚，认为鼠源化TCR与CD3共受体更有效地结合；和/或优先彼此配对，并且不太容易在离体工程化以表达具有所需抗原特异性的TCR、但仍保留和表达它们的“原始”TCR的人T细胞上形成混合的TCR。

最近已经识别了负责改善鼠源化TCR的表达的9个氨基酸(Sommermeyer和Uckert，J Immunol.2010 Jun 1；184(11)：6223-31)并且设想将TCRα和/或β链恒定区中的一个或全部氨基酸残基置换为它们的鼠对应物残基。该技术也称为“最小鼠源化”，并且提供了以下优点：增强细胞表面表达，同时减少氨基酸序列中“外源”氨基酸残基的数量，并由此降低了免疫原性的风险。

通常，设想TCR序列变体包含本文公开的CDR1、CDR2、CDR3、α链可变区、β链可变区、α链和/或β链中的至少一个，或包含与本文公开的氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，或与本文公开的氨基酸序列相同，条件是与在所附实施例中评估的TCR相比，所述变体表现出相当的、相同的或改善的结合特性。

如本文所用的术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性，但是高度保守性较低且具有缺失、添加或替换的序列可具有较低程度的同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)和ClustalW。

因此，SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列可以例如作为“主体序列”或“参考序列”，而与之不同的CDR3的氨基酸序列可作为“查询序列”。

构建体和片段

如本文所用的术语“TCR”进一步包括TCR构建体。术语“构建体”包括包含本发明TCR的至少一个抗原结合结构域的的蛋白或多肽，但无需具有天然TCR的基本结构(即引入形成异二聚体的TCRα链和TCRβ链的可变结构域)。TCR构建体和片段通常通过基因工程的常规方法获得，并且通常被人工构建以包含另外的功能蛋白质或多肽结构域。根据前述内容，设想本发明的TCR构建体和片段包含如本文其它地方所公开的至少一个CDR3α和/或至少一个CDR3β。本文进一步设想包含任选地与本文列举的其它蛋白质结构域或部分组合的至少一个CDR1α、CDR2α、CDR1β、CDR2β、α链可变区、β链可变区、α链和/或β链或它们的组合的构建体和片段。设想本文提供的TCR构建体和片段能够与上述并在所附实施例中评估的本发明的TCR特异性结合相同的抗原靶标。

多聚体

术语“TCR构建体”涵盖异二聚体和多聚体，其中至少一个TCRα链可变区或TCRα链与至少一个TCRβ链可变区彼此共价连接。在其最简单的形式中，根据本发明的多价TCR构建体包含彼此相连(例如共价或以其它方式连接，优选通过连接子分子)的两个或三个或四个或更多个TCR的多聚体。

合适的连接子分子包括但不限于，诸如抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白和extravidin的多价附着分子，其中每种都具有四个生物素结合位点。因此，生物素化的TCR可以形成具有多个TCR结合位点的多聚体。多聚体中TCR的数量将取决于与用于制备该多聚体的连接分子的数量相关的TCR的数量，并且还取决于是否存在任何其它生物素化的分子。示例性的多聚体是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体或更高阶的多聚体TCR构建体。本发明的多聚体还可包含诸如标记或药物或(固体)载体的其它功能实体。

术语“TCR构建体”还涵盖通过合适的连接子与球体(spheric body)连接的TCR分子，所述球体优选为均匀的珠子，更优选聚苯乙烯珠子，最优选生物相容的聚苯乙烯珠子。此类TCR构建体还可以包含本发明的TCR和珠子，所述珠子具有引入珠子中的预先定义的荧光染料。

融合蛋白

术语“TCR构建体”还涉及包含至少一个TCRα链、TCRα链可变区或CDR3α和/或至少一个TCRβ链、TCRβ链可变区或CDR3β；以及一个或多个其它融合组分。可用的组分包括Fc受体；Fc结构域(源自IgA、IgD、IgG、IgE和IgM)；细胞因子(比如IL-2或IL-15)；毒素；抗体或其抗原结合片段(比如抗-CD3、抗-CD28、抗-CD5、抗-CD16或抗-CD56抗体或它们的抗原结合片段)；CD247(CD3-ζ)、CD28、CD137、CD134结构域；或它们的任意组合。

可用作融合组分的示例性抗体片段包括全长抗体的片段，比如(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab’、F(ab′)₂或“r IgG”(“半抗体”)；修饰的抗体片段，比如scFv、二-scFv或双-scFv、scFv-Fc、scFv-拉链(zipper)、scFab、Fab2、Fab3、双体、单链双体、串联双体(Tandab’s)、串联二-scFv、串联三-scFv、迷你体、诸如三体或四体的多体和诸如纳米体的单结构域抗体或包含仅一个可变结构域(其可以是V_HH、V_H或V_L)的单可变结构域抗体。

本发明的TCR构建体可以与一种或多种抗体或抗体片段融合，产生单价、二价和多价/多化合价的构建体，并因此产生单特异性构建体以及双特异性和多特异性(polyspecific/multispecific)构建体，所述单特异性构建体特异性地结合仅一种靶标抗原，所述多特异性构建体通过不同的抗原结合位点特异性地结合超过一种(如两种、三种或更多种)靶标抗原。

任选地，可以在本发明的TCR构建体的结构域或区域的一个或多个之间，即在TCRα链CDR3、TCRα链可变区和/或TCRα链、TCRβ链CDR3、TCRβ链可变区和/或TCRβ链，和/或本文所述的一个或多个融合组分之间引入连接子。连接子是本领域已知的，并且已经尤其由Chen等Adv Drug Deliv Rev.2013 Oct 15；65(10)：1357-1369进行了综述。一般而言，连接子包括柔性、可切割和刚性连接子，并且将根据构建体的类型和预期用途/应用来选择连接子。例如，对于治疗应用，通常优选非免疫原性的柔性连接子，以便确保结构域之间的一定程度的灵活性或相互作用，同时降低不利免疫原性反应的风险。此类连接子通常由小的非极性(如Gly)或极性(如Ser或Thr)氨基酸组成并包括由Gly和Ser残基的区段(stretches)组成的“GS”连接子。最常用的柔性连接子的实例也旨在用于本发明的TCR构建体，其具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n(SEQ ID NO：225)的序列。其它合适的连接子包括例如KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：226)和EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：227)和GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO：228)。

根据本发明设想的特别可用的TCR构建体为包含如本文定义的至少一个TCRα链、TCRα链可变区或CDR3α，如本文定义的至少一个TCRβ链、TCRβ链可变区或CDR3β的那些构建体，任选地它们彼此连接并任选地通过连接子融合至至少一个针对淋巴细胞表面上的抗原或表位的抗体或抗体片段(比如单链抗体片段(scFv))。由抗体或抗体片段(如scFv)识别的可用抗原靶标包括CD3、CD28、CD5、CD16和CD56。一般而言，所述构建体可以具有任何结构，只要所述“TCR部分”(即TCRα和β链或其可变区或CDR3)保留其识别本文定义的抗原靶标的能力，并且所述“抗体部分”结合所需的表面抗原或表位，由此募集各自的淋巴细胞并将所述淋巴细胞靶向至靶细胞。有利地，此类构建体可作为将展示抗原靶标的抗原呈递细胞(比如肿瘤细胞)与淋巴细胞(比如细胞毒性T细胞或NK细胞)连接在一起的“衔接子”。这种融合蛋白的实例是根据双特异性T细胞衔接物(engager)

的原理在约55千道尔顿(kD)的单肽链上工程化的构建体，所述双特异性T细胞衔接物由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)组成。因此，本发明的TCR构建体可包含至少一个如本文所述的TCR抗原结合结构域(例如彼此融合的TCR可变α链和可变β链)，其与具有所需结合特异性的scFv(或其它结合结构域)连接，如CD3或CD56。所述scFv(或其它结合结构域)，如经由CD3受体结合T细胞或结合CD56以使NK细胞活化，另一种通过肿瘤细胞上特异性表达的抗原靶标结合肿瘤细胞。本文还设想了包含至少一个如本文所述的TCR抗原结合结构域、scFv(或其它结合结构域)和其它结构域的三抗体(tribody)，该其它结构域如用于将构建体靶向体内的作用位点(例如Fc结构域)。

分离的形式

本发明的TCR可以以“分离的”或“基本上纯的”形式提供。当在本文中使用时，“分离的”或“基本上纯的”是指已经从其产生环境的组分中鉴别、分离和/或回收TCR，使得该“分离的”TCR不含或基本上不含来自其产生环境的可能干扰其治疗或诊断用途的其它污染物组分。污染物组分可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。因此，通过至少一个移除或基本上移除这些污染物组分的纯化步骤制备“分离的”TCR。加以必要的修改，上述定义同样适用于“分离的”多核苷酸/核酸。

可溶形式

本发明的TCR可以以可溶形式提供。可溶性TCR可用作诊断工具和将治疗剂或效应细胞特异性靶向例如表达被可溶性TCR识别的抗原靶标的癌细胞的载体或“衔接子”。可溶性TCR(sTCR)通常为包含TCRα和/或β链或其可变区或CDR的片段或构建体，并且任选地其通过二硫键稳定或通过如上在本发明的TCR构建体上下文中描述的合适的连接子分子共价连接。通常，所述可溶性TCR不包括如跨膜区。在一些情况下，特别是当在不提供下述特征的重组宿主中产生时，可以引入多肽序列中的氨基酸修饰以便增强分子的溶解度，和/或α链和β链的正确折叠和配对(如果需要)。例如，当采用大肠杆菌作为生产宿主细胞时，TCRα和β链的折叠和配对通常在体外完成。因此，如本文其它地方所述，根据本发明的TCR可以例如包含另外的半胱氨酸残基。

