DE60124954T2 - Mu-1, ein mitglied der cytokine rezeptor familie - Google Patents

Mu-1, ein mitglied der cytokine rezeptor familie Download PDF

Info

Publication number
DE60124954T2
DE60124954T2 DE60124954T DE60124954T DE60124954T2 DE 60124954 T2 DE60124954 T2 DE 60124954T2 DE 60124954 T DE60124954 T DE 60124954T DE 60124954 T DE60124954 T DE 60124954T DE 60124954 T2 DE60124954 T2 DE 60124954T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protein
seq
cells
stat
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60124954T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60124954D1 (de
Inventor
D. Debra Medford DONALDSON
J. Michelle Brighton UNGER
A. Deborah Melrose YOUNG
J. Matthew Hudson WHITTERS
Leslie Sudbury LOWE
Mary Natick COLLINS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genetics Institute LLC
Original Assignee
Genetics Institute LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genetics Institute LLC filed Critical Genetics Institute LLC
Application granted granted Critical
Publication of DE60124954D1 publication Critical patent/DE60124954D1/de
Publication of DE60124954T2 publication Critical patent/DE60124954T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Mitglieder der Säuger-Cytokinrezeptorfamilie von Proteinen (einschließlich, ohne Beschränkung, der humanen und murinen Rezeptorproteine), Fragmente davon, rekombinante Polynukleotide und Zellen, die sich zur Expression dieser Proteine eignen, und Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die Immunstörungen behandeln können, umfassend das Untersuchen der Fähigkeit der Verbindungen, die Wechselwirkung der Proteine mit einem STAT-Molekül zu modulieren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Man hat eine Reihe als Hämatopoetine bekannter regulatorischer Moleküle identifiziert, die an der Entwicklung und Proliferation verschiedener hämatopoetischer oder Blutzellen beteiligt sind. Die meisten Hämatopoetine zeigen bestimmte biologische Aktivitäten, indem sie mit einem Rezeptor auf der Oberfläche von Zielzellen in Wechselwirkung treten. Cytokinrezeptoren bestehen in der Regel aus einer, zwei oder drei Ketten. Viele Cytokinrezeptoren und einige Cytokine, wie IL-12 p40, sind Mitglieder der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie von Proteinen. Die Identifikation neuer Mitglieder der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie kann zur Regulation der Hämatopoese, zur Regulation von Immunantworten und zur Identifizierung weiterer Mitglieder der Hämatopoetin-Superfamilie, einschließlich Cytokinen und Rezeptoren, nützlich sein.
  • Es wäre wünschenswert, die DNA- und Proteinsequenz bisher unbekannter Mitglieder der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie zu identifizieren und zu bestimmen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung offenbart, die in der Lage ist, eine Immunerkrankung zu behandeln, umfassend das Prüfen der Fähigkeit der Verbindung, die Interaktion eines MU-1-Polypeptids mit einem STAT-Molekül zu modulieren, wobei dadurch eine Verbindung identifiziert wird, die in der Lage ist, eine Immunerkrankung zu behandeln. Der STAT-Signalweg kann zum Beispiel ein STAT-3-Signalweg oder ein STAT-5-Signalweg sein. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Modulators der MU-1-Aktivität bereit, umfassend das in-Kontakt-Bringen einer Zelle, die ein MU-1-Protein gemäß SEQ ID Nr.: 2 oder 10 oder einen Teil davon exprimiert, der in der Lage ist, mit STAT-Molekülen zu interagieren, mit einer Testverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, die Interaktion des MU-1-Proteins oder des Teils davon mit einem STAT-Molekül zu modulieren. Das STAT-Molekül kann zum Beispiel STAT 3 oder STAT 5 sein. Weiterhin kann bei diesem Verfahren das MU-1-Protein beispielsweise SEQ ID Nr.: 9 entsprechen und kann in der Zelle als Fusion der intrazellulären Domäne von MU-1 und der extrazellulären Domäne des humanen BPO-Rezeptors exprimiert werden.
  • Ebenfalls offenbart sind Polynukleotide, die die MU-1-Kette der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie codieren, einschließlich, ohne Beschränkung, derjenigen aus der murinen und der humanen Quelle.
  • Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst ein isoliertes Polynukleotid eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1;
    • (b) der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1 von Nukleotid 238 bis Nukleotid 1852;
    • (c) der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1 von Nukleotid 301 bis Nukleotid 1852;
    • (d) der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1 von Nukleotid 301 bis Nukleotid 945;
    • (e) einer Nukleotidsequenz, die sich von der unter einem der Punkte (a)-(d) angegebenen Nukleotidsequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
    • (f) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem unter einem der Punkte (a)-(d) angegebenen Nukleotid hybridisieren kann;
    • (g) einer Nukleotidsequenz, die ein Spezieshomolog der Sequenz der SEQ ID Nr.: 2 codiert; und
    • (h) einer allelischen Variante der unter einem der Punkte (a)-(d) angegebenen Nukleotidsequenz.
  • Vorzugsweise codiert die Nukleotidsequenz ein Protein mit einer biologischen Aktivität der MU-1-Kette der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie. Die Nukleotidsequenz kann betriebsfähig mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden sein.
  • Ebenfalls offenbart sind isolierte Polynukleotide, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Peptid oder Protein codiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2;
    • (b) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 von Aminosäuren 22 bis 538;
    • (c) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 von Aminosäuren 22 bis 236;
    • (d) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 von Aminosäuren 1 bis 236; und
    • (e) Fragmenten von (a)-(d) mit der biologischen Aktivität der MU-1-Kette der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie.
  • Ferner wird ein isoliertes Polynukleotid bereitgestellt, umfassend eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 9;
    • (b) einer Nukleotidsequenz, die sich von der unter (a) angegebenen Nukleotidsequenz infolge der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
    • (c) einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit dem unter (a) angegebenen Nukleotid hybridisieren kann;
    • (d) einer allelischen Variante der unter (a) angegebenen Nukleotidsequenz.
  • Weiterhin offenbart sind isolierte Polynukleotide, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Peptid oder Protein codiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 10;
    • (b) Fragmenten von (a) mit der biologischen Aktivität der MU-1-Kette der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie. Wirtszellen, vorzugsweise Säugerzellen, die mit den Polynukleotiden transformiert sind, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Bei anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines MU-1-Proteins bereit. Das Verfahren umfasst:
    • (a) das Züchten einer Kultur der erfindungsgemäßen Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium; und
    • (b) das Reinigen des humanen MU-1-Proteins aus der Kultur.
  • Proteine, die gemäß diesen Verfahren hergestellt werden, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein isoliertes MU-1-Protein bereit, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2;
    • (b) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 von Aminosäuren 22 bis 538;
    • (c) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 von Aminosäuren 22 bis 236;
    • (d) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 von Aminosäuren 1 bis 236; und
    • (e) Fragmenten von (a)-(d) mit der biologischen Aktivität der MU-1-Kette der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie.
  • Ebenfalls offenbart ist ein isoliertes MU-1-Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 10;
    • (b) Fragmenten von (a) mit der biologischen Aktivität der MU-1-Kette der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie.
  • Die Aminosäuresequenz von murinem MU-1 (SEQ ID Nr.: 10) ist zu etwa 65% identisch zu der Aminosäuresequenz von humanem MU-1.
  • Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die angegebene Aminosäuresequenz Teil eines Fusionsproteins (mit einer zusätzlichen, nicht von MU-1 stammenden Aminosäuresequenz). Bevorzugte Fusionsproteine umfassen ein Antikörperfragment, wie ein Fc-Fragment.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein MU-1-Protein und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Ebenfalls offenbart sind Zusammensetzungen, die einen Antikörper umfassen, der spezifisch mit einem erfindungsgemäßen Protein reagiert.
  • Ein MU-1-Nukleinsäuremolekül, wie hier beschrieben, ist zu mindestens 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % oder mehr identisch zu der Nukleotidsequenz (z.B. zu der gesamten Länge der Nukleotidsequenz), die in SEQ ID Nr.: 1 oder 9 dargestellt ist.
  • Vorzugsweise besteht das Nukleinsäuremolekül aus der in SEQ ID Nr.: 1 oder 9 dargestellten Nukleotidsequenz. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass das Nukleinsäuremolekül ein Fragment von mindestens 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800 oder mehr Nukleotiden (z.B. aufeinander folgenden Nukleotiden) der Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr.: 1 oder 9 oder eines Komplements davon enthält.
  • Vorzugsweise hat das Mitglied der MU-1-Proteinfamilie eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens etwa 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % oder mehr identisch zu der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 oder 10 ist.
  • Ebenfalls offenbart sind Fragmente des Proteins mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 oder 10, wobei das Fragment mindestens 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100 Aminosäuren (z.B. aufeinander folgende Aminosäuren) der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr.: 2 oder 10 umfasst.
  • Unter einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines MU-1-Nukleinsäuremoleküls, -Proteins oder -Polypeptids in einer biologischen Probe durch in-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, ein MU-1-Nukleinsäuremolekül, -Protein oder -Polypeptid nachzuweisen, so dass das Vorhandensein eines MU-1-Nukleinsäuremoleküls, -Proteins oder -Polypeptids in der biologischen Probe nachgewiesen wird, bereitgestellt.
  • Unter einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von MU-1-Aktivität in einer biologischen Probe durch in-Kontakt-Bringen der biologischen Probe mit einem Mittel, das in der Lage ist, einen Indikator für MU-1-Aktivität nachzuweisen, so dass das Vorhandensein von MU-1-Aktivität in der biologischen Probe nachgewiesen wird, bereitgestellt.
  • Unter einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Modulieren von MU-1-Aktivität offenbart, umfassend das in-Kontakt-Bringen einer Zelle, die in der Lage ist, MU-1 zu exprimieren, mit einem Mittel, das die MU-1-Aktivität moduliert, so dass die MU-1-Aktivität in der Zelle moduliert wird. Bei einer anderen Ausführungsform hemmt das Mittel die MU-1-Aktivität. Bei einer anderen Ausführungsform stimuliert das Mittel die MU-1-Aktivität. Bei einer Ausführungsform ist das Mittel ein Antikörper, der spezifisch an ein MU-1-Protein bindet. Bei einer anderen Ausführungsform moduliert das Mittel die Expression von MU-1, indem es die Transkription eines MU-1-Gens oder die Translation einer MU-1-mRNA moduliert. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist das Mittel ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz, die zu dem codierenden Strang einer MU-1-mRNA oder eines MU-1-Gens gegensinnig ist.
  • Die hier offenbarten Verfahren können zur Behandlung eines Individuums mit einer Erkrankung, die durch aberrante oder ungewünschte MU-1-Protein- oder Nukleinsäureexpression oder -Aktivität gekennzeichnet ist, (d.h. einer mit MU-1 zusammenhängenden Erkrankung) durch Verabreichen eines Mittels, das ein MU-1- Modulator ist, an das Individuum verwendet werden. Bei einer Ausführungsform ist der MU-1-Modulator ein MU-1-Protein. Bei einer anderen Ausführungsform ist der MU-1-Modulator ein MU-1-Nukleinsäuremolekül. Bei noch einer anderen Ausführungsform ist der MU-1-Modulator ein Peptid, Peptidomimetikum, Antikörper oder ein anderes kleines Molekül.
  • Ebenfalls bereitgestellt werden diagnostische Assays zur Identifizierung des Vorhandenseins oder Fehlens einer genetischen Veränderung, gekennzeichnet durch mindestens eines aus einer (i) aberranten Modifikation oder Mutation eines Gens, das ein MU-1-Protein codiert; (ii) falschen Regulation des MU-1-Gens; und (iii) aberranten posttranslationalen Modifikation eines MU-1-Proteins, wobei eine Wildtypform des Gens ein Protein mit MU-1-Aktivität codiert.