除了另外的半胱氨酸桥之外，其它可用的修饰包括，例如，添加亮氨酸拉链和/或核糖体跳跃(skipping)序列，例如，如Walseng等(2015)，PLoS ONE10(4)：e0119559所述的来自小核糖核酸病毒的序列2A，以增加TCRα和/或β链的折叠、表达和/或配对。

修饰

本发明的TCR可以进一步包含如下所述的一种或多种修饰。下面描述的修饰通常是共价修饰，并且可以使用本领域已知的标准技术完成。在一些情况下，可能需要TCR中的氨基酸修饰以便方便引入所述修饰。

标记

本发明的TCR、特别是(可溶性)TCR可以被标记。可用的标记是本领域已知的并且采用常规方法，任选地通过不同长度的连接子可以将所述标记与TCR或TCR变体偶联。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。通常，取决于标记将在其中被检测的分析法，它们属于多种类别，以下实例包括但不限于：同位素标记，其可为放射性同位素或重同位素，比如放射性同位素或放射性核素(如³H、¹⁴C、¹⁵N、³⁵S、⁸⁹Zr、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I)；磁性标记(如磁颗粒)；氧化还原活性部分；光学染料(包括但不限于生色团、磷光体和荧光团)，比如荧光基团(如FITC、若丹明(rhodamine)、镧系元素磷光体)、化学发光基团和可以是“小分子”荧光团或蛋白质性荧光团的荧光团；酶基团(如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；生物素化基团；或由二级报道子(reporter)(如亮氨酸拉链配对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)识别的预定多肽表位。当TCR、TCR变体或特别是可溶性TCR构建体(比如包含如本文所述的至少一个TCRα和/或TCRβ链的构建体)用于诊断用途时，特别设想标记。

功能部分

本发明的TCR，特别是可溶性TCR，可以通过连接其它功能部分而被修饰，从而如用于降低免疫原性，增加流体动力学大小(溶液中的大小)溶解度和/或稳定性(例如通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期。

根据本发明使用的示例性功能部分包括与人体内的其它蛋白质(比如血清白蛋白、免疫球蛋白Fc区或新生儿Fc受体(FcRn))结合的肽或蛋白质结构域，不同长度的多肽链(如，XTEN技术或

)，非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇，比如聚乙二醇(聚乙二醇化)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物，或碳水化合物，比如羟乙基淀粉(如

)或聚唾液酸(如

技术)。

其它可用于切断(shut off)在患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞的可用功能部分包括“自杀”或“安全开关”。一个实例是由Gargett和Brown Front Pharmacol.2014；5：235描述的可诱导的Caspase 9(iCasp9)“安全开关”。简言之，通过熟知的方法修饰效应宿主细胞以使其表达Caspase 9结构域(其二聚化依赖于小分子二聚化物药物如AP1903/CIP，并导致在经修饰的效应细胞中快速诱导细胞凋亡)。在例如EP2173869(A2)中描述了此系统。其它“自杀”、“安全开关”的实例是本领域中是已知的，如，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、CD20的表达和随后使用抗-CD20抗体或myc标签的耗竭(Kieback等，Proc NatlAcad Sci U S A.2008 Jan 15；105(2)：623-8)。

糖基化

本文还设想了具有改变的糖基化形式的TCR。本领域已知，糖基化模式可取决于氨基酸序列(如，下文讨论的是否存在特定糖基化氨基酸残基)和/或产生所述蛋白质的宿主细胞或生物体。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指将碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。通过改变氨基酸序列，使得其含有一个或多个选自天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸的三肽序列(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)，可方便地完成将N-连接的糖基化位点添加到结合分子中。可以通过向起始序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来引入O-连接的糖基化位点。

TCR糖基化的另一种手段是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。根据所用的偶联模式，糖可以附着到(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离硫氢基，比如半胱氨酸的硫氢基，(d)游离羟基，比如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基，(e)芳香族残基，比如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。

类似地，可以如通过将TCR暴露于三氟甲磺酸从而化学地或通过采用内切糖苷酶和外切糖苷酶从而酶促地完成去糖基化(即，除去结合分子上存在的碳水化合物部分)。

药物缀合物

还可以想到将比如小分子化合物的药物添加至本发明的TCR，特别是可溶性TCR中。可以通过共价键或非共价相互作用，比如通过静电力来实现连接。可以使用本领域已知的各种连接子以便形成药物缀合物。

标签

可以修饰本发明的TCR，特别是可溶性TCR以引入其它结构域，所述结构域有助于识别、示踪、纯化和/或分离相应的分子(标签)。此类标签的非限制性实例包括称为Myc-标签、HAT-标签、HA-标签、TAP-标签、GST-标签、甲壳素结合结构域(CBD-标签)、麦芽糖结合蛋白质(MBP-标签)、Flag-标签、Strep-标签及其变体(如Strep II-标签)、His-标签、CD20、Her2/neu标签、myc-标签、FLAG-标签、T7-标签、HA(血细胞凝集素)-标签或GFP-标签的肽基序。

表位标签是可以引入本发明TCR的标签的可用实例。表位标签是氨基酸的短区段，其允许结合特异性抗体，并从而允许对可溶性TCR或宿主细胞在患者体内或培养的(宿主)细胞内的结合和运动进行识别和示踪。因此，可以使用许多不同的技术来检测表位标签并从而检测标记的TCR。这些技术的实例包括：免疫组织化学、免疫沉淀、流式细胞术、免疫荧光显微术、ELISA、免疫印迹(“Western”)和亲和层析。表位标签可以具有例如6至15个氨基酸、特别是9至11个氨基酸的长度。在本发明的TCR中还可以包含超过一个表位标签。

通过在对所述标签特异性的结合分子(抗体)存在下培养携带本发明TCR的宿主细胞，标签可以进一步用于刺激和扩增所述细胞。

核酸

本发明进一步提供了编码本文所述TCR的核酸。具体而言，本文提供了编码本发明的TCRα或β链、TCRα或β链可变区和TCR CDR3α和CDR3β以及TCR变体、构建体和片段的多核苷酸。

如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”包括多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的RNA或DNA，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括DNA(比如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(比如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(比如PNA)。

多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(PNA)中发现的)。本发明的多核苷酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的结合分子可以从多核苷酸表达即可。多核苷酸可以以本文其它地方定义的分离形式提供。多核苷酸可包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。

特别地，本发明提供一种多核苷酸，其包含与选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29或30的参考多核苷酸序列具有至少约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同一性的核酸或由所述核酸组成。

上述多核苷酸可包含或不包含另外的或改变的核苷酸序列，所述另外的或改变的核苷酸序列编码如改变的氨基酸残基、指导所编码的TCR分泌的信号肽、恒定区或如本文所述的其它异源多肽。因此，此类多核苷酸可编码本文所述的结合分子的融合多肽、片段、变体和其它衍生物。

另外，本发明包括包含上述多核苷酸中的一种或多种的组合物。本文还提供包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物，其中所述第一多核苷酸编码如本文所述的TCRα链可变区和其中所述第二多核苷酸编码如本文所述的TCRβ链可变区。

可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的宿主细胞(如，人淋巴细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达，特别设想这些细胞用于表达本发明的可溶性TCR。密码子优化是指将目的序列中在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子由在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子替换，这样的密码子与被交换的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的选择取决于宿主基因组的密码子使用和几种希望的和不希望的序列基序的存在。

载体

本文进一步提供一种载体，其包含如本文所述的多核苷酸中的一种或多种。“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介的核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。

术语“载体”涵盖但不限于质粒、病毒载体(包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、牛痘病毒载体、多瘤病毒载体和腺病毒相关载体(AAV))、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的DNA序列和作为载体“骨架”的较大序列。工程化载体通常包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、遗传标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签。如本领域技术人员已知的，大量合适的载体是本领域技术人员已知的，并且许多可商购获得。在J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第4版)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2012)中提供了合适载体的实例，并包括：

靶向载体

通过本领域已知的方法，靶向载体可用于将多核苷酸整合到宿主细胞的染色体中，所述方法比如由J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第4版)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2012)描述的。简言之，合适的方法包括同源重组或使用特异性靶向整合位点处的序列的杂合重组酶。靶向载体通常是环状的并且在用于同源重组之前线性化。可选地，外源多核苷酸可以是通过融合PCR连接的DNA片段或是合成构建的DNA片段，它们随后被重组到宿主细胞中。还可以使用导致随机或非靶向整合的异源重组。

本发明还提供一种包含本文所述的核酸的载体。

表达载体

本发明的载体还可以是表达载体。“表达载体”或“表达构建体”可用于异源多核苷酸序列(例如编码本发明的TCR的那些序列)在合适的宿主细胞中的转录以及它们的mRNA的翻译。这一过程在本文中也称为本发明TCR的“表达”。

除了复制起点、选择标记和限制酶切割位点，表达载体通常包括与待表达的异源多核苷酸可操作地连接的一个或多个调节序列。

术语“调节序列”是指在特定宿主生物体或宿主细胞中表达(异源)多核苷酸的可操作连接的编码序列所必需的核酸序列，并因此包括转录和翻译调节序列。通常，在原核生物中表达异源多核苷酸序列所需的调节序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。在真核生物中，通常需要启动子、聚腺苷酸化信号、增强子和任选的剪接信号。此外，还可以将特异性起始和分泌信号引入载体中，以便允许目的多肽分泌到培养基中。

当将核酸与另一个核酸序列置于功能上的关系时，特别是在相同多核苷酸分子上时，则该核酸是“可操作地连接的”。例如，当启动子能够影响异源基因的编码序列的表达时，则该启动子与该编码序列是可操作地连接的。通常将启动子置于编码目的多肽的基因的上游并调节所述基因的表达。

用于哺乳动物宿主细胞表达的示例性调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，例如源自巨细胞病毒(CMV)的启动子和/或增强子(比如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(比如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。如前所述，所述表达载体还可以包括复制起点和可选择标记。

如前所述，本发明的载体可以进一步包含一种或多种选择标记。用于真核宿主细胞的合适选择标记包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)基因。其它基因包括dhfr(甲氨蝶呤抗性)、gpt(霉酚酸抗性)、neo(G-418抗性)和hygro(潮霉素抗性)。载体扩增可用于增加表达水平。一般而言，选择标记基因可以与待表达的多核苷酸序列直接连接，或通过共转化将所述选择标记基因引入相同的宿主细胞。

鉴于上述内容，本发明由此进一步提供插入载体中(即由载体包含)的本文所述的核苷酸序列中的一种或多种。具体而言，本发明提供(可复制的)载体，所述载体包含编码本发明的TCR、或其α或β链、或α或β可变结构域、或CDR3α或CDR3β的核苷酸序列，所述核苷酸序列与启动子可操作地连接。

根据如旨在用于TCR表达的宿主细胞，技术人员将能够容易地选择合适的表达载体。合适的表达载体的实例为病毒载体，比如逆转录病毒载体，如MP71载体或逆转录病毒SIN载体；和慢病毒载体或慢病毒SIN载体。包含编码本发明TCR的多核苷酸的病毒载体能够例如感染淋巴细胞，设想所述病毒载体随后表达异源TCR。合适的表达载体的另一个实例是睡美人(Sleeping Beauty)(SB)转座子转座酶DNA质粒系统，SB DNA质粒。本发明的核酸和/或特别是表达构建体也可以通过瞬时RNA转染转移到细胞中。

目前针对天然TCR表达所使用的病毒载体通常将一个载体中的TCR-α和TCR-β链基因与内部核糖体进入位点(IRES)序列或源自猪艾柯病毒(tsechovirus)的2A肽序列连接，从而在转导的细胞内于病毒启动子控制下表达单信使RNA(mRNA)分子。

宿主细胞

本发明进一步提供一种宿主细胞，其包含本文所述的TCR、核酸或载体。

根据本发明，可以使用多种宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖这样的细胞，此类细胞可以是或已经是本文所述的多核苷酸或载体的接受体(recipient)和/或表达(和任选地分泌)本发明的TCR。除非另有明确说明，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示TCR的来源。术语“宿主细胞”还包括“宿主细胞系”。

一般而言，术语“宿主细胞”包括原核或真核细胞，并且还包括但不限于细菌、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞，所述动物细胞比如昆虫细胞和哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞比如鼠、大鼠、猕猴或人细胞。

基于以上内容，本发明由此尤其提供了包含多核苷酸或载体的宿主细胞，所述载体例如包含编码如本文所述的TCR或TCR构建体的核苷酸序列的表达载体。

采用本领域已知的常规方法(如通过转染、转化等)可以将本发明的多核苷酸和/或载体引入宿主细胞。

“转染”是有意将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。一个例子是RNA转染，即将RNA(比如体外转录的RNA，ivtRNA)引入宿主细胞的过程。该术语主要用于真核细胞中的非病毒方法。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。

术语“转化”用于描述核酸分子或多核苷酸(包括载体)向细菌中、也向非动物真核细胞(包括植物细胞)中的非病毒转移。因此，转化是细菌或非动物真核细胞的基因改变，其通过细胞膜从其周围直接摄取并随后并入外源遗传材料(核酸分子)而产生。转化可以通过人工手段实现。为了发生转化，细胞或细菌必须处于感受态的状态，这种状态可作为对比如饥饿和细胞密度的环境条件的时间限制响应而产生。对于原核转化，技术可包括热休克介导的摄取、与完整细胞的细菌原生质体融合、显微注射和电穿孔。对于植物转化的技术包括土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转移(诸如通过根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens))、被快速推进的钨或金微弹、电穿孔、显微注射和聚乙二醇介导的摄取。

基于以上内容，本发明由此进一步提供一种宿主细胞，其包含至少一种本文所述的多核苷酸序列和/或载体。

对于本发明的TCR的表达，可以根据需要选择调节所插入序列的表达和/或修饰并加工基因产物(即RNA和/或蛋白质)的宿主细胞。对基因产物的此类修饰(例如糖基化)和加工(例如剪切)对于所述TCR的功能可能是重要的。不同宿主细胞对基因产物具有特征性和特异性的翻译后加工和修饰机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保对所述产物进行正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于正确加工基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。

本文设想提供(a)用于表达和获得本发明TCR、特别是可溶形式的宿主细胞(“生产宿主细胞”)和(b)表达本发明TCR并具有效应功能的宿主细胞(“效应宿主细胞”)。此类“效应宿主细胞”特别适用于治疗应用，并且设想施用于有此需要的受试者。优选的“效应宿主细胞”包括淋巴细胞，比如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γ/δ-T细胞。

“生产宿主细胞”

细胞

用于表达本发明可溶性TCR的“生产宿主细胞”优选能够表达大量重组蛋白。

可用作“生产宿主细胞”的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)，包括缺失DHFR的CHO细胞(比如DG44和DUXBI 1)、NSO、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、HEK293(人肾)和SP2(小鼠骨髓瘤)细胞。其它示例性宿主细胞系包括但不限于HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-IcIBPT(牛内皮细胞)和RAJI(人淋巴细胞)。通常可从美国组织培养物保藏中心(ATCC)的商业服务或自出版文献中获得宿主细胞系。

非哺乳动物细胞(比如细菌、酵母菌、昆虫或植物细胞)也是容易获得的，并且也可以用作如上所述的“生产宿主细胞”。示例性的细菌宿主细胞包括肠杆菌科，比如大肠杆菌、沙门氏菌；芽孢杆菌科，比如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。其它宿主细胞包括酵母细胞，比如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。昆虫细胞包括但不限于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。

根据前述，可想到的表达系统(即包含如上所述的表达载体的宿主细胞)包括用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，比如细菌(如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用重组酵母表达载体转化的酵母菌(如酵母属、毕赤酵母属)；用重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染或用重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统。通常优选含有重组表达构建体的哺乳动物表达系统，所述重组表达构建提包含源自哺乳动物细胞基因组的启动子(如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子，巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子(MIEP)启动子)。可以自已知的细胞系(如，COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)中选择合适的哺乳动物宿主细胞，然而也可以想到使用淋巴细胞，比如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、γ/δ-T细胞。

根据前述内容，本发明还提供了一种用于产生和获得如本文所述的TCR的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在引起所述TCR表达的条件下温育宿主细胞(即，生产宿主细胞)和(ii)纯化所述TCR。

培养

使携带表达载体的宿主细胞在适用于产生本文提供的TCR、特别是如本文其它地方所述的α链和/或β链的条件下生长，并分析α和/或β链蛋白质合成。对于双链TCR的表达，编码α链和β链的载体可以在宿主细胞中共表达以表达整个分子。

纯化

一旦表达了本发明的TCR，就可以通过本领域已知的任何纯化方法纯化，例如，通过色谱法(如，离子交换色谱法(如羟基磷灰石色谱法)、亲和色谱法、特别是蛋白质A、蛋白质G或凝集素亲和色谱法、尺寸柱(sizing column)色谱法)、离心、差异溶解度、疏水相互作用色谱法，或通过任何其他用于蛋白质纯化的标准技术。基于待回收的TCR的个体特征，技术人员将能够容易地选择合适的纯化方法。

“效应宿主细胞”

如前所述，本发明还提供了“效应宿主细胞”，其包含本发明的核苷酸序列、载体或TCR。使用常规方法修饰所述效应宿主细胞以使其包含编码本发明TCR的核酸序列，并且设想所述效应宿主细胞(特别在细胞表面上)表达本文所述的TCR。出于本发明的目的，“表达本发明的TCR的经修饰的宿主细胞”通常是指例如通过如所附实施例中所述的RNA转染，处理或改变以表达根据本发明的TCR的(效应或生产)宿主细胞。还设想了其它修饰或转染或转导方法，比如本文其它地方描述的那些方法。因此，术语“经修饰的宿主细胞”包括“转染的”、“转导的”和“基因工程化的”宿主细胞，优选地所述宿主细胞表达本发明的TCR。