  • Unter einem anderen Aspekt werden Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereitgestellt, die an ein MU-1-Protein bindet oder dessen Aktivität moduliert, indem eine Indikatorzusammensetzung bereitgestellt wird, die ein MU-1-Protein mit MU-1-Aktivität umfasst, die Indikatorzusammensetzung mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird und die Wirkung der Testverbindung auf die MU-1-Aktivität (z.B. die Modulation der STAT-Phosphorylierung, z.B. der STAT-3- oder STAT-5-Phosphorylierung) in der Indikatorzusammensetzung bestimmt wird, um eine Verbindung zu identifizieren, die die Aktivität eines MU-1-Proteins moduliert.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Volllängen-cDNA-Sequenz von murinem MU-1. Die Nukleotidsequenz entspricht den Nukleotiden 1-2628 der SEQ ID Nr.: 9.
  • 2 zeigt die Aminosäuresequenz von murinem MU-1 (entsprechend den Aminosäuren 1-529 der SEQ ID Nr.: 10). Es gibt eine vorhergesagte Leader-Sequenz bei den Aminosäuren 1-19, die mittels SPScan mit einer Bewertung von 10,1 vorhergesagt wurde (fett gedruckt). Es gibt eine vorhergesagte Transmembrandomäne bei den Aminosäuren 237-253 (unterstrichen). Vorhergesagte Signalmotive sind u.a. die folgenden Regionen: Box 1: Aminosäuren 265-274 und Box 2: Aminosäuren 310-324 (fett und unterstrichen); sechs Tyrosine befinden sich bei den Aminosäurepositionen 281, 319, 361, 368, 397 und 510. Das WSXWS-Motiv (SEQUENZ ID NR: 8) befindet sich bei Aminosäurerest 214 bis Aminosäurerest 218 (groß, fett gedruckt). Potenzielle STAT-Andockstellen beinhalten die Aminosäuren 393-398 und Aminosäuren 510-513.
  • 3 zeigt den GAP-Vergleich der humanen und der murinen MU-1-cDNA-Sequenz (entsprechend den Nukleinsäuren 1-2665 der SEQ ID Nr.: 1 bzw. den Nukleinsäuren 1-2628 der SEQ ID Nr.: 9). HuMU-1 = humanes MU-1, murMU-1 = murines MU-1. Gap-Parameter Gap-Gewicht = 50, Durchschnittliche Übereinstimmung = 10,000, Längengewicht = 3, Durchschnittlicher Mismatch = 0,000. Prozentuale Identität = 66,116.
  • 4 zeigt einen GAP-Vergleich des humanen MU-1-Proteins (entsprechend den Aminosäuren 1-538 der SEQ ID Nr.: 2) und des murinen MU-1-Proteins (entsprechend den Aminosäuren 1-529 der SEQ ID Nr.: 10). BLOSUM62-Aminosäuresubstitutionsmatrix. (Henikoff, S. und Henikoff, J.G. (1992)). Amino acid substitution matrices from protein blocks (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Gap-Parameter = Gap-Gewicht: 8, Durchschnittliche Übereinstimmung = 2,912, Längengewicht = 2, Durchschnittlicher Mismatch = -2,003. Prozentuale Identität = 65,267
  • 5 zeigt ein Mehrfach-Sequenzalignment der Aminosäuren von humanem MU-1 (entsprechend SEQ ID Nr.: 2), murinem MU-1 (entsprechend SEQ ID Nr.: 10) und von humaner IL2-beta-Kette (GENbank Zugangs-Nr. M26062). Leader- und Transmembrandomänen sind unterstrichen. Konservierte Cytokinrezeptormodul-Motive sind durch Fettdruck deutlich gemacht. Potenzielle Signalregionen sind durch Unterstreichen und Fettdruck verdeutlicht.
  • 6 zeigt die Signalgebung durch MU-1. MU-1 phosphoryliert STAT 5 in der Klon-E7-EPO-MU-1-Chimäre. Unter den im Beispiel 3 angegebenen Bedingungen führt die Signalgebung durch MU-1 an allen getesteten Zeitpunkten zur Phosphorylierung von STAT 5. Die Behandlung von Kontrollen oder der chimären BAF-3-Zellen mit IL-3 führte zur Phosphorylierung von STAT 3, aber nicht von STAT 1 oder 5.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben Polynukleotide bereitgestellt, die die MU-1-Kette der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie codieren (im Folgenden "MU-1" oder "MU-1-Protein"), einschließlich, ohne Beschränkung, Polynukleotiden, die humanes und murines MU-1 codieren.
  • Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind das MU-1-Protein und die MU-1-Nukleinsäuremoleküle humane MU-1-Moleküle. Eine 70 Aminosäuren lange Region des humanen IL5-Rezeptors (LMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVS SMCREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWFVIVIMATICFILLIL, SEQ ID Nr.: 3) wurde zum Durchsuchen der GenBank-EST-Datenbank unter Verwendung des TBLASTN-Algorithmus verwendet. Eine Sequenz in dem genomischen BAC-Klon A0002303 des Humanchromosoms 16p12 wurde mit Homologie zu dieser Region identifiziert, was darauf hindeutet, dass dieses Segment ein Gen für einen neuen Hämatopoetinrezeptor codieren könnte. Die Untersuchung der offenen Leserahmen innerhalb von 1000 Bp von Nukleotid 40886 ergaben einen offenen Leserahmen von 270 bp, der bei Verwendung bei einer BLASTP-Suche von GenPept ausschließlich Mitglieder der Cytokinrezeptorfamilie identifiziert. Ein Stoppcodon am Ende dieses Leserahmens wurde so interpretiert, dass es auf einen Übergang über eine Exon/Intron-Grenze hinweist.
  • Dann wurde bestimmt, ob RNA von einem innerhalb dieses BAC-Klons von Chromosom 16p12 enthaltenen Gen transkribiert wird. PCR-Primer wurden auf Basis des größten ORF-Segments synthetisiert, das eine Peptidsequenz enthielt, die innerhalb der Cytokinrezeptorfamilie konserviert ist. Die Primer GAGTCCGAGGAGAAAGCTGATCTCA (5p) (SEQ ID Nr.: 4) und GAAAGATGACCGGGTCRCTCCATT (3p) (SEQ ID Nr.: 5). wurden in PCRs zum Screening von Phagenbanken von verschiedenen menschlichen Geweben (Clontech) verwendet. PCR-Produkte mit der erwarteten Größe von 164 bp, die spezifisch mit einem 32-P-markierten Oligonukleotid der Sequenz ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ ID Nr.: 6) hybridisierten, wurden in Phagen aus Lunge, Niere, Plazenta und Herz beobachtet. Unter Verwendung des Oligonukleotids ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ ID Nr.: 7) wurde ein Volllängen-cDNA-Klon NN14-1b (MU-1) identifiziert, gereinigt und sequenziert. Die DNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID Nr.: 1 bzw. SEQ ID Nr.: 2 dargestellt. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz des humanen MU-1-Rezeptors enthält eine mutmaßliche Signalsequenz von Aminosäuren 1-21. Es wird angenommen, dass das humane MU-1 die Sequenz der Aminosäuren 24-538 der SEQ ID Nr.: 2 hat. Eine Transmembrandomäne findet sich bei den Aminosäuren 237-254.
  • Bei einer anderen Ausführungsform sind das MU-1-Protein und die MU-1-Nukleinsäuremoleküle murine MU-1-Moleküle. Um die Polynukleotidsequenz zu identifizieren, die das murine MU-1-Protein codiert, wurde ein partielles Fragment des murinen Homologs des MU-1-Rezeptors mittels PCR aus Maus-cDNA isoliert, wie im Beispiel 1 beschrieben, wobei die von der humanen Sequenz stammenden Oligonukleotide verwendet wurden. Die DNA-Sequenz dieses Fragments wurde bestimmt, und zwei Oligonukleotide wurden von einem inneren Abschnitt dieses Fragments mit den folgenden Sequenzen abgeleitet:
    TTGAACGTGACTGTGGCCTT (5p)(SEQ ID Nr.: 13)
    TGRATGAAGTGCCTGGCTGA (3p)(SEQ ID Nr.: 14).
  • Die Oligonukleotide wurden dazu verwendet, ein internes Fragment von 262 Nukleotiden des ursprünglichen PCR-Produkts (entsprechend den Nukleotiden 781-1043 der murinen cDNA-Sequenz der 1 und SEQ ID Nr.: 9) zu amplifizieren, das als Hybridisierungssonde zum Screening einer von der 2D6-T-Zelllinie isolierten cDNA-Bank verwendet wurde. Von zwei unabhängigen Klonen wurde die DNA-Sequenz bestimmt. Klon 6 wurde sequenziert, und es wurde bestätigt, dass er ein Volllängenhomolog von humanem MU-1 ist.
  • Die Volllängen-Nukleotidsequenz von murinem MU-1 (entsprechend den Nukleotiden 1-2628 der SEQ ID Nr.: 9) ist in 1 gezeigt. Die Nukleotidsequenz hat eine vorhergesagte Leadersequenz bei den Nukleotiden 407-464, eine codierende Sequenz bei den Nukleotiden 407-1993 und ein Terminationscodon bei den Nukleotiden 1994-1997. Die Nukleotide 1-406 entsprechen der 5'-untranslatierten Region, und die Nukleotide 1998-2628 entsprechen der 3'-untranslatierten Region. Die vorhergesagte Proteinsequenz von murinem MU-1 (entsprechend den Aminosäuren 1-529 der SEQ ID Nr.: 10) ist in 2 gezeigt.
  • Das murine MU-1-Protein enthält eine durch SPScan (Bewertung = 10,1) vorhergesagte Leadersequenz (entsprechend den Aminosäuren 1-19 der SEQ ID Nr.: 10), und eine vorhergesagte Transmembrandomäne (entsprechend den Aminosäuren 237-253 der SEQ ID Nr.: 10). Vorhergesagte Signalmotive sind u.a. die folgenden Regionen: Box 1: Aminosäuren 265-274 der SEQ ID Nr.: 10, Box 2: Aminosäuren 310-324 der SEQ ID Nr.: 10, sechs Tyrosinreste an den Positionen 281, 319, 361, 368, 397 und 510 der SEQ ID Nr.: 10. Potenzielle STAT-Andockstellen sind u.a., aber nicht beschränkt auf: STAT 5: EDDGYPA, STAT 3: YLQR.
  • Der offene Leserahmen von MU-1 codiert ein Mitglied der Hämatopoetinrezeptorfamilie. Bei einer Ausführungsform hat MU-1 eine Leadersequenz, konservierte Cysteinpaare, PP- und WSXWS- (SEQ ID Nr.: 8) Motive, die für die Familie charakteristisch sind, sowie eine Transmembrandomäne und eine ausgedehnte cytoplasmatische Domäne. MU-1 enthält ferner ein konserviertes PXPP- sowie Box-I- und Box-II-Signalmotive in der cytoplasmatischen Domäne (siehe 5). Diese Domänen sind zwischen murinem MU-1 und humanem MU-1 konserviert. Ein anschließendes FASTA-Alignment der MU-1-Sequenz mit GenPept zeigte die größte Homologie mit humanem IL-2Rb (siehe 5).
  • Die humane MU-1-cDNA wurde bei der American Type Culture Collection am 10. März 1998 als Zugangsnummer ATCC 98687 hinterlegt.
  • Mittels Northern-Analyse, wie im Beispiel 4 beschrieben, wurde murines MU-1 in adulten Milz-, Lungen- und Herzgeweben nachgewiesen. Humanes MU-1 wurde in adulten humanen Lymphgeweben, PBLs, Thymus, Milz und Lymphknoten und in fötaler Lunge nachgewiesen.
  • Jegliche Formen der MU-1-Proteine mit weniger als voller Länge sind in die vorliegende Erfindung eingeschlossen und werden hier zusammen mit den Volllängen- und den reifen Formen als "MU-1" oder "MU-1-Proteine" bezeichnet. MU-1-Proteine von weniger als voller Länge können durch Expression eines entsprechenden Fragments des Polynukleotids, das Volllängen-MU-1-Protein codiert, (SEQ ID Nr.: 4 oder SEQ ID Nr.: 6) hergestellt werden. Diese jeweiligen Polynukleotidfragmente können ebenfalls verwendet werden. Modifizierte Polynukleotide, wie vorstehend beschrieben, können durch molekularbiologische Standardtechniken hergestellt werden, einschließlich Konstruktion geeigneter gewünschter Deletionsmutanten, ortsgerichteter Mutageneseverfahren oder durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung geeigneter Oligonukleotidprimer.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hat ein Protein "eine biologische Aktivität der MU-1-Kette der Hämatopoetinrezeptor-Superfamilie", wenn es eine oder mehrere der biologischen Aktivitäten des entsprechenden reifen MU-1-Proteins besitzt. Die MU-1-Aktivität beinhaltet die Interaktion mit STAT-Molekülen (z.B. STAT 5, STAT 3).
  • MU-1 oder aktive Fragmente davon (MU-1-Proteine) können mit Trägermolekülen, wie Immunglobulinen oder einem Immunglobulinfragment, fusioniert werden. Zum Beispiel können lösliche Formen des MU-1 über "Linker"-Sequenzen mit dem Fc-Anteil eines Immunglobulins fusioniert werden. Andere Fusionsproteine, wie diejenigen mit GST, Lex-A oder MBP, können ebenfalls verwendet werden.
  • Ebenfalls offenbart sind allelische Varianten der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr.: 1 und SEQ ID Nr.: 9 angegeben, d.h. natürlich vorkommende alternative Formen des isolierten Polynukleotids der SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 9, die ebenfalls MU-1-Proteine und vorzugsweise solche Proteine, die eine biologische Aktivität von MU-1 besitzen, codieren. Ebenfalls in der Erfindung enthalten sind isolierte Polynukleotide, die mit der in SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 9 angegebenen Nukleotidsequenz unter sehr stringenten Bedingungen (zum Beispiel 0,1 X SSC bei 65°C) hybridisieren. Isolierte Polynukleotide, die MU-1-Proteine codieren, die sich aber von der in SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 9 dargestellten Nukleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. Variationen in der Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID Nr.: 1 oder SEQ ID Nr.: 9 dargestellt, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen verursacht werden, sind ebenfalls enthalten.
  • Wie hier verwendet, soll der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen für das Hybridisieren und Waschen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die zu mindestens 60 % identisch zueinander sind, üblicherweise miteinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind diese Bedingungen derart, dass Sequenzen mit mindestens etwa 70 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 80 %, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 85 % oder 90 % identisch zueinander sind, üblicherweise miteinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 finden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einer oder mehreren Wäschen in 0,2 X SSC, 0,1 % SDS bei 50°C, vorzugsweise bei 55°C, stärker bevorzugt bei 60°C und noch stärker bevorzugt bei 65°C. Bereiche, die die vorstehend genannten Werte abdecken, z.B. 55-60°C oder 50-65°C sind umfasst. Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz der SEQ ID Nr.: 1 oder 9 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hier verwendet, betrifft ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z.B. ein natürliches Protein codiert).
  • Zur Bestimmung der prozentualen Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder von zwei Nukleinsäuresequenzen werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke aneinander ausgerichtet (d.h. in eine oder beide einer ersten und einer zweiten Aminosäuresequenz oder Nukleinsäuresequenz können für optimales Alignment Lücken eingeführt werden, und nichtidentische Sequenzen können zu Vergleichszwecken vernachlässigt werden). Bei einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Länge der Referenzsequenz, die zu Vergleichszwecken ausgerichtet wird, mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 40 %, stärker bevorzugt mindestens 50 %, noch stärker bevorzugt mindestens 60 % und noch stärker bevorzugt mindestens 70 %, 80 % oder 90 % der Länge der Referenzsequenz. Die Aminosäurereste oder Nukleotide an entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das gleiche Nukleotid besetzt ist, wie an der entsprechenden Position in der zweiten Sequenz, dann sind die Moleküle an der Position identisch (wie hier verwendet, entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität" Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie"). Die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der identischen Positionen, die die Sequenzen gemeinsam haben, wobei die Anzahl der Lücken und die Länge jeder Lücke, die für das optimale Alignment der beiden Sequenzen eingeführt werden müssen, berücksichtigt werden.
  • Der Vergleich von Sequenzen und die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Needleman-Wunsch-Algorithmus (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) bestimmt, der in das GAP-Programm im GCG-Softwarepaket (erhältlich unter http://www.gcg.com) eingebracht wird, wobei entweder eine Blosum-62-Matrix oder eine PAM250-Matrix und ein Lückengewicht von 16, 14, 12, 10, 8, 6, oder 4 und ein Längengewicht von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet werden. Bei noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms im GCG-Softwarepaket (erhältlich unter http://www.gcg.com) unter Verwendung einer NWSgapdna.CMP-Matrix und eines Lückengewichts von 40, 50, 60, 70 oder 80 und eines Längengewichts von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bestimmt. Bei einer anderen Ausführungsform wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäure- oder Nukleotidsequenzen unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller (Myers und Miller, 1988, Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17), der in das ALIGN-Programm (Version 2.0) eingebracht wurde, unter Verwendung einer PAM120- Gewicht-Rest-Tabelle, einer Lückenlängenstrafe von 12 und einer Lückenstrafe von 4 bestimmt.
  • Die hier offenbarten Nukleinsäure- und Proteinsequenzen können ferner als "Abfragesequenz" zur Durchführung einer Suche gegen öffentliche Datenbanken verwendet werden, um zum Beispiel weitere Familienmitglieder oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Diese Suchen können unter Verwendung der NBLAST- und XBLAST-Programme (Version 2.0) von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10 durchgeführt werden. BLAST-Nukleotidsuchen können mit dem NBLAST-Programm, Bewertung = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die zu den erfindungsgemäßen Adhr-1-Nukleinsäuremolekülen homolog sind. BLAST-Proteinsuchen können mit dem XBLAST-Programm, Bewertung = 100, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu den erfindungsgemäßen Adhr-1-Proteinmolekülen homolog sind. Um lückenhaltige Alignments zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST wie in Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402 beschrieben, genutzt werden. Wenn die BLAST- und Gapped BLAST-Programme verwendet werden, können die Defaultparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
  • Ebenfalls offenbart sind Polynukleotide, die Homologe des humanen MU-1 aus anderen Tierspezies, insbesondere anderen Säugerspezies, codieren. Spezieshomologe können identifiziert und isoliert werden, indem Sonden oder Primer von den hier offenbarten murinen oder humanen Sequenzen hergestellt werden und eine Bank von einer entsprechenden Spezies gescreent wird, wie beispielsweise Banken, die von PBMCs, Thymus oder Hoden der entsprechenden Spezies konstruiert wurden.
  • Die isolierten Polynukleotide können betriebsfähig mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden werden, wie den pMT2- oder pED-Expressionsvektoren, die in Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991) offenbart sind, um das MU-1-Protein rekombinant herzustellen. Viele geeignete Expressionskontrollsequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Allgemeine Verfahren zur Expression rekombinanter Proteine sind ebenfalls bekannt und beispielhaft in R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990) dargestellt. Wie hier definiert, bedeutet "betriebsfähig verbunden" enzymatisch oder chemisch ligiert, so dass eine kovalente Bindung zwischen dem isolierten Polynukleotid und der Expressionskontrollsequenz derart gebildet wird, dass das MU-1-Protein von einer Wirtszelle exprimiert wird, die mit der ligierten Polynukleotid/Expressionskontrollsequenz transformiert/transfiziert wurde.
  • Eine Reihe von Zelltypen kann als geeignete Wirtszellen für die Expression des MU-1-Proteins fungieren. Jeder Zelltyp, der in der Lage ist, funktionelles MU-1-Protein zu exprimieren, kann verwendet werden. Geeignete Säuger-Wirtszellen beinhalten zum Beispiel Affen-COS-Zellen, Chinesischer-Hamster-Ovar- (CHO-) Zellen, humane 293-Nierenzellen, humane epidermale A431-Zellen, humane Colo205-Zellen, 3T3-Zellen, CV-1-Zellen, andere transformierte Primatenzelllinien, normale diploide Zellen, Zellstämme, die aus der In-vitro-Kultur von Primärgewebe stammen, primäre Explantate, HeLa-Zellen, Maus-L-Zellen, BHK-, HL-60-, U937-, HaK-, Rat2-, BaF3-, 32D-, FDCP-1-, PC12-, M1x- oder C2C12-Zellen.
  • Das MU-1-Protein kann auch hergestellt werden, indem das isolierte Polynukleotid mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem oder mehreren Insekten-Expressionsvektoren betriebsfähig verbunden und ein Insekten-Expressionssystem eingesetzt wird. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssysteme sind in Kitform z.B. von Invitrogen, San Diego, Kalifornien, U.S.A. (das MaxBac-Kit) kommerziell erhältlich, und solche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt, wie in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987) beschrieben. Lösliche Formen des MU-1-Proteins können ebenfalls in Insektenzellen unter Verwendung geeigneter isolierter Polynukleotide, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden.
  • Alternativ kann das MU-1-Protein in niederen Eukaryoten, wie Hefe, oder in Prokaryoten, wie Bakterien, hergestellt werden. Geeignete Hefestämme sind u.a. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces-Stämme, Candida oder jeder Hefestamm, der in der Lage ist, heterologe Proteine zu exprimieren. Geeignete Bakterienstämme sind u.a. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium oder jeder Bakterienstamm, der in der Lage ist, heterologe Proteine zu exprimieren.
  • Die Expression in Bakterien kann zur Bildung von Einschlusskörperchen führen, die das rekombinante Protein enthalten. So kann die Rückfaltung des rekombinanten Proteins erforderlich sein, um aktives oder aktiveres Material herzustellen. Mehrere Verfahren zur Gewinnung korrekt gefalteter heterologer Proteine aus bakteriellen Einschlusskörperchen sind im Stand der Technik bekannt. Diese Verfahren beinhalten gewöhnlich das Solubilisieren des Proteins aus den Einschlusskörperchen, dann das vollständige Denaturieren des Proteins unter Verwendung eines chaotropen Mittels. Wenn Cysteinreste in der primären Aminosäuresequenz des Proteins vorliegen, ist es oft notwendig, die Rückfaltung in einer Umgebung, die die korrekte Faltung von Disulfidbindungen gestattet, (einem Redoxsystem) durchzuführen. Allgemeine Verfahren für die Rückfaltung sind in Kohno, Meth. Enzym., 185: 187-195 (1990) offenbart. EP 0433225 und die gleichzeitig eingereichte Anmeldung USSN 08/163,877 beschreiben weitere geeignete Verfahren.
  • Das MU-1-Protein kann auch als ein Produkt transgener Tiere, z.B. als Komponente der Milch transgener Kühe, Ziegen, Schweine oder Schafe, exprimiert werden, die durch somatische oder Keimzellen gekennzeichnet sind, die eine Polynukleotidsequenz enthalten, die das MU-1-Protein codiert.
  • Das MU-1-Protein kann durch Züchten einer Kultur transformierter Wirtszellen unter Kulturbedingungen, die zur Expression des gewünschten Proteins notwendig sind, hergestellt werden. Das erhaltene exprimierte Protein kann dann aus dem Kulturmedium oder aus Zellextrakten gereinigt werden. Lösliche Formen des MU-1-Proteins können aus konditionierten Medien gereinigt werden. Membrangebundene Formen des MU-1-Proteins können durch Herstellen einer Gesamt-Membranfraktion aus der exprimierenden Zelle und Extrahieren der Membranen mit einem ionischen Detergenz, wie Triton X-100, gereinigt werden.