优选地，此类“(经修饰的)效应宿主细胞”(特别是“(经修饰的)效应淋巴细胞”)能够在TCR与其特异性抗原靶标结合后通过细胞内信号转导介导效应功能。这种效应功能包括例如穿孔素(其在靶细胞膜上产生孔)、颗粒酶(其是在细胞内起作用以引发细胞凋亡的蛋白酶)的释放，Fas配体(其在携带Fas的靶细胞中激活细胞凋亡)的表达和细胞因子优选比如IFN-γ、IL-2和TNF-α的Th1/Tc1细胞因子的释放。因此，设想被工程化以表达本发明的TCR(其能够识别并结合待治疗的受试者中它的抗原靶标)的效应宿主细胞，以实现上述效应功能，由此杀死靶(如癌症)细胞。可以采用例如CTL荧光杀伤试验(CTL，USA)来评价靶细胞的细胞溶解，所述CTL荧光杀伤试验检测在与TCR转染的接受体T细胞共培养期间荧光标记的靶细胞的消失。

鉴于以上内容，效应宿主细胞优选表达功能TCR，即所述功能TCR通常包含本文所述的TCRα和β链，以及信号转导亚基CD3γ、δ、ε、ζ(CD3复合物)。此外，还可能需要表达共受体CD4或CD8。一般而言，淋巴细胞含有参与抗原结合、受体活化和下游信号传导的所需基因(如，Lck、FYN、CD45和/或Zap70)，T细胞特别适合作为效应宿主细胞。然而，本文还设想这样的效应宿主细胞，该效应宿主细胞表达本发明TCR作为“结合结构域”，而不含CD3信号转导亚基和/或上述下游信号分子(即能够识别本文所述的抗原靶标，但不影响CD3介导的功能和/或上述下游信号传导分子)。还设想此类效应细胞能够识别本文所述的抗原靶标，并且任选地能够影响与CD3信号传导和/或上述下游信号传导分子的信号传导无关的其它功能。实例包括表达本发明TCR并且能够如在识别它们的抗原靶标时释放细胞毒性颗粒的NK或NKT细胞。

因此，认为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、γ/δ-T细胞是可用的淋巴细胞效应宿主细胞。这种表达本发明的重组TCR的淋巴细胞在本文中也称为“经修饰的效应淋巴细胞”。然而，技术人员将容易地认识到，通常可以通过本领域已知的重组基因工程方法将导致所需效应功能的TCR信号传导通路的任何组分引入合适的宿主细胞中。

效应宿主细胞特别是淋巴细胞(比如T细胞)可以是自体宿主细胞，所述自体宿主细胞从待治疗的受试者获得并被转化或转导以表达本发明的TCR。通常，TCR的重组表达将通过采用如所附实施例中所述的病毒载体来完成。用于自患者中获得和分离细胞的技术是本领域已知的。

如前所述，特别设想本文提供的效应宿主细胞用于治疗应用。为了提高治疗功效，可能需要进一步对宿主细胞进行遗传修饰。例如，当使用自体CD8+T细胞作为“效应宿主细胞”时，另外的合适的修饰包括内源性TCR、CTLA-4和/或PD-1表达的下调；和/或共刺激分子(如CD28、CD134、CD137)的扩增。本领域已经描述了用于实现上述遗传修饰的手段和方法。

用于宿主细胞的靶向基因组工程的方法是本领域已知的，并且除了采用siRNA的基因敲除之外，还包括使用所谓的“可编程核酸酶”，比如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和源自细菌成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-cas(CRISPR相关)系统的RNA向导的工程核酸酶(RGEN)，特别是在Kim&Kim Nature ReviewsGenetics 15，321-334(2014)中综述的那些。例如，可以采用可编程核酸酶(如TALEN)来切割编码“不需要的”蛋白质(如PD-1、CTLA-4或内源性TCR)的DNA区域，并由此减少它们的表达。当将T细胞用作(效应)宿主细胞时，内源性TCR的下调具有减少内源性与外源性TCRα/β链的不希望的“错配”的优点。

药物组合物/诊断

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含如本文所述的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞作为一种或多种活性剂，和任选的一种或多种药学赋形剂。因此，本文还设想了所述TCR、核酸、载体和宿主细胞在制备药物组合物或药物中的用途。

术语“药物组合物”特别是指适合施用于人的组合物。然而，该术语通常也涵盖适合施用于非人动物的组合物。

所述药物组合物及其组分(即活性剂和任选的赋形剂)优选为药物上可接受的，即在接受体中能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用。本发明的药学上可接受的组合物可以是例如无菌的。具体地，术语“药学上可接受的”可以表示由管理机构或其他公认的药典认可用于动物，更特别是用于人中。

前述活性剂(例如宿主细胞或TCR)优选以治疗有效量存在于所述药物组合物中。“治疗有效量”是指引发期望治疗效果的活性剂的量。可通过在如细胞培养物或实验动物中的标准程序如ED₅₀(在50％群体中治疗有效的剂量)和LD₅₀(对50％群体致死的剂量)确定治疗功效和毒性。治疗和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为ED₅₀/LD₅₀的比率。优选表现出大治疗指数的药物组合物。

剂量

本领域技术人员采用已知技术可确定TCR多核苷酸、载体或宿主细胞的确切剂量。合适的剂量提供足够量的本发明活性剂，并且优选是治疗有效的，即引起期望的治疗效果。

如本领域已知，针对治疗目的(如缓解维持相对于疾病的急性发作)，给药途径、时间和频率，给药制剂的时间和频率，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，疾病状态的严重程度，药物组合，反应敏感性和对治疗的耐受性/响应的调整可能是必要的。例如本文所述的可溶性TCR的合适剂量范围可以使用自细胞培养分析和动物研究中获得的数据来确定，并且所述剂量范围可以包括ED₅₀。通常，根据施用途径，剂量可以在0.1至100000微克之间变化，直至总剂量为约2g。本发明活性剂的示例性剂量的范围为约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约1mg/kg或约0.1mg/kg至约1mg/kg。文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导。应认识到，治疗可能需要单次施用治疗有效剂量或多次施用治疗有效剂量的本发明的活性剂。例如，根据特定组合物的配方、半衰期和清除率，一些药物组合物可以每3至4天施用、每周施用，或每两周施用一次，或在一个月内施用一次。

如前所述，所述药物组合物可任选地包含一种或多种赋形剂和/或另外的活性剂。

赋形剂

术语“赋形剂”包括填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋形剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。

其它的活性剂

本发明进一步提供药物组合物，其包含上述本发明活性剂中的一种或多种(例如宿主细胞或TCR构建体)和一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它活性剂。适用于组合的活性成分的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；和肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如IL-2，趋化因子比如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。

施用

根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

剂型

尤其根据所采用的活性剂(如可溶性TCR)，可将本发明的药物组合物制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程在第22版的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Ed.MaackPublishing Co，Easton，Pa.，2012)中显示，并可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的宿主细胞或可溶性TCR的药物组合物通常以液体形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。

在制备本发明的药物组合物后，可将它们置于合适的容器中并标记用于治疗指定的病症。这种标记例如包括施用量、施用频率和施用方法。

治疗

鉴于以上所述，本发明由此提供本文所述的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞用作药物。

一般而言，所述TCR、核酸、载体和/或宿主细胞可用于疾病或病症的治疗、检测、诊断、预后、预防和/或治疗。所有语法形式的术语“治疗”包括在有此需要的受试者中的治疗性或预防性治疗。“治疗性或预防性治疗”包括旨在完全预防临床和/或病理表现的预防性治疗或旨在改善或缓解临床和/或病理表现的治疗性治疗。因此，术语“治疗”还包括改善或预防疾病。

术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”在本文可互换使用，指需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。一般而言，哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、乳牛等。然而，很容易理解，特别设想将本文提供的TCR、核酸、载体、宿主细胞和药物组合物用于治疗人类受试者，特别是那些HLA-A2阳性受试者。

直接施用

对于治疗，可以将本发明的TCR(特别是本发明的可溶性TCR)、核酸、载体(比如病毒载体)或宿主细胞直接施用于有此需要的受试者。因此，本发明提供TCR、核酸、载体或宿主细胞在检测、诊断、预后、预防和/或治疗癌症的方法中的用途。所述方法可包括以下步骤：(a)提供本发明的(i)TCR、(ii)核酸、(iii)载体、(iv)宿主细胞和/或(v)药物组合物中的一种或多种；和(b)向有此需要的受试者施用(i)-(v)中的一种或多种。任选地，所述方法还可包括癌症治疗的另一个步骤，如辐射或施用一种或多种抗癌剂。

离体治疗

根据本发明的治疗还可以包括以下步骤：(a)提供受试者的样品，所述样品包含淋巴细胞；(b)提供本发明的TCR、核酸、载体、宿主细胞和/或药物组合物中的一种或多种；(c)将步骤(b)中的(i)至(v)中的一种或多种引入步骤(a)的淋巴细胞，并由此获得经修饰的淋巴细胞，(d)向有此需要的受试者或患者施用步骤(c)的所述经修饰的淋巴细胞。