  • Das MU-1-Protein kann unter Verwendung von Verfahren gereinigt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Zum Beispiel kann das MU-1-Protein unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, eingeengt werden. Nach dem Einengungsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix, wie ein Gelfiltrationsmedium, aufgebracht werden. Alternativ kann ein Anionenaustauschharz eingesetzt werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl- (DEAE-) oder Polyethylenimin- (PEI-) Gruppen. Die Matrices können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Typen sein, die üblicherweise bei der Proteinreinigung eingesetzt werden. Alternativ kann ein Kationenaustauschschritt eingesetzt werden. Geeignete Kationenaustauscher sind u.a. verschiedene unlösliche Matrices, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen umfassen. Sulfopropylgruppen (z.B. S-Sepharose®-Säulen) sind bevorzugt. Die Reinigung des MU-1-Protein aus Kulturüberstand kann auch eine oder mehrere Säulenschritte über Affinitätsharze, wie Concanavalin-A-Agarose, Heparin-Toyopearl® oder Cibacrom-blue-3GA-Sepharose®, oder durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung von Harzen, wie Phenylether, Butylether, oder Propylether; oder durch Immunaffinitätschromatographie beinhalten. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie- (RP-HPLC-) Schritte unter Verwendung hydrophober RP-HPLC-Medien, z.B. Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen, eingesetzt werden, um das MU-1-Protein weiter zu reinigen. Affinitätssäulen, die Antikörper gegen das MU-1-Protein enthalten, können ebenfalls bei der Reinigung gemäß bekannten Verfahren verwendet werden. Einige oder alle der vorstehenden Reinigungsschritte können auch in verschiedenen Kombinationen mit anderen bekannten Verfahren dazu eingesetzt werden, ein im Wesentlichen gereinigtes isoliertes rekombinantes Protein bereitzustellen. Vorzugsweise wird das isolierte MU-1-Protein so gereinigt, dass es im Wesentlichen frei von anderen Säugerproteinen ist.
  • MU-1-Proteine können für das Screening nach Substanzen verwendet werden, die in der Lage sind, an MU-1 zu binden. Bindungsassays unter Verwendung eines gewünschten Bindungsproteins, das immobilisiert ist oder nicht, sind im Stand der Technik bekannt und können unter Verwendung des erfindungsgemäßen MU-1-Proteins für diesen Zweck verwendet werden. Auf gereinigten Zellen basierende oder auf Protein basierende (zellfreie) Screeningassays können zum Identifizieren solcher Substanzen verwendet werden. Zum Beispiel kann MU-1-Protein in gereinigter Form auf einem Träger immobilisiert werden, und bindende oder potenzielle Liganden für das gereinigte MU-1-Protein können gemessen werden.
  • MU-1-Proteine, die aus Zellen gereinigt oder rekombinant hergestellt wurden, können als pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden, wenn sie mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert werden. Eine solche Zusammensetzung kann zusätzlich zu MU-1 oder Inhibitor und Träger verschiedene Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Solubilisatoren und andere Materialien enthalten, die im Stand der Technik bekannt sind. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bedeutet ein nichttoxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des (der) Wirkstoff(s/e) nicht beeinträchtigt. Die Merkmale des Trägers hängen vom Verabreichungsweg ab.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Cytokine, Lymphokine oder andere hämatopoetische Faktoren enthalten, wie M-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, G-CSF, Stammzellfaktor und Erythropoetin. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Anti-Cytokin-Antikörper enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann thrombolytische oder antithrombotische Faktoren, wie Plasminogen-Aktivator und Faktor VIII, enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann ferner andere entzündungshemmende Mittel enthalten. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Mittel können in die pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht werden, um eine synergistische Wirkung mit isoliertem MU-1-Protein zu erhalten oder um Nebenwirkungen, die von dem isolierten MU-1-Protein verursacht werden, zu minimieren. Dagegen kann isoliertes MU-1-Protein in Formulierungen des bestimmten Cytokins, Lymphokins, anderen hämatopoetischen Faktors, thrombolytischen oder antithrombotischen Faktors oder entzündungshemmenden Mittels eingebracht werden, um Nebenwirkungen des Cytokins, Lymphokins, anderen hämatopoetischen Faktors, thrombolytischen oder antithrombotischen Faktors oder entzündungshemmenden Mittels zu minimieren.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann die Form eines Liposoms haben, in dem isoliertes MU-1-Protein zusätzlich zu anderen pharmazeutisch verträglichen Trägern mit amphipathischen Mitteln kombiniert wird, wie Lipiden, die in aggregierter Form als Mizellen, unlösliche Monolayer, flüssige Kristalle oder lamellare Schichten vorliegen. Geeignete Lipide für Liposomenformulierungen sind u.a., ohne Beschränkung, Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipid, Saponin, Gallensäuren und dergleichen. Die Herstellung solcher Liposomenformulierungen liegt in den Fähigkeiten des Fachmanns, wie zum Beispiel im U.S.-Patent Nr. 4,235,871; U.S.-Patent Nr. 4,501,728; U.S.-Patent Nr. 4,837,028 und U.S.-Patent Nr. 4,737,323 offenbart.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge jedes Wirkstoffs der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des Verfahrens, die ausreicht, um einen bedeutenden Nutzen für den Patienten zu erbringen, z.B. eine Verbesserung der Symptome, die Heilung oder die Zunahme der Geschwindigkeit der Heilung solcher Zustände. Wenn er auf einen einzelnen Wirkstoff angewendet wird, der allein verabreicht wird, betrifft der Begriff nur diesen Inhaltsstoff. Wenn er auf eine Kombination angewendet wird, betrifft der Begriff die vereinigten Mengen der Wirkstoffe, die zu der therapeutischen Wirkung führen, ob sie nun in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig verabreicht werden.
  • Isoliertes MU-1-Protein kann entweder allein oder in Kombination mit anderen Therapien verabreicht werden, wie Behandlungen, die Cytokine, Lymphokine oder andere hämatopoetische Faktoren einsetzen. Wenn es mit einem oder mehreren Cytokinen, Lymphokinen oder anderen hämatopoetischen Faktoren gemeinsam verabreicht wird, kann MU-1-Protein entweder gleichzeitig mit dem (den) Cytokin(en), Lymphokin(en) oder anderen hämatopoetischen Faktor(en), thrombolytischen oder antithrombotischen Faktoren oder aufeinander folgend verabreicht werden. Wird es aufeinander folgend verabreicht, entscheidet der behandelnde Arzt über die geeignete Reihenfolge der Verabreichung von MU-1-Protein in Kombination mit dem (den) Cytokin(en), Lymphokin(en) oder anderen hämatopoetischen Faktor(en), thrombolytischen oder antithrombotischen Faktoren.
  • Die Verabreichung von MU-1-Protein, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung oder zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet wird, kann auf eine Vielzahl herkömmlicher Weisen durchgeführt werden, wie orale Aufnahme, Inhalation oder kutane, subkutane oder intravenöse Injektion. Intravenöse Verabreichung an den Patienten ist bevorzugt.
  • Wenn eine therapeutisch wirksame Menge MU-1-Protein oral verabreicht wird, hat das MU-1-Protein die Form einer Tablette, einer Kapsel, eines Pulvers, einer Lösung oder eines Elixiers. Wenn sie in Tablettenform verabreicht wird, kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen festen Träger, wie Gelatine, oder einen Hilfsstoff enthalten. Die Tablette, die Kapsel und das Pulver enthalten von etwa 5 bis 95 % MU-1-Protein und vorzugsweise von etwa 25 bis 90 % MU-1-Protein. Wenn sie in flüssiger Form verabreicht wird, kann ein flüssiger Träger, wie Wasser, Petroleum, Öle tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl oder Sesamöl oder Syntheseöle, hinzugefügt werden. Die flüssige Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann ferner physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder eine andere Saccharidlösung oder Glykole, wie Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, enthalten. Wenn sie in flüssiger Form verabreicht wird, enthält die pharmazeutische Zusammensetzung von etwa 0,5 bis 90 Gew.-% MU-1-Protein, und vorzugsweise von etwa 1 bis 50 % MU-1-Protein.
  • Wenn eine therapeutisch wirksame Menge an MU-1-Protein mittels intravenöser, kutaner oder subkutaner Injektion verabreicht wird, hat das MU-1-Protein die Form einer pyrogenfreien, parenteral verträglichen, wässrigen Lösung. Die Herstellung solcher parenteral verträglicher Proteinlösungen, wobei pH, Isotonie, Stabilität und dergleichen angemessen berücksichtigt werden, liegt in den Fähigkeiten des Fachmanns. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen, kutanen oder subkutanen Injektion sollte zusätzlich zu MU-1-Protein ein isotonisches Vehikel, wie Natriumchlorid-Injektion, Ringer-Injektion, Dextrose-Injektion, Dextrose- und Natriumchlorid-Injektion, lactathaltige Ringer-Injektion oder ein anderes Vehikel, wie im Stand der Technik bekannt, enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Puffer, Antioxidantien oder andere Hilfsstoffe, die dem Fachmann bekannt sind, enthalten.
  • Die Menge an MU-1-Protein in der pharmazeutischen Zusammensetzung hängt von der Art und Schwere des behandelten Zustands und von der Art vorheriger Behandlungen, denen der Patient unterworfen wurde, ab. letztendlich entscheidet der behandelnde Arzt über die Menge an MU-1-Protein, mit der jeder einzelne Patient behandelt werden soll. Zu Beginn verabreicht der behandelnde Arzt niedrige Dosen von MU-1-Protein und beobachtet die Reaktion des Patienten. Höhere Dosen von MU-1-Protein können verabreicht werden, bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten erzielt worden ist, und zu diesem Zeitpunkt wird die Dosierung im Allgemeinen nicht weiter erhöht. Es wird erwogen, dass die verschiedenen verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen etwa 0,1 μg bis etwa 100 mg MU-1-Protein pro kg Körpergewicht enthalten sollten.
  • Die Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung variiert je nach der Schwere der behandelten Erkrankung und dem Zustand und der potenziellen idiosynkratischen Reaktion jedes einzelnen Patienten. Es wird erwogen, dass die Dauer jeder Anwendung des MU-1-Proteins im Bereich von 12 bis 24 Stunden kontinuierlicher intravenöser Verabreichung liegen soll. letztendlich entscheidet der behandelnde Arzt über die angemessene Dauer der intravenösen Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Es wird angenommen, dass das Polynukleotid und die Proteine eine oder mehrere der Anwendungen oder biologischen Aktivitäten (einschließlich derjenigen in Verbindung mit den hier genannten Assays), die nachstehend dargelegt sind, aufweisen. Für Proteine beschriebene Anwendungen oder Aktivitäten können durch Verabreichung oder Verwendung solcher Proteine oder durch Verabreichung oder Verwendung von Polynukleotiden, die solche Proteine codieren, (wie zum Beispiel bei Gentherapien oder in Vektoren, die sich zum Einbringen von DNA eignen) bereitgestellt werden.
  • Cytokin- und Zellproliferations-/Differenzierungsaktivität
  • Ein MU-1-Protein kann Cytokin-, (entweder induzierende oder hemmende) Zellproliferations- oder (entweder induzierende oder hemmende) Zelldifferenzierungs-Aktivität zeigen oder die Produktion anderer Cytokine in bestimmten Zellpopulationen induzieren.