特别设想步骤(a)中提供的淋巴细胞为如前所述的“效应宿主细胞”，并且有利地选自T细胞、NK细胞和/或NKT细胞，尤其是CD8⁺T细胞；并且所述淋巴细胞可以通过本领域已知的常规方法在前述步骤(a′)中从受试者的样品(特别是血液样品)中获得。然而，还可以想到使用优选能够表达本发明的TCR并发挥如本文所述的所需生物效应功能的其它淋巴细胞。此外，通常选择所述淋巴细胞以与受试者的免疫系统相容，即优选所述淋巴细胞不引发免疫原性响应。例如，可以想到使用“通用接受体细胞”，即发挥所需生物效应功能的普遍相容的淋巴细胞，其可在体外生长和扩增。因此，此类细胞的使用将避免(obviate)在步骤(a)中获得和提供受试者自身淋巴细胞的需要。

步骤(c)的离体引入可以通过经由电穿孔将本文所述的核酸或载体引入淋巴细胞或通过用病毒载体感染淋巴细胞来实施，所述病毒载体为比如前面在效应宿主细胞上下文所述的慢病毒或逆转录病毒载体。其它可想到的方法包括使用转染试剂(比如脂质体)或瞬时RNA转染。经由如(逆转录)病毒载体或瞬时RNA转染使抗原特异性TCR基因向(初级)T细胞中的转移代表了用于产生肿瘤相关抗原特异性T细胞的有前途的工具，随后可以将所述T细胞重新引入供体，在供体中这些T细胞特异性地靶向并破坏表达所述抗原的肿瘤细胞。在本发明中，所述肿瘤相关抗原是PRAME_100-108，特别是其HLA-A*02结合形式。

鉴于以上内容，因此，本发明的另一方面是在本文其它地方描述的TCR、核酸序列、载体和/或宿主细胞用于产生经修饰的淋巴细胞的用途。在本文其它地方已经描述了用于将如核酸和载体引入淋巴细胞的手段和方法。

诊断组合物

本发明还提供一种诊断组合物，其包含作为一种或多种诊断剂的本文所述的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞。通常，所述诊断剂将包括用于检测其与其抗原靶标的结合的手段，例如在本发明的TCR构建体的上下文中描述的标记。关于宿主细胞，例如可以想到使用包含在抗原识别时释放的染料或造影剂(而非细胞毒性颗粒)的经修饰的宿主细胞。

用途

本发明设想前述诊断剂用于可在体内或体外完成的检测、诊断和/或预后受试者的癌症的用途。

因此，本发明提供了一种用于体内检测、诊断和/或预后受试者的癌症的诊断组合物，所述组合物包含作为诊断剂的本发明的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞。该方法通常包括(a)向所述受试者施用所述诊断剂和(b)检测所述诊断剂与其抗原靶标的结合。

此外，本发明提供一种体外检测、诊断和/或预后受试者的癌症的方法。根据本发明，还提供了检测受试者中癌症的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供受试者的样品，所述样品包含一个或多个细胞；(b)使所述样品与本发明的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞接触；由此形成复合物，和(c)检测所述复合物。设想所述复合物指示诊断剂与其抗原靶标的结合，并且指示表达所述抗原靶标的(癌)细胞的存在。

在两种方法中，通过采用本领域已知的常规方法可检测诊断剂与其抗原靶标的结合，并且这将特别取决于所用的特定诊断剂。可以与本发明的诊断剂偶联的合适标记在与标记的TCR构建体相关的部分中举例说明。用于产生经修饰的淋巴细胞的用途。

应当特别注意的是，如本文所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数指代，除非上下文另有清楚说明。因此，例如，提到的“试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，而提到的“该方法”包括提到本领域普通技术人员已知的可以改进或替代本文所述方法的等同的步骤和方法。

除非另有说明，在一系列要素前面的术语“至少”应当理解为是指系列中的每个要素。本领域技术人员将会意识到或者能够使用不超过常规试验而确定，许多与本文描述的发明的具体实施方案的等同物。预期这类等同物被本发明涵盖。

术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”以及“所述术语所连接的元素的全部或任何其它组合”。

本文使用的术语“约”或“近似”意为在给出的值或范围的20％内，优选为10％内，更优选为5％内。然而它还包括具体数目，如“约20”包括20。

术语“小于”或“大于”包括具体数目。例如，小于20意为小于或等于20。同样地，多于或大于分别意为多于或等于、或大于或等于。

贯穿本说明书和随后的权利要求，除非上下文另有要求，词语“包括/包含(comprise)”以及变形词语诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数或步骤、或整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。当本文使用时，术语“包括/包含(comprising)”能够被术语“含有(containing)”或“包含(including)”替代，或有时本文使用时会以术语“具有”替代。

本文使用的“由……组成”排除任何未在要求保护的要素中具体规定的元素、步骤或成分。本文使用的“实质上由……组成”并不排除不实质影响权利要求的基础和新颖性特征的材料或步骤。

本文每一个实例中，术语“包括/包含”、“实质上由……组成”和“由……组成”中的任意一个可被其它两个术语中的任意一个替代。

应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、材料、试剂和物质等，因为这些能够改变。本文所使用的术语只用于描述特定实施方案的目的而并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。

本说明书全文所引用的所有出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导书等)，无论在前还是在后，其以全文并入本文。本文的任何内容均不能被解释为承认本发明由于在先发明而不早于这样的公开物。在通过引入方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致时，本说明书将取代任何这样的材料。

通过以下仅出于说明性目的的实施例可以更好的理解本发明及其优势。这些实施例并非意在以任何方式限制本发明的范围。

本发明的特征还在于以下项目：

1、一种T细胞受体(TCR)，其包含：

(i)TCRα链可变区的CDR3，其包含CAVHSTAQAGTALIF(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，

或包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

和/或

(ii)TCRβ链可变区的CDR3，其包含CASSTHRGQTNYGYTF(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，

或包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

2、根据项目1所述的TCR，所述TCR能够结合包含在X1LX2GLDX3LL(SEQ ID NO：31)的氨基酸序列内的表位或其MHC结合形式，优选结合包含在VLDGLDVLL(SEQ ID NO：32)的氨基酸序列内的表位或其MHC结合形式。

3、根据项目1或2中任一项所述的TCR，其包含：

(i)TCRα链可变区，其包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或

(ii)TCRβ链可变区，其包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

4、根据前述项目中任一项所述的TCR，其进一步包含：

(i)TCRα链恒定区，和/或

(ii)TCRβ链恒定区。

5、根据前述项目中任一项所述的TCR，其包含：

(i)TCRα链，其包含选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，

或包含与SEQ ID NO：7、11、9或13具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和/或

(ii)TCRβ链，其包含选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：14的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，

或包含与SEQ ID NO：8、10、12或14具有至少80％同一性、优选至少85％同一性、更优选90％或95％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

6、根据前述项目中任一项所述的TCR，所述TCR选自天然TCR、TCR变体、TCR片段或TCR构建体。

7、根据项目6所述的TCR构建体，其包含至少一个TCRα链和至少一个TCRβ链，它们彼此共价连接以形成TCR异二聚体或多聚体。

8、根据前述项目中任一项所述的TCR，其进一步包含一个或多个任选地选自以下的融合组分：Fc受体；Fc结构域，包括IgA、IgD、IgG、IgE和IgM；细胞因子，包括IL-2或IL-15；毒素；抗体或其抗原结合片段，包括抗-CD3、抗-CD28、抗-CD5、抗-CD16或抗-CD56抗体或其抗原结合片段；CD247(CD3-ζ)、CD28、CD137、CD134结构域，或它们的组合，任选地进一步包含至少一个连接子。

9、根据前述项目中任一项所述的TCR，其包含：

(i)至少一个如项目1至4中任一项所定义的TCRα链；和

(ii)至少一个如项目1至4中任一项所定义的TCRβ链；

(iii)抗体或单链抗体片段(scFv)，其针对淋巴细胞表面上的抗原或表位；

其中所述TCRα-链和TCRβ-链彼此连接并任选地通过连接子与所述抗体或scFv融合。

10、根据项目9所述的TCR，其中所述抗原选自CD3、CD28、CD5、CD16或CD56。

11、根据前述项目中任一项所述的TCR，其进一步包含至少一个标记。

12、根据前述项目中任一项所述的TCR，其是可溶的。

13、一种核酸，其编码根据前述项目中任一项所述的TCR。

14、根据权利要求13所述的核酸，其包含SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、29或30的核酸序列。

15、一种载体，其包含根据项目13或14中任一项所述的核酸。

16、一种宿主细胞，其包含根据项目1至12中任一项所述的TCR、根据项目12或13所述的核酸序列或根据项目14所述的载体。

17、根据项目16所述的宿主细胞，其选自淋巴细胞，所述淋巴细胞包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、γ/δ-T细胞。

18、一种用于获得根据项目1至12中任一项所述的TCR的方法，其包括：

(i)在引起所述TCR表达的条件下温育根据项目17所述的宿主细胞；

(ii)纯化所述TCR。

19、一种药物或诊断组合物，其包含以下中的一种或多种：

(i)根据项目1至12中任一项所述的TCR；

(ii)根据项目13至14中任一项所述的核酸；

(iii)根据项目15所述的载体；和/或

(iv)根据项目16或17中任一项所述的宿主细胞，

和任选的药学上的赋形剂。

20、根据项目1至12中任一项所述的TCR，根据项目13或14所述的核酸，根据项目15所述的载体和/或根据项目16或17所述的宿主细胞，其用作药物。

21、根据项目1至12中任一项所述的TCR，根据项目13或14所述的核酸，根据项目15所述的载体和/或根据项目16或17所述的宿主细胞，其用作药物。其用于癌症的检测、诊断、预后、预防和/或治疗。