  • Viele bis heute entdeckte Proteinfaktoren, einschließlich aller bekannten Cytokine, haben eine Aktivität in einem oder mehreren faktorabhängigen Zellproliferationsassays gezeigt, und somit dienen diese Assays als leichte Bestätigung der Cytokinaktivität. Die Aktivität eines MU-1-Proteins wird durch einen von einer Reihe routine faktorabhängiger Zellproliferationsassays für Zelllinien nachgewiesen, die ohne Beschränkung 32 D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (PräB-M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1, Mo7e und CMK umfassen.
  • BAF-3-Zellen, die chimäre huEPOR-huMU-Rezeptoren exprimieren, proliferieren als Antwort auf huEPO. Um die Fähigkeit des MU-Rezeptors zu testen, über ihre cytoplasmatische Domäne Signale zu geben, wurden BAF-3-Zellen genetisch so verändert, dass sie chimäre EPOr/MU(cyto)-Rezeptoren exprimierten, und hinsichtlich des 3H-Thymidin-Einbaus in Gegenwart von EPO untersucht. BAF-3-Zellen, die intakte EPOr-Moleküle exprimieren, proliferieren als Antwort auf EPO, während die BAF-3-Elternzellen nicht proliferieren. Der A5-Klon, der das chimäre EPOr/MU(cyto) besitzt, proliferiert als Antwort auf EPO, was zeigt, dass der cytoplasmatische Anteil von MU-1 ein Proliferationssignal aufrecht erhalten kann. Die BAF-3-Zellen, die EPOr auf ihrer Oberfläche exprimieren, reagieren auch auf EPO.
  • Die Aktivität eines Proteins kann, neben anderen Mitteln, durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
    Assays der T-Zell- oder Thymozytenproliferation beinhalten ohne Beschränkung diejenigen, die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, hrsg. von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol. 145: 1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Bertagnolli, et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol. 152: 1756-1761, 1994.
  • Assays der Cytokinproduktion und/oder Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen oder Thymozyten beinhalten ohne Beschränkung diejenigen, die beschrieben sind in: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A.M. und Shevach, E.M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan Hrsg. Bd. 1 S. 3.12.1-3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1994; und Measurement of mouse und human Interferon γ, Schreiber, R.D. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan Hrsg. Bd. 1 S. 6.8.1-6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
  • Assays der Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer und lymphopoetischer Zellen beinhalten ohne Beschränkung diejenigen, die beschrieben sind in: Measurement of Human und Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L.S. und Lipsky, P.E. in Current Protocols in Immunology, J.E.e.a. Coligan Hrsg. Bd. 1 S. 6.3.1-6.3.12, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; de Vries et al., J. Exp. Med. 173: 1205-1211, 1991; Moreau et al., Nature 336: 690-692, 1988; Greenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2931-2938, 1983; Measurement of mouse und human interleukin 6 – Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan Hrsg. Bd. 1 S. 6.6.1-6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin 11 – Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S.C. und Turner, K.J. in Current Protocols in Immunology, J.E.e.a. Coligan Hrsg. Bd. 1 S. 6.15.1 John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of mouse und human Interleukin 9 – Ciarletta, A., Giannotti, J., Clark, S.C. und Turner, K.J. in Current Protocols in Immunology, J.E.e.a Coligan Hrsg. Bd. 1 S. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
  • Assays von T-Zellklon-Antworten auf Antigene (die u.a. Proteine, die APC-T-Zell-Wechselwirkungen sowie direkte T-Zell-Wirkungen beeinflussen, durch Messen der Proliferation und der Cytokinproduktion identifizieren) beinhalten ohne Beschränkung diejenigen, die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, hrsg. von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; Kapitel 6, Cytokines und their cellular receptors; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun. 11: 405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988.
  • Immunstimulierende oder -supprimierende Aktivität
  • Ein MU-1-Protein kann auch immunstimulierende oder immunsupprimierende Aktivität haben, einschließlich, ohne Beschränkung, der Aktivitäten, für die hier Assays beschrieben sind. Ein Protein kann zur Behandlung verschiedener Immunschwächen und -erkrankungen (einschließlich schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID)), z.B. zur Regulation (nach oben oder nach unten) des Wachstums und der Proliferation von T- und/oder B-Lymphozyten, sowie zum Auslösen der Aktivität von NK-Zellen und anderen Zellpopulationen, geeignet sein. Diese Immundefizienzen können genetisch oder durch Virus- (z.B. HIV) sowie Bakterien- oder Pilzinfektionen ausgelöst sein oder von Autoimmunerkrankungen herrühren. Genauer gesagt, können Infektionskrankheiten, die durch Virus-, Bakterien-, Pilz- oder eine andere Infektion hervorgerufen werden, einschließlich Infektionen durch HIV, Hepatitisviren, Herpesviren, Mycobacterien, Leishmania spp., Malaria spp. und verschiedener Pilzinfektionen, wie Candidiasis, unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins behandelbar sein. Natürlich kann in dieser Hinsicht ein offenbartes Protein auch dort geeignet sein, wo eine Ankurbelung des Immunsystems allgemein wünschenswert sein kann, d.h., bei der Behandlung von Krebs.
  • Autoimmunerkrankungen, die unter Verwendung eines offenbarten Proteins behandelt werden können, beinhalten zum Beispiel Bindegewebserkrankung, Multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, autoimmune Lungenentzündung, Guillain-Barre-Syndrom, autoimmune Thyroiditis, insulinabhängigen Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Transplantat-Wirt-Erkrankung und autoimmune entzündliche Augenerkrankung. Ein solches Protein kann auch zur Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen, wie Asthma (insbesondere allergischem Asthma) oder anderen Atemproblemen, geeignet sein. Weitere Zustände, bei denen eine Immunsuppression gewünscht ist, (einschließlich zum Beispiel Organtransplantation) können ebenfalls unter Verwendung eines offenbarten Proteins behandelbar sein.
  • Die MU-1-DNA kartiert ferner auf den chromosomalen Locus von Morbus Crohn. Dadurch können MU-1-Proteine zur Behandlung von Morbus Crohn und anderen entzündlichen Darmerkrankungen verwendet werden.
  • Unter Verwendung der hier offenbarten MU-1-Proteine kann es auch möglich sein, Immunantworten auf eine Reihe von Weisen zu regulieren. Eine Nach-unten-Regulation kann die Form eines Hemmens oder Blockierens einer Immunantwort, die bereits im Gang ist, haben oder kann das Verhindern der Induktion einer Immunantwort beinhalten. Die Funktionen aktivierter T-Zellen können durch Unterdrücken der T-Zell-Antworten oder durch Induzieren einer spezifischen Toleranz in T-Zellen oder beides gehemmt werden. Eine Immunsuppression von T-Zell-Antworten ist gewöhnlich ein aktiver, nicht antigenspezfischer Prozess, der kontinuierliches Aussetzen der T-Zellen gegenüber dem suppressiven Mittel erfordert. Eine Toleranz, die das Induzieren einer Nicht-Reaktionsfähigkeit oder Anergie in T-Zellen beinhaltet, ist von der Immunsuppression dadurch unterscheidbar, dass sie in der Regel antigenspezifisch ist und bestehen bleibt, nachdem das Tolerisierungsmittel vergangen ist. Praktisch kann die Toleranz anhand des Fehlens einer T-Zell-Antwort nach erneutem Aussetzen gegenüber dem spezifischen Antigen in Abwesenheit des Tolerisierungsmittels demonstriert werden.
  • Eine Nach-unten-Regulation oder das Verhindern von einer oder mehreren Antigenfunktionen (einschließlich, ohne Beschränkung, der Funktionen von B-Lymphozytenantigenen (wie zum Beispiel B7)), z.B. das Verhindern eines hohen Spiegels an Lymphokinsynthese durch aktivierte T-Zellen, eignet sich in Situationen einer Gewebe-, Haut- und Organtransplantation und bei Transplantat-Wirt-Erkrankung (graft-versus-host disease, GVHD). Zum Beispiel sollte eine Blockierung der T-Zell-Funktion zu verringerter Gewebezerstörung bei Gewebetransplantation führen. Üblicherweise wird bei Gewebetransplantaten die Abstoßung des Transplantats durch dessen Erkennung durch T-Zellen als fremd eingeleitet, gefolgt von einer Immunreaktion, die das Transplantat zerstört. Die Verabreichung eines Moleküls, das die Interaktion eines B7-Lymphozytenantigens mit seine (m/n) natürlichen Liganden auf Immunzellen (wie einer löslichen, monomeren Form eines Peptids mit B7-2-Aktivität allein oder in Verbindung mit einer monomeren Form eines Peptids mit einer Aktivität eines anderen B-Lymphozytenantigens (z.B. 87-1, B7-3) oder einem blockierenden Antikörper) hemmt oder blockiert, vor der Transplantation kann zur Bindung des Moleküls an den (die) natürlichen Liganden auf den Immunzellen führen, ohne dass das entsprechende costimulatorische Signal übertragen wird. Das Blockieren der B-Lymphozytenantigen-Funktion verhindert in dieser Hinsicht die Cytokinsynthese durch Immunzellen, wie T-Zellen, und wirkt daher als Immunsuppressivum. Außerdem kann das Fehlen einer Costimulation ferner ausreichend sein, um die T-Zellen zu anergetisieren, wodurch Toleranz in einem Individuum erzeugt wird. Die Induktion einer Langzeittoleranz durch B-Lymphozytenantigen-blockierende Reagenzien kann die Notwendigkeit einer wiederholten Verabreichung dieser blockierenden Reagenzien beseitigen. Um eine ausreichende Immunsuppression oder Toleranz in einem Individuum zu erzielen, kann es ebenfalls notwendig sein, die Funktion einer Kombination von B-Lymphozytenantigenen zu blockieren.
  • Die Wirksamkeit bestimmter Blockierungsreagenzien zur Verhinderung von Organtransplantatabstoßung oder GVHD kann unter Verwendung von Tiermodellen geprüft werden, die für die Wirksamkeit bei Menschen prädiktiv sind. Beispiele für geeignete Systeme, die verwendet werden können, sind u.a. allogene Herztransplantate bei Ratten und xenogene Pankreasinselzelltransplantate bei Mäusen, die beide zur Untersuchung der immunsuppressiven Wirkungen von CTLA4Ig-Fusionsproteinen in vivo verwendet wurden, wie in Lenschow et al., Science 257: 789-792 (1992) und Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11102-11105 (1992) beschrieben. Zusätzlich können murine Modelle von GVHD (siehe Paul Hrsg., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, S. 846-847) zur Bestimmung der Wirkung einer Blockierung der B-Lymphozytenantigen-Funktion in vivo auf die Entwicklung dieser Erkrankung verwendet werden.
  • Eine Blockierung der Antigenfunktion kann auch zur Behandlung von Immunkrankheiten therapeutisch nützlich sein. Viele Autoimmunkrankheiten sind das Ergebnis einer unangemessenen Aktivierung von T-Zellen, die gegen eigenes Gewebe reaktiv sind und die Produktion von Cytokinen und Autoantikörpern fördern, die an der Pathologie der Erkrankungen beteiligt sind. Das Verhindern der Aktivierung der autoreaktiven T-Zellen kann Krankheitssymptome verringern oder beseitigen. Die Verabreichung von Reagenzien, die die Costimulation von T-Zellen durch Aufheben der Rezeptor:Ligand-Wechselwirkungen von B-Lymphozytenantigenen blockieren, können zur Hemmung der T-Zell-Aktivierung und zur Verhinderung der Produktion von Autoantikörpern oder von T-Zellen stammenden Cytokinen, die am Krankheitsprozess beteiligt sein können, verwendet werden. Zusätzlich können Blockierungsreagenzien eine antigenspezifische Toleranz autoreaktiver T-Zellen induzieren, die zu einer Langzeitlinderung der Krankheit führen könnte. Die Wirksamkeit von Blockierungsreagenzien zur Verhinderung oder Linderung von Autoimmunkrankheiten kann unter Verwendung einer Reihe gut charakterisierter Tiermodelle für humane Autoimmunkrankheiten bestimmt werden. Beispiele sind u.a. murine experimentelle Autoimmunenzephalitis, systemischer Lupus erythematodes bei MRL/lpr/lpr-Mäusen oder NZB-Hybridmäusen, murine autoimmune Kollagenarthritis, Diabetes mellitus bei NOD-Mäusen und BB-Ratten und murine experimentelle Myasthenia gravis (siehe Paul Hrsg., Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, S. 840-856).