22、根据项目21所用的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞，其中所述癌症的预防和/或治疗包括：

(a)提供以下中的一种或多种：

(i)根据项目1至12中任一项所述的TCR；

(ii)根据项目13或14中任一项所述的核酸；

(iii)根据项目15所述的载体；和/或

(iv)根据项目16或17中任一项所述的宿主细胞，

(v)根据项目19所述的药物组合物；和

(b)向有此需要的受试者施用(i)至(v)中的至少一种。

23、根据项目21所用的TCR、核酸、载体和/或宿主细胞，其中所述癌症的预防和/或治疗包括：

(a)提供受试者的样品，所述样品包含淋巴细胞；

(b)提供以下中的一种或多种：

(i)根据项目1至12中任一项所述的TCR；

(ii)根据项目13或14中任一项所述的核酸；

(iii)根据项目15所述的载体；和/或

(iv)根据项目16或17中任一项所述的宿主细胞，

(v)根据项目19所述的药物组合物；

(c)将步骤(b)的(i)至(v)中的一种或多种引入步骤(a)的淋巴细胞，并由此获得经修饰的淋巴细胞，

(d)向有此需要的受试者或患者施用步骤(c)的所述经修饰的淋巴细胞。

24、一种体外检测受试者中癌症的存在的方法，其包括：

(a)提供受试者的样品，所述样品包含一个或多个细胞；

(b)使所述样品与以下接触：

(i)根据项目1至12中任一项所述的TCR；

(ii)根据项目13或14中任一项所述的核酸；

(iii)根据项目15所述的载体；和/或

(iv)根据项目16或17中任一项所述的宿主细胞，

(v)根据项目19所述的药物组合物；

由此形成复合物，和

(c)检测所述复合物，

其中所述复合物的检测指示所述受试者中癌症的存在。

25、根据项目1至12中任一项所述的TCR、根据项目13或14所述的核酸和/或根据项目15所述的载体用于产生经修饰的淋巴细胞的用途。

实施例

缩写和同义词

(m)DC (成熟)树突细胞

ivtRNA 体外转录的RNA

APC 抗原呈递细胞

(X)^pos或(X)⁺ 表达X

VLD或VLD肽 PRAME_100-108

E∶T比率 效应细胞与靶细胞的比率

SLL或SLL肽 肽，无关的，SLLQHLIGL(SEQ ID NO：229)

ALY或ALY肽 肽，无关的，ALYVDSLFFL(SEQ ID NO：230)

ELA或ELA肽 肽，无关的，ELAGIGILTV(SEQ ID NO：231)

[M] 摩尔浓度[mol/L]

PBMC 外周血单核细胞，即外周血中的有核细胞；包含PBL(外周血淋巴细胞)比如T细胞。

实施例1：PRAME-特异性T细胞克隆的分离

本发明人使用体外引发手段来分离具有任何所需MHC限制和抗原特异性的T细胞克隆。引发系统采用成熟的树突细胞(mDC)作为抗原呈递细胞，并采用自体富集CD8⁺的T细胞作为响应细胞。将编码SEQ ID NO：33中提及的全长人PRAME氨基酸序列的体外转录的RNA(ivtRNA)作为特异性抗原的来源。电穿孔进入mDC后，将ivtRNA翻译成全长蛋白质，该蛋白随后将被加工并通过mDC的MHC分子呈递为肽。T细胞与来自相同供体的ivtRNA转染的mDC的体外共培养导致从头诱导了作为响应性TCR的来源的抗原特异性T细胞。抗原特异性T细胞可以通过多种方法富集，并通过有限稀释或基于FACS的单细胞平板接种来克隆。

实施例1.1：采用成熟树突细胞的引发手段

根据以下方案采用自体MHC分子的肽呈递完成具有高亲和力TCR的T细胞的DC引发(图1)：

·HLA-A*02：01/PRAME引发

·采用DC的合适成熟混合物生产mDC 8天

·APC加载：ivtRNA

·通过HLA-A*02：01 PRAME_100-108多聚体的富集

·使用FACS技术的单细胞分选

实施例2：功能/特异性分析

在鉴定了识别所需PAME表位(PRAME_100-108)的候选T细胞克隆(T细胞克隆T4.8-1-29)后，实施了关于功能和特异性的完整表征。分析包括与各种人肿瘤细胞系共培养的分离的T细胞克隆(T细胞克隆T4.8-1-29)的细胞因子分泌模式、克隆特异性识别各种靶细胞的能力、克隆的功能亲合力和对T2及肿瘤细胞的细胞毒性。

实施例2.1：原始T细胞克隆T4.8-1-29的分析

实施例2.1.1：多细胞因子分析

实验方案(experimental layout)：通过加载肽的T2细胞进行刺激

根据以下方案测量细胞因子释放：

·进行

细胞因子分析，检测IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-5、IL-10、IL-6、IL12p70、IL-4和IL-1β

·刺激细胞：加载了饱和量(10^-5M)的PRAME_100-108肽(“VLD肽”)或无关的PRAME_300-309(即ALYVDSLFFL肽(“ALY肽”，SEQ ID NO：230))的T2细胞(HLA-A*02^pos)

·24h后收集T细胞共培养物(具有加载相关或无关肽的T2细胞)的上清液，然后采用

细胞因子分析测量。

结果

·候选克隆分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α(Th1/Tc1细胞因子)在背景水平以上。细胞因子表达模式反映了与良好的抗肿瘤效应功能相关的Th1表型(图2)。

·未检测到(n.d.)IL-5和IL-13(Th2/Tc2细胞因子)分泌。

实施例2.2：肿瘤细胞的识别

实验方案：通过肿瘤细胞系进行刺激

·用一组人肿瘤细胞系刺激后，采用IFN-γELISA评价细胞因子分泌(通过NanoString

分析检测PRAME表达的状态)。

·在将T细胞克隆T4.8-1-29与K562-A2、Mel-624.38、Colo-678、647-V和SuDHL-6(全部为HLA-A^*02^POS)共培养达24小时后收获上清液。采用标准ELISA评价特异性IFN-γ分泌。

·靶细胞：

ο K562-A2(HLA-A^*02^pos，PRAME^pos)

ο Mel-624.38(HLA-A^*02^pos，PRAME^pos)

ο Colo-678(HLA-A^*02^pos，PRAME^neg)

ο 647-V(HLA-A^*02^pos，PRAME^neg)

ο SuDHL-6(HLA-A^*02^pos，PRAME^neg)

结果

·在与PRAME^pos、HLA-A^*02^pos肿瘤细胞系K562-A2和Mel-624.38(阳性对照：肽冲击(peptide-pulsed)的T2细胞)共培养中，T细胞克隆T4.8-1-29显示高IFN-γ分泌。

·T细胞克隆T4.8未识别PRAME^neg、HLA-A*02^pos肿瘤细胞系(阴性对照；n.d.，未检测到)。

·自限性T细胞克隆T4.8-1-29仅识别了表达HLA-A^*02和PRAME的肿瘤细胞系，这表明了抗原特异性(图3)。

实施例2.3：功能亲合力

实验方案：采用肽冲击的T2细胞进行刺激

·在将克隆T4.8-1-29与加载肽的T2细胞共培养后，通过检测IFN-γ分泌来测量对于PRAME_100-108(VLD)肽识别的功能性T细胞亲合力。

·靶细胞：加载了滴定量的外源PRAME_100-108(VLD)肽(10^-5至10^-12M)的T2细胞(HLA-A^*02^pos，PRAME^neg)。

·效应与靶的比率(E∶T)为1∶1。

·相对IFN-γ释放以最大释放百分比显示。限定功能亲合力的半数最大IFN-γ分泌以虚线表示。

·共培养～24小时后收获培养物上清液，并通过标准ELISA评价。

结果

·克隆T4.8-1-29在约1x10^-9至1x10^-10mol/L[M]浓度的PRAME_100-108肽之间显示了半数最大IFN-γ分泌(两个独立实验的平均值)，这位于病毒特异性T细胞的生理范围内，并且据报道代表了有效抗肿瘤功效所需的功能亲合力(Aleksic，M等，Eur.J.Immunol.；42(12)：3174-3179)。

·→TCR T4.8-1-29：～1x10^-9mol/L[M](图4)。

实施例2.3：转基因T细胞受体的分析：TCR T4.8-1-29

已经识别了PRAME^100-108特异性T细胞克隆T4.8-1-29，下一步涉及分离编码相应TCR链的DNA序列信息，将克隆的TCR转移至适当的接受体T细胞并随后进行TCR工程化的T细胞的功能分析。

实施例2.3.1：T细胞受体序列分析

通过下一代测序技术(NGS-TCRseq)在内部分析原始克隆T4.8-1-29TCRα和β链的DNA序列。将相应的TCRα和βDNA序列通过DNA基因合成(GeneArt，Regensburg)重建并克隆至用于ivtRNA生产的pGEM载体骨架以及用于稳定转导的逆转录病毒载体。