  • Eine Nach-oben-Regulation einer Antigenfunktion (vorzugsweise einer B-Lymphozytenantigen-Funktion) als Mittel zur Nach-oben-Regulation von Immunantworten kann ebenfalls zur Therapie geeignet sein. Eine Nach-oben-Regulation von Immunantworten kann die Form einer Verstärkung einer bestehenden Immunantwort oder des Auslösens einer anfänglichen Immunantwort haben. Zum Beispiel kann eine Verstärkung einer Immunantwort über die Stimulation der B-Lymphozytenantigen-Funktion in Fällen von Virusinfektion geeignet sein. Zusätzlich können systemische Viruserkrankungen, wie Influenza, gemeiner Schnupfen und Enzephalitis, durch systemische Verabreichung stimulatorischer Formen von B-Lymphozytenantigenen gelindert werden.
  • Alternativ können antivirale Immunantworten bei einem infizierten Patienten durch Entnehmen von T-Zellen aus dem Patienten, Costimulieren der T-Zellen in vitro mit viralen antigengepulsten APCs, die entweder ein MU-1-Peptid exprimieren, oder zusammen mit einer stimulatorischen Form eines löslichen hier offenbarten Peptids und erneutes Einbringen der in vitro aktivierten T-Zellen in den Patienten verstärkt werden. Ein anderes Verfahren zur Verstärkung antiviraler Immunantworten wäre die Isolation infizierter Zellen aus einem Patienten, ihr Transfizieren mit einer Nukleinsäure, die ein Protein, wie hier beschrieben, codiert, so dass die Zellen das gesamte oder einen Teil des Proteins auf ihrer Oberfläche exprimieren, und das erneute Einbringen der transfizierten Zellen in den Patienten. Die infizierten Zellen sind dann in der Lage, ein costimulatorisches Signal an T-Zellen zu liefern und sie dadurch in vivo zu aktivieren.
  • Bei einer anderen Anwendung kann eine Nach-oben-Regulation oder Verstärkung der Antigenfunktion (vorzugsweise der B-Lymphozytenantigen-Funktion) zur Induktion einer Tumorimmunität geeignet sein. Tumorzellen (z.B. Sarkom, Melanom, Lymphom, Leukämie, Neuroblastom, Karzinom), die mit einer Nukleinsäure transfiziert werden, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid codiert, können einem Individuum verabreicht werden, um eine tumorspezifische Toleranz in dem Individuum zu überwinden. Wenn gewünscht, kann die Tumorzelle so transfiziert werden, dass sie eine Kombination von Peptiden exprimiert. Zum Beispiel können von einem Patienten erhaltene Tumorzellen ex vivo mit einem Expressionsvektor, der die Expression eines Peptids mit B7-2-ähnlicher Aktivität steuert, allein oder in Verbindung mit einem Peptid, das B7-1-ähnliche Aktivität und/oder B7-3-ähnliche Aktivität hat, transfiziert werden. Die transfizierten Tumorzellen können wieder in den Patienten eingebracht werden, wo sie zur Expression der Peptide auf der Oberfläche der transfizierten Zelle führen. Alternativ können Gentherapietechniken dazu verwendet werden, eine Tumorzelle für die In-vivo-Transfektion anzusteuern.
  • Das Vorliegen des offenbarten Peptids, das die Aktivität eines (von) B-Lymphozytenantigen(s/en) hat, auf der Oberfläche der Tumorzelle liefert das benötigte Costimulationssignal an T-Zellen, um eine T-Zell-vermittelte Immunantwort gegen die transfizierten Tumorzellen hervorzurufen. Zusätzlich können Tumorzellen, denen MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Moleküle fehlen oder die keine ausreichenden Mengen an MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Molekülen reexprimieren können, mit Nukleinsäure, die das gesamte oder einen Teil (z.B. einen an der cytoplasmatischen Domäne verkürzten Anteil) eines MHC-Klasse-I-a-Ketten-Proteins und β2-Mikroglobulin-Proteins oder eines MHC-Klasse-II-α-Ketten-Proteins und MHC-Klasse-II-β-Ketten-Proteins codiert, transfiziert werden, um dadurch MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Proteine auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Die Expression des geeigneten Klasse-I- oder Klasse-II-MHC in Verbindung mit einem Peptid, das die Aktivität eines B- Lymphozytenantigens (z.B. B7-1, B7-2, B7-3) hat, induziert eine T-Zell-vermittelte Immunantwort gegen die transfizierte Tumorzelle. Gegebenenfalls kann auch ein Gen, das ein Antisense-Konstrukt codiert, das die Expression eines mit MHC Klasse II assoziierten Proteins, wie der Invarianten Kette, blockiert, mit einer DNA, die ein Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozytenantigens codiert, cotransfiziert werden, um die Präsentation tumorassoziierter Antigene zu fördern und eine tumorspezifische Immunität zu induzieren. Somit kann die Induktion einer T-Zell-vermittelten Immunantwort in einem menschlichen Individuum ausreichend sein, um eine tumorspezifische Toleranz in dem Individuum zu überwinden.
  • Die Aktivität eines offenbarten Proteins kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
    Geeignete Assays für Thymozyten- oder Splenozytenzytotoxicität sind u.a., ohne Beschränkung, diejenigen, die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, hrsg. von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128: 1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Bowman et al., J. Virology 61: 1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133: 327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153: 3079-3092, 1994.
  • Assays für T-Zell-abhängige Immunglobulinantworten und Isotyp-Switching (die u.a. Proteine identifizieren, die T-Zell-abhängige Antikörperantworten modulieren und die Th1/Th2-Profile beeinflussen) sind u.a., ohne Beschränkung, diejenigen, die beschrieben sind in: Maliszewski, J. Immunol. 144: 3028-3033, 1990; und Assays der B-Zell-Funktion: In vitro antibody production, Mond, J.J. und Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan Hrsg. Bd. 1 S. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
  • Lymphozytenmischreaktions- (MLR-) Assays (die u.a. Proteine identifizieren, die hauptsächlich Th1- und CTL-Antworten erzeugen) sind u.a., ohne Beschränkung, diejenigen, die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology, hrsg. von J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober, Verl. Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Kapitel 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140: 508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149: 3778-3783, 1992.
  • Auf dendritischen Zellen beruhende Assays (die u.a. Proteine identifizieren, die von dendritischen Zellen exprimiert werden, die naive T-Zellen aktivieren) sind u.a., ohne Beschränkung, diejenigen, die beschrieben sind in: Guery et al., J. Immunol. 134: 536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173: 549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154: 5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nair et al., Journal of Virology 67: 4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264: 961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; und Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172: 631-640, 1990.
  • Assays für Lymphozytenüberleben/-apoptose (die u.a. Proteine identifizieren, die nach der Superantigen-Induktion Apoptose verhindern, und Proteine, die die Lymphozytenhomöostase regulieren) sind u.a., ohne Beschränkung, diejenigen, die beschrieben sind in: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13: 795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7: 659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53: 1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66: 233-243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14: 891-897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1: 639-648, 1992.
  • Assays für Proteine, die frühe Schritte der T-Zell-Widmung und -Entwicklung beeinflussen, sind u.a., ohne Beschränkung, diejenigen, die beschrieben sind in: Antica et al., Blood 84: 111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155: 111-122, 1994; Galy et al., Blood 85: 2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad Sci. USA 88: 7548-7551, 1991.
  • Die erfindungsgemäßen MU-1-Moleküle sind auch an der Modulation der STAT-Aktivität, d.h. der Signalgebung (z.B. durch Interaktion mit STAT-Molekülen, z.B. STAT 3 und/oder STAT 5, and Modulation der STAT-Phosphorylierung) beteiligt. Modulatoren der STAT-Signalgebung und Modulatoren der MU-1-Interaktion mit STAT-Molekülen können durch Screeningassays, wie hier beschrieben, identifiziert werden.
  • Assays, die zur Identifikation von Modulatoren der MU-1-Aktivität verwendet werden können, sind u.a. Assays der STAT-Aktivität, z.B. der STAT-Signalgebung, wie im Stand der Technik bekannte Assays und hier beschriebne Assays. Assays der STAT-Aktivität sind beispielsweise auch beschrieben in Friedrich K. et al. (2001) Biol. Chem. 382(2): 343-51. Weitere Assays der STAT-Aktivität beinhalten Assays der Zellproliferation und der STAT-Phosphorylierung.
  • Unter einem Aspekt der Erfindung ist ein Assay für einen Modulator der MU-1-Aktivität ein zellbasierter Assay, in dem eine Zelle, die ein MU-1-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon exprimiert, mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird und die Fähigkeit der Testverbindung, die MU-1-Aktivität (z.B. die Interaktion mit STAT-Molekülen oder die Modulation der STAT-Signalgebung) zu modulieren, bestimmt wird. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die MU-1-Aktivität zu modulieren, kann erzielt werden, indem beispielsweise die STAT-Signalgebung, die Phosphorylierung von STAT-Molekülen, die Zellproliferation, Zelldifferenzierung oder die Produktion von Cytokinen überwacht wird. Die Zelle kann zum Beispiel aus einem Säuger stammen, z.B. eine aktivierte T-Zelle.
  • Hämatopoese-regulierende Aktivität
  • Ein MU-1-Protein kann zur Regulation der Hämatopoese und folglich zur Behandlung von Defizienzen myeloider oder lymphoider Zellen nützlich sein. Sogar eine marginale biologische Aktivität, die koloniebildende Zellen oder faktorabhängige Zellen unterstützt, zeigt eine Beteiligung an der Regulation der Hämatopoese, z.B. eine Unterstützung des Wachstums und der Proliferation erythroider Vorläuferzellen allein oder in Kombination mit anderen Cytokinen, wodurch sich zum Beispiel eine Nützlichkeit zur Behandlung verschiedener Anämien oder zur Verwendung in Verbindung mit Bestrahlung/Chemotherapie zeigt, um die Produktion erythroider Vorläufer und/oder erythroider Zellen zu stimulieren; eine Unterstützung des Wachstums und der Proliferation myeloider Zellen, wie Granulozyten und Monozyten/Makrophagen (d.h. eine herkömmliche CSF-Aktivität), die sich beispielsweise in Verbindung mit Chemotherapie zur Verhinderung oder Behandlung einer sich dadurch ergebenden Myelosuppression eignet; eine Unterstützung des Wachstums und der Proliferation von Megakaryozyten und folglich von Plättchen, wodurch die Verhinderung oder Behandlung verschiedener Plättchenstörungen, wie Thrombozytopenie, ermöglicht wird, und allgemein zur Verwendung anstelle oder ergänzend zu Plättchentransfusionen; und/oder eine Unterstützung des Wachstums und der Proliferation hämatopoetischer Stammzellen, die in der Lage sind, zu einer oder allen der vorstehend genannten hämatopoetischen Zellen zu reifen, und die daher bei verschiedenen Stammzellstörungen (wie denjenigen, die gewöhnlich mit Transplantation behandelt werden, einschließlich, ohne Beschränkung, aplastischer Anämie und paroxysmaler nocturner Hämoglobinurie) sowie bei der Wiederbesiedlung des Stammzellkompartiments nach Bestrahlung/Chemotherapie entweder in vivo oder ex vivo (z.B. in Verbindung mit Knochenmarkstransplantation oder mit (homologer oder heterologer) peripherer Vorläuferzellentransplantation) als normale Zellen oder für die Gentherapie genetisch manipuliert therapeutische Verwendung finden.