实施例2.3.2：转基因TCR的功能验证

将T细胞克隆T4.8-1-29的TCR序列转移到接受体细胞中

将原始T细胞克隆T4.8-1-29的TCR DNA序列或者体外转录为编码完整T4.8-1-29TCR序列的RNA以用于通过电穿孔瞬时转染接受体效应细胞，或者通过使用逆转录病毒载体构建体(其也编码完整的TCR T4.8-1-29序列)用于稳定转导效应细胞。

实验方案：通过肽冲击的T2细胞进行刺激

·采用标准ELISA测量与PRAME_100-108(VLD)肽冲击的T2细胞共培养的TCR T4.8-1-29-转染的接受体T细胞(CD8^pos接受体T细胞克隆+T4.8-1-29ivtRNA)的特异性IFN-γ分泌。

·靶细胞：以10^-5M VLD(相关)或“ELA肽”(无关)肽(ELAGIGILTV，MelanA，SEQ IDNO：231)冲击的T2细胞(HLA-A^*02^pos，PRAME^neg)。

结果

·TCR T4.8-1-29转染的接受体T细胞显示出对加载了相关肽的T2细胞的良好识别，但是对加载了无关肽的T2细胞无识别。

·T4.8-1-29TCRα和β链DNA序列被正确重建并作为转基因显示出了良好的功能(图5)。

实施例2.4：自身肽的识别的分析

实验方案：在与加载肽的T2细胞共培养时，表达TCR T4.8-1-29的富集CD8⁺的PBMC的INF-γ分泌

采用ELISA分析测定了与T2靶细胞(HLA-A*02^pos，PRAME^neg)共培养的表达克隆T4.8-1-29的T细胞受体的富集CD8⁺的PBMC的INF-γ分泌，所述T2靶细胞加载了10^-5MPRAME_100-108VLD肽或自HLA-A*02洗脱的普遍存在的自身肽(131种自身肽)。

结果

若与加载了普遍存在的自身肽的T2细胞(HLA-A*02^pos，PRAME^neg)(阳性对照：PRAME100-108加载的T2细胞)共培养，则表达克隆T4.8-1-29的T细胞受体的富集CD8+的PBMC显示无INF-γ分泌，这反应了TCR 4.8-1-29的高特异性(图6)。

实施例2.5：细胞毒性分析

实验方案：肽冲击的T2细胞的裂解

·通过使用TVA^TM荧光杀伤分析(CTL，Cellular Technology Limited，USA)测量PRAM_100-108(VLD)肽冲击的T2细胞的裂解，所述TVA^TM荧光杀伤分析测定与表达T4.8-1-29TCR的富集CD8的PBMC共培养期间荧光标记的靶细胞的消失。

·靶细胞：用以分级的E∶T比率与表达TCR T4.8-1-29的PBMC共培养的10^-5MPRAME_100-108VLD(相关)或SLL(SLLQHLIGL(SEQ ID NO：229)，PRAME，无关)肽冲击的T2细胞(HLA-A*02^pos，PRAME^neg)。

结果

·即使在低E∶T比率下，表达T4.8-1-29的PBMC仍显示加载相关的(VLD)肽的T2细胞的有效裂解。

·在任何E∶T比率下，加载无关SLL肽(PRAME)的T2细胞未裂解(阴性对照)(图7)。

实验方案：肿瘤细胞的裂解

·使用TVA^TM荧光杀伤分析(CTL，Cellular Technology Limited，USA)分析针对肿瘤细胞的细胞毒性活性，所述TVA^TM荧光杀伤分析检测与表达T细胞克隆T4.8-1-29的转基因TCR的PBMC共培养期间荧光标记的靶细胞的消失。

靶细胞：将人肿瘤细胞系K562用于实验。使用编码人HLA-A*02：01的ivtRNA和/或编码人PRAME的ivtRNA转染K562细胞。人K562表现出内源性PRAME表达(由Nanonstring测定并在文献中报道)。此外，通过用编码人PRAME的ivtRNA转染K562或通过PRAME_100-108VLD肽的外源加载来增加PRAME表达。

o用编码HLA-A*02：01的ivtRNA转染并加载PRAME_100-108(VLD)肽的K562：K562-(PRAME⁺/A2^-)+A2-ivtRNA+VLD肽(图8A)

o用编码PRAME的ivtRNA转导的K562：K562-(PRAME⁺/A2^-)+PRAME-ivtRNA(图8B)

o用编码PRAME的ivtRNA和编码HLA-A*02的ivtRNA转染的K562：K562-(PRAME⁺/A2^-)+A2-ivtRNA(图8C)

o用编码HLA-A*02ivtRNA的ivtRNA转染的K562：K562-(PRAME⁺/A2^-)+A2-ivtRNA+PRAME ivtRNA(图8D)

·以分级的E∶T比率将肿瘤细胞与表达TCR T4.8-1-29的PBMC共培养。

结果

用PRAME ivtRNA的转染以及表达HLA-A*02：01的K562细胞的VLD肽加载增加了通过表达转基因TCR T4.8-1-29的PBMC的特异性裂解(图8A-D)。

实施例2.5：通过表达TCR T4.8-1-29的富集CD8⁺的PBMC识别肿瘤细胞

实验方案：通过肿瘤细胞系进行刺激

·在用一组人肿瘤细胞系刺激后，采用IFN-γELISA评价细胞因子分泌(通过NanoString

分析检测PRAME表达的状态)。

·在将表达T细胞受体T4.8-1-29的富集CD8⁺的PBMC与K562-B35、K562-A2、Mel-624.38、Colo-678和SKMEL23共培养达24小时后收获上清液。使用标准ELISA评价特异性IFN-γ分泌。

·靶细胞：

ο K562-B35(HLA-A*02^neg，PRAME^pos)

ο K562-A2(HLA-A*02^neg，PRAME^pos)

ο加载了VLD肽的K562-A2(HLA-A*02^neg，PRAME^pos)

ο Mel-624.38(HLA-A*02^neg，PRAME^pos)

ο SkMEL23(HLA-A*02^neg，PRAME^pos)

结果

·在与PRAME^pos、HLA-A*02^pos肿瘤细胞系K562-A2、另外加载了VLD肽的K562-A2共培养时，表达T细胞受体T4.8-1-29的富集CD8+的PBMC显示高IFN-γ分泌，在与PRAME^pos、HLA-A*02^posMel-624.38和SkMEL23共培养时显示中等IFN-γ分泌。

·具有HLA-B*35表达的PRAME^posK562未诱导IFN-γ分泌，这证实了TCR T4.8-1-29的HLA-A*02限制性(图10)。

实施例2.6：采用TCR T4.8-1-29的PBMC的转导

·用含有TCR T4.8-1-29构建体的质粒转导健康供体的富集CD8的PBMC。为了分析TCR-转导效率，在未转导的和TCR T4.8-1-29转导的PBMC的表面染色后进行FACS分析。用对CD8和TCRβ链的TCR可变区(TRBV9)特异性的抗体给细胞染色。在对照效应细胞群中，存在8％内源性表达TRBV9的T细胞，而在转导后，存在60％表达TRBV9的T细胞。这表明转导效率大于50％(图11)。

实施例2.7：T细胞克隆T4.8-1-29和用TCR T4.8-1-29转导的PBMC对PRAME_100-108(VLD)肽的功能T细胞亲合力

·通过在将T细胞克隆T4.8-1-29(实体曲线)或用T4.8-1-29转导的效应PBMC(虚线曲线)与加载肽的T2细胞共培养后检测IFN-γ分泌来测量对PRAME_100-108(VLD)肽识别的功能T细胞亲合力。用浓度范围为10^-5M至10^-12M的滴定量的肽加载T2细胞。在共培养～24h后，收获共培养上清液并通过标准ELISA评价，相对IFN-γ释放以最大释放的百分比表示。用虚线表示定义功能亲合力的半数最大IFN-γ-分泌(EC50)。原始T细胞克隆与转基因TCR的功能亲合力高度相似(图12)。

实施例2.8：用TCR T4.8-1-29转导的PBMC和未转导的对照PBMC与不同靶细胞(OPM-2和U937)的抗原特异性分析

·为了分析抗原特异性，将T4.8-1-29-转导的效应PBMC和未转导的对照PBMC与不同的靶细胞共培养。对肿瘤细胞系OPM-2和U937(HLA-A2阴性和PRAME阴性)在未经修饰或用编码HLA-A2的ivtRNA转染的情况下进行测试。此外，还在用编码HLA-A2的ivtRNA和PRAME或HLA-A2和无关抗原的组合转染这些细胞后进行了测试。作为对照，还将效应物与加载了PRAME_VLD肽(10^-5M)的T2细胞或加载了无关的PRAME_SLL肽(10^-5M)的T2细胞一起培养。在共培养24小时后，收获上清液，通过标准ELISA测量IFN-γ的分泌量。在与加载VLD的T2细胞共培养的TCR转导的PBMC中测量到大量IFN-γ。用HLA-A2和抗原PRAME转染的两种肿瘤细胞系均诱导通过TCR转导的PBMC的IFN-γ分泌。因此，只有将HLA-A2表达为需要的MHC-限制性元件并与抗原PRAME组合的肿瘤细胞才被识别并导致表达T4.8-1-29的PBMC的活化(图13)。