  • Die Aktivität eines MU-1-Proteins kann neben anderen Mitteln durch die folgenden Verfahren gemessen werden:
    Geeignete Assays für die Proliferation und Differenzierung verschiedener hämatopoetischer Linien sind vorstehend angegeben.
  • Assays der Differenzierung embryonaler Stammzellen (die u.a. Proteine identifizieren, die die embryonale Differenzierungshämatopoese beeinflussen) sind u.a. ohne Beschränkung diejenigen, die beschrieben sind in: Johansson et al. Cellular Biology 15: 141-151, 1995; Keller et al., Molecular und Cellular Biology 13: 473-486, 1993; McClanahan et al., Blood 81: 2903-2915, 1993.
  • Assays des Stammzellüberlebens und der Stammzelldifferenzierung (die u.a. Proteine identifizieren, die die Lymphohämatopoese regulieren) sind u.a. ohne Beschränkung diejenigen, die beschrieben sind in: Methylcellulose colony forming assays, Freshney, M.G. in Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. Hrsg. Bd. S. 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with high proliferative potential, McNiece, I.K. und Briddell, R.A. in Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. Hrsg. Bd. S. 23-39, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994; Neben et al., Experimental Hematology 22: 353-359, 1994; Cobblestone area forming cell assay, Ploemacher, R.E. in Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. Hrsg. Bd. S. 1-21, Wiley-Liss, Inc.., New York, NY, 1994; Long term bone marrow cultures in the presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. und Allen, T. in Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. Hrsg. Bd. S. 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994; Long term culture initiating cell assay, Sutherland, H.J. in Culture of Hematopoietic Cells. R.I. Freshney, et al. Hrsg. Bd. S. 139-162, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994.
  • Verwendungen und Eignungen für die Forschung
  • Hier offenbarte Polynukleotide können von der Forschungsgemeinschaft für verschiedene Anwendungen verwendet werden. Die Polynukleotide können zur Expression von Protein zur Analyse, Charakterisierung oder therapeutischen Verwendung; als Marker für Gewebe, in denen das entsprechende Protein bevorzugt (entweder konstitutiv oder auf einer besonderen Stufe der Gewebedifferenzierung oder bei Krankheitszuständen) exprimiert wird; als Molekulargewichtsmarker auf Southern-Gelen; als Chromosomenmarker oder -markierungen (wenn markiert) zur Identifikation von Chromosomen oder zur Kartierung damit zusammenhängender Genpositionen, für den Vergleich mit endogenen DNA-Sequenzen bei Patienten, um potenzielle genetische Erkrankungen zu identifizieren; als Sonden zur Hybridisierung und damit zur Entdeckung neuer, verwandter DNA-Sequenzen; als Quelle von Informationen, mit der PCR-Primer für das genetische Fingerprinting abgeleitet werden können; als Sonde zum "Subtrahieren" bekannter Sequenzen im Verlauf der Entdeckung weiterer neuer Polynukleotide; zur Auswahl und Herstellung von Oligomeren zur Befestigung an einem "Genchip" oder einem anderen Träger, einschließlich zur Untersuchung von Expressionsmustern; zur Erzeugung von Anti-Protein-Antikörpern unter Verwendung von DNA-Immunisierungstechniken; und als Antigen, um DNA-Antikörper zu erzeugen oder eine andere Immunantwort hervorzurufen, verwendet werden. Wenn das Polynukleotid ein Protein codiert, das (wie zum Beispiel bei einer Rezeptor-Ligand-Interaktion) an ein anderes Protein bindet oder potenziell bindet, kann das Polynukleotid auch bei Interaktions-Einfang-Assays (wie zum Beispiel dem in Gyuris et al., Cell 75: 791-803 (1993) beschriebenen) verwendet werden, um Polynukleotide zu identifizieren, die das andere Protein codieren, mit dem die Bindung erfolgt, oder um Inhibitoren der Bindungswechselwirkung zu identifizieren.
  • Die hier offenbarten Proteine können auch in Assays zur Bestimmung der biologischen Aktivität, einschließlich einem Panel mit mehreren Proteinen für das Screening mit hohem Durchsatz; zur Erzeugung von Antikörpern oder um eine andere Immunantwort hervorzurufen; als Reagenz (einschließlich des Markierungsreagenzes) in Assays, die dazu gestaltet sind, die Spiegel des Proteins (oder seines Rezeptors) in biologischen Flüssigkeiten quantitativ zu bestimmen; als Marker für Gewebe, in denen das entsprechende Protein (entweder konstitutiv oder auf einer besonderen Stufe der Gewebedifferenzierung oder -entwicklung oder in einem Krankheitszustand) exprimiert wird; und natürlich zur Isolation korrelativer Rezeptoren oder Liganden verwendet werden. Wenn das Protein (wie zum Beispiel bei einer Rezeptor-Ligand-Interaktion) an ein anderes Protein bindet oder potenziell bindet, kann das Protein auch zur Identifikation des anderen Proteins, mit dem die Bindung erfolgt, oder zur Identifikation von Inhibitoren der Bindungswechselwirkung verwendet werden. Proteine, die an diesen Bindungswechselwirkungen beteiligt sind, können auch für das Screening nach Peptiden oder kleinen Molekülen, die Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung sind, verwendet werden.
  • Jede oder alle dieser Forschungseignungen können bis zur Reagenzqualität oder bis zum Kitformat für die Kommerzialisierung als Forschungsprodukte entwickelt werden.
  • Verfahren zur Durchführung der vorstehend aufgeführten Verwendungen sind dem Fachmann bekannt. Bezugsstellen, die solche Verfahren offenbaren, sind u.a., ohne Beschränkung, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E.F. Fritsch und T. Maniatis Hrsg., 1989, und "Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, Berger, S.L. und A.R. Kimmel Hrsg., 1987.
  • Verwendungen bei der Ernährung
  • Hier offenbarte Polynukleotide und Proteine können auch als Nahrungsquellen oder -ergänzungen verwendet werden. Diese Verwendungen beinhalten, ohne Beschränkung, die Verwendung als Protein- oder Aminosäureergänzung, die Verwendung als Kohlenstoffquelle, die Verwendung als Stickstoffquelle und die Verwendung als Quelle für Kohlenhydrat. In diesen Fällen kann das erfindungsgemäße Protein oder Polynukleotid zu der Nahrung für einen bestimmten Organismus hinzu gegeben oder als getrennte feste oder flüssige Zubereitung, wie in Form von Pulver, Pillen, Lösungen, Suspensionen oder Kapseln, verabreicht werden. Im Fall von Mikroorganismen kann das Protein oder Polynukleotid zu dem Medium gegeben werden, in oder auf dem der Mikroorganismus gezüchtet wird.
  • MU-1-Proteine können auch zur Immunisierung von Tieren verwendet werden, um polyklonale oder monoklonale Antikörper zu erhalten, die spezifisch mit dem MU-1-Protein reagieren und die die Bindung von Liganden an den Rezeptor hemmen können. Solche Antikörper können unter Verwendung des gesamten MU-1 als Immunogen oder unter Verwendung von Fragmenten von MU-1 erhalten werden. Kleinere Fragmente des MU-1 können ebenfalls zur Immunisierung von Tieren verwendet werden. Die Peptidimmunogene können zusätzlich einen Cysteinrest am Carboxylterminus enthalten und werden mit einem Hapten, wie keyhole limpet hemocyanin (KLH), konjugiert. Weitere Peptidimmunogene können durch Ersetzen von Tyrosinresten durch sulfatisierte Tyrosinreste erzeugt werden. Verfahren zur Synthese solcher Peptide sind im Stand der Technik bekannt, wie zum Beispiel in R.P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); J.L. Krstenansky et al., FEBS Lett. 211, 10 (1987).
  • Neutralisierende oder nicht-neutralisierende Antikörper (vorzugsweise monoklonale Antikörper), die an MU-1-Protein binden, können ebenfalls für die Therapeutik bestimmter Tumoren und auch zur Behandlung der vorstehend beschriebenen Zustände nützlich sein. Diese neutralisierenden monoklonalen Antikörper können in der Lage sein, die Ligandenbindung an die MU-1-Rezeptorkette zu blockieren.
  • Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die nicht als beschränkend aufgefasst werden sollten, weiter veranschaulicht.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Isolation und Charakterisierung muriner MU-1-cDNAs:
  • Ein partielles Fragment des murinen Homologs des MU-1-Rezeptors wurde mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden isoliert, die von der humanen Sequenz stammten. cDNA wurde von RNA hergestellt, die von 17 Tage altem murinem Thymus oder aus der murinen 2D6-T-Zelllinie isoliert worden war. Ein DNA-Fragment von etwa 300 Nukleotiden wurde von der cDNA durch PCR mit den folgenden Oligonukleotiden amplifiziert, die den Regionen 584-603 bzw. 876-896 der humanen cDNA-Sequenz in 1 (entsprechend SEQ ID Nr.: 1) entsprechen:
    AGCATCAAGC CGGCTCCCCC (5p)(SEQ ID Nr.: 11)
    CTCCATTCAC TCCAGGTCCC (3p)(SEQ ID Nr.: 12)
  • Die Amplifikation erfolgte unter Verwendung von Taq-Polymerase in 1 x Taq-Puffer mit 1,5 mM Magnesiumchlorid für 30 Zyklen bei 94°C für eine Minute, 50°C für 1 Minute und 72°C für eine Minute. Die DNA-Sequenz dieses Fragments wurde bestimmt, und zwei Oligonukleotide wurden von einem internen Abschnitt dieses Fragments mit den folgenden Sequenzen abgeleitet:
    TTGAACGTGACTGTGGCCTT (5p)(SEQ ID Nr.: 13)
    TGAATGAAGTGCCTGGCTGA (3p)(SEQ ID Nr.: 14)
  • Die Oligonukleotide wurde dazu verwendet, ein internes 262 Nukleotide langes Fragment des ursprünglichen PCR-Produkts (entsprechend den Nukleotiden 781-1043 in der murinen cDNA-Sequenz der 1 und SEQ ID Nr.: 9) zu amplifizieren, das als Hybridisierungssonde für das Screening einer cDNA-Bank, die von der 2D6-T-Zelllinie isoliert wurde, verwendet wurde. Die Filter wurden bei 65°C unter Verwendung von Standard-5-X-SSC-Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und in SSC bei 65°C gewaschen. Bei einem Screen von 426000 Klonen wurden zwanzig Klone isoliert, die mit der Sonde hybridisierten. Die DNA-Sequenz wurde von zwei unabhängigen Klonen bestimmt. Die Volllängensequenz des Klons #6 bestätigte, dass es sich um das murine Volllängenhomolog von humanem MU-1 handelte (SEQ ID Nr.: 9).
  • Die Volllängen-Nukleotidsequenz von murinem MU-1 ist in 1 (entsprechend SEQ ID Nr.: 9) gezeigt. Die Nukleotidsequenz hat eine vorhergesagte Leader-Sequenz bei den Nukleotiden 407-464, eine codierende Sequenz bei den Nukleotiden 407-1993, ein Terminationscodon bei den Nukleotiden 1994-1997. Die Nukleotide 1-406 entsprechen der 5'-untranslatierten Region, und die Nukleotide 1998-2628 entsprechen der 3'-untranslatierten Region.