实施例2.9：用TCR T4.8-1-29转导的PBMC和未转导的对照PBMC与不同靶细胞(K562、K562_A2和Mel 624.38)的抗原特异性分析

·为了分析抗原特异性，将T4.8-1-29-转导的效应PBMC和未转导的对照PBMC与不同的靶细胞系共培养。对肿瘤细胞系K562(HLA-A2-阴性和PRAME-阳性)以及K562_A2和Mel624.38(HLA-A-阳性和PRAME-阳性)和647-V(HLA-A2-阳性和PRAME-阴性)进行测试。作为对照，还将效应物与加载了PRAME_VLD肽(10^-5M)或加载了无关的PRAME_SLL肽(10^-5M)的T2细胞一起培养。在共培养24小时后，收获上清液，通过标准ELISA测量IFN-γ的分泌量。在与加载VLD的T2细胞共培养的TCR转导的PBMC中测量到大量IFN-γ。

测量的IFN-γ值表明，加载了VLD-肽的T2细胞和肿瘤细胞系K562_A2和Mel624.38活化TCR T4.8-1-29转导的PBMC。因此，转导的PBMC仅识别HLA-A2阳性、内源性表达PRAME的肿瘤细胞系，而HLA-A2或抗原的缺失阻止了活化(图14)。

实施例2.10：分析T4.8-1-29转导的效应物对肿瘤细胞的细胞毒活性

·使用IncuCyte

-活细胞分析系统(Essenbiosciences)分析T4.8-1-29转导的效应物对肿瘤细胞的细胞毒活性，该系统是一种基于显微镜的系统，允许对细胞进行活成像。

将TCR T4.8-1-29转导的和未转导的效应PBMC与HLA-A2-阳性、PRAME-阳性黑色素瘤细胞系Mel624.38共培养。将黑色素瘤细胞接种在96孔板中，达到～60％的汇合时，加入效应细胞。为了观察细胞死亡，还加入红色Annexin V-染料，每天拍摄图像达4天。与未转导的效应物(上排)共培养的黑色素瘤细胞系Mel624.38随时间扩增并且只能看到罕见的死细胞事件，而TCR转导的效应物阻止肿瘤细胞向外生长并导致形成具有大量死细胞的细胞簇。这表明，表达T4.8-1-29的效应细胞可以有效地裂解表达PRAME的肿瘤细胞并能阻止肿瘤细胞向外生长达数天。

实施例2.11：表达T4.8-1-29的PBMC的安全性情况分析

·为了分析表达T4.8-1-29的PBMC的安全性情况，必须排除对健康人组织的识别。因此，将来自两个不同供体的T4.8-1-29转导的PBMC与源自HLA-A2阳性供体的健康组织的细胞共培养。作为实例，将转导的以及未转导的PBMC与人肾毛细血管上皮细胞(HRCEpC)共培养。作为对照，HRCEp细胞另外加载了VLD-肽(10^-5M)。共培养24小时后，收获上清液，通过标准ELISA测量IFN-γ的分泌量。TCR-转导的PBMC仅在与加载肽的靶细胞共培养时被活化，而没有识别未经修饰的HRCEp细胞。

Claims (25)

1.一种包含TCR α链和TCR β链的T细胞受体(TCR)，其包含：

(i) TCR α链可变区的CDR1以及TCR β链可变区的CDR1，其中所述TCR α链可变区的CDR1的氨基酸序列为VSGLRG (SEQ ID NO: 5)，和所述TCR β链可变区的CDR1的氨基酸序列为SGDLS (SEQ ID NO. 6)；

(ii) TCR α链可变区的CDR2以及TCR β链可变区的CDR2，其中所述TCR α链可变区的CDR2的氨基酸序列为LYSAGEE (SEQ ID NO: 3)，和其中所述TCR β链可变区的CDR2的氨基序列为YYNGEE (SEQ ID NO. 4)；和

(iii) TCR α链可变区的CDR3以及TCR β链可变区的CDR3，其中所述TCR α链可变区的CDR3的氨基酸序列为CAVHSTAQAGTALIF (SEQ ID NO: 1)，和所述TCR β链可变区的CDR3的氨基酸序列为CASSTHRGQTNYGYTF (SEQ ID NO. 2)；

所述TCR能够结合包含在VLDGLDVLL (SEQ ID NO: 32)的氨基酸序列内的表位或其MHC结合形式。

2.根据权利要求1所述的TCR，其包含：

(i) TCR α链可变区，其中所述TCR α链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和

(ii) TCR β链可变区，其中所述TCR β链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的TCR，其包含：

(i) TCR α链，其中所述TCR α链的氨基酸序列包含选自SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，

和

(ii) TCR β链，其中所述TCR β链包含选自SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO: 14的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1所述的TCR，所述TCR选自天然TCR或TCR构建体。

5.根据权利要求4所述的TCR，所述TCR选自TCR变体或TCR片段。

6.根据权利要求4所述的TCR构建体，其包含至少一个TCR α链和至少一个TCR β链，它们彼此共价连接以形成TCR异二聚体或多聚体。

7.根据权利要求1所述的TCR，其进一步包含一个或多个任选地选自以下的融合组分：Fc受体；Fc结构域，包括IgA、IgD、IgG、IgE和IgM；细胞因子，包括IL-2或IL-15；毒素；抗体或其抗原结合片段，包括抗-CD3、抗-CD28、抗-CD5、抗-CD16或抗-CD56抗体或其抗原结合片段；CD247 (CD3-ζ)、CD28、CD137、CD134结构域，或它们的组合。

8.根据权利要求1所述的TCR，其进一步包含至少一个连接子。

9.根据权利要求1所述的TCR，其包含：

(i) 至少一个TCR α链，所述TCR α链包含TCR α链可变区，其中所述TCR α链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(ii) 至少一个TCR β链，所述TCR β链包含TCR β链可变区，其中所述TCR β链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；和

(iii) 抗体或单链抗体片段(scFv)，其针对淋巴细胞表面上的抗原或表位；

其中所述TCR α-链和TCR β-链彼此连接并任选地通过连接子与所述抗体或scFv融合。

10.根据权利要求9所述的TCR，其中所述抗原选自CD3、CD28、CD5、CD16或CD56。

11.根据权利要求1所述的TCR，其进一步包含至少一个标记。

12.根据权利要求1所述的TCR，其是可溶的。

13.一种核酸，其编码权利要求1至12中任一项所述的TCR。

14.根据权利要求13所述的核酸，其包含SEQ ID NO: 23、24、25、26、27、28、29或30的核酸序列。

15.一种载体，其包含根据权利要求13或14所述的核酸。

16.一种宿主细胞，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的TCR、根据权利要求13或14所述的核酸序列或根据权利要求15所述的载体。

17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其选自淋巴细胞，其中所述淋巴细胞选自细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、CD4+ T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T (NKT)细胞和γ/δ-T细胞。

18.根据权利要求16所述的宿主细胞，其选自淋巴细胞，其中所述淋巴细胞为CD8+ T细胞。

19.一种用于获得根据权利要求1至12中任一项所述的TCR的方法，其包括：

(i) 在引起所述TCR表达的条件下温育根据权利要求16或17所述的宿主细胞；

(ii) 纯化所述TCR。

20.一种药物或诊断组合物，其包含以下中的一种或多种：

(i) 根据权利要求1至12中任一项所述的TCR；

(ii) 根据权利要求13或14所述的核酸；

(iii) 根据权利要求15所述的载体；和/或

(iv) 根据权利要求16至18中任一项所述的宿主细胞，

和任选的药学上的赋形剂。

21.根据权利要求1至12中任一项所述的TCR，根据权利要求13或14所述的核酸，根据权利要求15所述的载体和/或根据权利要求16至18中任一项所述的宿主细胞在制备用于癌症的检测、诊断、预后、预防和/或治疗的药物中的用途。

22.根据权利要求21所述的用途，其中所述癌症的预防和/或治疗包括：

(a) 提供以下中的一种或多种：

(i) 根据权利要求1至12中任一项所述的TCR；

(ii) 根据权利要求13或14所述的核酸；

(iii) 根据权利要求15所述的载体；

(iv) 根据权利要求16至18中任一项所述的宿主细胞，和/或

(v) 根据权利要求20所述的药物组合物；和

(b) 向有此需要的受试者施用(i)至(v)中的至少一种。

23.根据权利要求21所述的用途，其中所述癌症的预防和/或治疗包括：

(a) 提供受试者的样品，所述样品包含淋巴细胞；

(b) 提供以下中的一种或多种：

(i) 根据权利要求1至12中任一项所述的TCR；

(ii) 根据权利要求13或14所述的核酸；

(iii) 根据权利要求15所述的载体；

(iv) 根据权利要求16至18中任一项所述的宿主细胞，和/或

(v) 根据权利要求20所述的药物组合物；

(c) 将步骤(b)的(i)至(v)中的一种或多种引入步骤(a)的淋巴细胞，并由此获得经修饰的淋巴细胞，

(d) 向有此需要的受试者或患者施用步骤(c)的所述经修饰的淋巴细胞。

24.根据权利要求1至12中任一项所述的TCR，根据权利要求16至18中任一项所述的宿主细胞，和/或根据权利要求20所述的药物组合物在制备用于在体外检测受试者中癌症的存在的药物中的用途。

25.根据权利要求1至12中任一项所述的TCR、根据权利要求13或14所述的核酸和/或根据权利要求15所述的载体在制备用于产生经修饰的淋巴细胞的制剂中的用途。

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