  • Die vorhergesagte Proteinsequenz des murinen MU-1 ist in 2 dargestellt (entsprechend SEQ ID Nr.: 10). Dieses murine MU-1-Protein enthält eine durch SPScan (Bewertung = 10,1) vorhergesagte Leadersequenz (entsprechend den Aminosäuren 1-19 der SEQ ID Nr.: 10), und eine vorhergesagte Transmembrandomäne (entsprechend den Aminosäuren 237-253 der SEQ ID Nr.: 10). Vorhergesagte Signalmotive sind u.a. die folgenden Regionen: Box 1: Aminosäuren 265-274 der SEQ ID Nr.: 10, Box 2: Aminosäuren 310-324 der SEQ ID Nr.: 10, sechs Tyrosinreste an den Positionen 281, 319, 361, 368, 397 und 510 der SEQ ID Nr.: 10. Potenzielle STAT-Andockstellen sind u.a.: STAT 5: EDDGYPA, STAT 3: YLQR.
  • Beispiel 2: Vergleich von humanem und murinem MU-1:
  • Der GAP-Algorithmus wurde für einen Vergleich der humanen und der murinen MU-1-Aminosäuren verwendet. Ein Vergleich der vorhergesagten murinen und humanen Proteinsequenzen ist in 4 dargestellt. Die Aminosäuren waren unter Verwendung des GAP-Algorithmus zu 65,267 % identisch. Das Alignment wurde durch die BLOSUM62-Aminosäuresubstitutionsmatrix (Henikoff, S. und Henikoff, J.G. (1992), Amino acid substitution matrices from protein Blocks (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)) erzeugt. Gap-Parameter = Gap-Gewicht: 8, Durchschnittliche Übereinstimmung = 2,912, Längengewicht = 2, Durchschnittlicher Mismatch = -2,003. Prozentuale Ähnlichkeit = 69,466.
  • Ein Vergleich der vorhergesagten murinen und humanen cDNA-Nukleotidsequenzen ist in 3 dargestellt. Die DNA-Sequenzen waren unter Verwendung des GAP-Algorithmus zu 66,116 % identisch. Gap-Parameter = Gap-Gewicht: 50, Durchschnittliche Übereinstimmung = 10,000, Längengewicht = 3, Durchschnittlicher Mismatch = 0,000. Prozentuale Ähnlichkeit = 66,198.
  • Sowohl das humane als auch das murine MU-1-Protein sind Mitglieder der Typ-1-Cytokinrezeptor-Superfamilie. Eine Bewertung der Sequenz sowohl von murinem als auch von humanem MU-1 zeigt das Vorliegen potenzieller Box- 1- und Box-2-Signalmotive. Sechs Tyrosinreste sind in der cytoplasmatischen Domäne vorhanden und könnten bei Signalfunktionen von MU-1 wichtig sein. Ein Vergleich der Sequenzen von MU-1 mit anderen Mitgliedern der Familie legte das Vorhandensein potenzieller Andockstellen für STAT 5 und STAT 3 nahe.
  • Beispiel 3: Bestimmung der STAT-Signalwege, die von humanem MU-1 verwendet werden:
  • BAF-3-Zellen wurden derart verändert, dass sie einen chimären Cytokinrezeptor exprimierten, der aus der extrazellulären Domäne des humanen EPO-Rezeptors und der intrazellulären Domäne des MU-1-Rezeptors bestand. BAF-3-Zellen, die die chimären huEPOR/MU-1(cyto)-Rezeptoren exprimierten, proliferierten als Antwort auf humanes lösliches EPO. Diese Zellen wurden analysiert, um zu bestimmen, welche STAT-Moleküle als Antwort auf die EPO-Signalgebung phosphoryliert wurden. Kurz gesagt, ließ man unmodifizierte parentale Kontroll-BAF-3-Zellen und chimäre EPOR/MU-BAF-3-Zellen aus IL-3-haltigem Wachstumsmedium ruhen und restimulierte sie entweder mit IL-3 oder EPO für 0, 15, 30 und 60 Minuten. Die Zellen wurden sedimentiert und in eiskaltem Lysepuffer, der Orthovanadat enthielt, um die phosphorylierten Tyrosine beizubehalten, resuspendiert. Gleiche Mengen an Zelllysat wurden mittels SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt und für die Western-Analyse auf Nitrocellulosemembranen geblottet. Doppelansätze von Blots wurden im Hinblick auf phosphorylierte und nicht phosphorylierte Formen von STAT 1, 3, 5 und 6 unter Verwendung von Antikörpern, die jeweils für die Form des STAT-Moleküls spezifisch waren, angefärbt. HELA-Zellen, die nicht aktiviert oder mit alpha-Interferon aktiviert waren, wurden als positive Kontrollen verwendet.
  • Diese Ergebnisse zeigten, dass unter diesen spezifischen Bedingungen die Signalgebung durch MU-1 an allen getesteten Zeitpunkten (T = 0, T = 15', T = 30', T = 60') zur Phosphorylierung von STAT 5 führte. Die Behandlung von Kontrollen oder der chimären BAF-3-Zellen mit IL-3 führte zur Phosphorylierung von STAT 3, aber nicht von STAT 1 oder 5.
  • Beispiel 4: Gewebeexpression von murinem und humanem MU-1
  • Northern-Analyse
  • Northern-Blots von polyA+-RNA aus verschiedenen Geweben (Clonetech, Palo Alto, CA) wurden wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt. Für die murinen Blots wurde ein 262 Nukleotide langes Fragment entsprechend den Nukleotiden 781-1043 der 1 und SEQ ID Nr.: 9 für die Hybridisierung verwendet.
  • Ein einziges Transkript von murinem MU-1 wurde in adulten murinen Milz-, Lungen und Herzgeweben nachgewiesen. Das in humanen Geweben beobachtete größere Transkript wurde in den Mäusegeweben nicht beobachtet.
  • Zwei Transkripte von humanem MU-1 wurden in adulten humanen Lymphoidgeweben, PBLs, Thymus, Milz und Lymphknoten sowie in fötaler Lunge nachgewiesen.
  • In-Situ-Hybridisierung
  • In-situ-Hybridisierungsstudien wurden von Phylogency Inc. in Columbus, OH (gemäß dem Verfahren von Lyons et al., 1990, J. Cell Biol. 111: 2427-2436.) durchgeführt. Kurz gesagt, wurden serielle 5-7 Mikron dicke Paraffinschnitte deparaffinisiert, fixiert, mit Proteinase K verdaut, mit Triethanolamin behandelt und dehydratisiert. cRNAs wurden von linearisierten cDNA-Matrizen hergestellt, um Antisense- und Sense-Sonden herzustellen. Die cRNR-Transkripte wurden gemäß den Bedingungen des Herstellers (Ambion) synthetisiert und mit 35S-UTP markiert. Die Schnitte wurden über Nacht hybridisiert, stringent gewaschen, mit RNAase A behandelt, in Kernaufspüremulsion getaucht und 2-3 Wochen exponiert. Kontrollschnitte wurden mit Sense-Sonden hybridisiert, um den Hintergrundspiegel des Verfahrens nachzuweisen. Die murine Sonde bestand aus einem 186 Bp großen Fragment entsprechend den Nukleotiden 860-1064 (SEQ ID Nr.: 9). Die humane Sonde war ein 231-bp-PCR-Produkt, das von humaner MU-1-DNA hergestellt worden war.
  • Die Expression von murinem MU-1 wurde in den Lymphknoten des adulten Dünndarms an den Keimzentren und der Muscularis externa beobachtet. Spezialisierte Lymphknoten und Peyer-Plaques zeigten ebenfalls eine Expression von murinem MU-1.
  • Die Expression von humanem MU-1 wurde in Keimzentren der Lymphknoten im Cortex nachgewiesen. Die Medulla, die Makrophagen enthält, war negativ im Hinblick auf humanes MU-1. In menschlicher Milz wurde die Expression von humanem MU-1 in den Regionen der weißen Pulpa, aber nicht der roten Pulpa nachgewiesen.
  • Beispiel 5: Expression von humanem MU-1 in Zellen und Zelllinien:
  • Eine RNAse-Schutz-Analyse wurde an ruhenden und aktivierten humanen T-Zellen und den B-Zelllinien Raji und RPMI 8866 sowie der T-Zelllinie Jurkat durchgeführt. Humane T-Zellen wurden mit Anti-CD3 und Anti-CD28 aktiviert. Die Zelllinien wurden durch Phorbolester und Ionomycin aktiviert. Ein eine MU-1-Ribosonde produzierendes Plasmid wurde durch Insertion eines 231-bp-PCR-Produkts (die PCR erfolgte unter Verwendung des 5'-Primers CACAAAGCTTCAGTATGAGCTGCAGTACRGGAACCGGGGA (SEQ ID Nr.: 15) und des 3'-Primers CACAGGATCCCTTTAACTCCTCTGACTGGGTCTGAAAGAT (SEQ ID Nr.: 16)) in die BamHI- und HindIII-Stellen des pGEM3zf(-)-Vektors (Promega, Madison, WI) konstruiert. Zur Herstellung der Ribosonde wurde das die Ribosonde produzierende Plasmid mit HindIII linearisiert. Die erhaltene DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. T7-RNA-Polymerase wurde zur Herstellung der Ribosonde gemäß dem vom Zulieferer (PharMingen, San Diego, CA) vorgeschlagenen Protokoll verwendet. Der RNAse-Schutz-Assay wurde unter Verwendung des RiboQuant-Multi-Probe-Ribonuclease-Schutz-Assaysystems von PharMingen durchgeführt. Es wurden 2,0 μg Gesamt-RNA in jede RPA-Reaktion gegeben, nach dem RNAse-Verdau wurden die geschützten Ribosonden auf das schnelle Nukleinsäureauftrennsystem QuickPoint (Novex, San Diego, CA) aufgetragen. Die Gele wurden nach den Vorschlägen des Zulieferers getrocknet und exponiert.
  • Die humane MU-1-RNA ist in Anti-CD3+Anti-CD28-stimulierten humanen gereinigten CD3+-Zellen im Vergleich zu unstimulierten Populationen nach oben reguliert. MU-1 ist nach Restimulierung auch in Th- und Th2-verzerrten T-Zell-Populationen nach oben reguliert. Die B-Zelllinien RPMI 8866 und Raji exprimieren MU-1 konstitutiv, die Jurkat-T-Zelllinie jedoch nicht.
  • Beispiel 6: Bindung von humanem MU-1 an bekannte Cytokine
  • Sowohl humane als auch murine Ig-Fusionsproteine wurden konstruiert und an Biacore-Chips immobilisiert, um den Liganden für MU-1 zu identifizieren. Eine Vielzahl zellkulturkonditionierter Medien sowie ein Panel bekannter Cytokine wurden hinsichtlich der Bindung an MU-1 untersucht. Einige Cytokine wurden auch in Kombination mit anderen Rezeptorketten der Familie getestet, um die Möglichkeit in Betracht zu ziehen, dass MU-1 eine zweite Rezeptorkette für die Ligandenbindung benötigt. Die folgenden Cytokine wurde getestet, und es stellte sich heraus, dass sie hinsichtlich der MU-1-Bindung negativ waren: mIL-2, hIL-2, hIL-15, mIL-7, TSLP, TSLP+IL7, TSLP+IL7R, TSLP+IL7g, TSLP+IL-2, TSLP+IL2+IL2Rbeta, IL2Rbeta, IL2Rgamma, IL7R, IL2+2Rbeta, IL2+2Rgamma, IL15+IL2Rbeta, IL15+2Rgamma, IL7+2Rgamma, IL2+IL7R, IL15+IL7R, IL7+IL7R. Es wurden auch bekannte Rezeptoren immobilisiert und mit negativen Ergebnissen hinsichtlich der MUFc-Bindung getestet. IL-15 bindet an IL2Rb, aber nicht an IL2Rg oder MUFc.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001

Claims (5)

  1. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die in der Lage ist, eine Immunerkrankung zu behandeln, umfassend das Prüfen der Fähigkeit der Verbindung, die Interaktion eines MU-1-Polypeptids mit einem STAT-Molekül zu modulieren, wobei dadurch eine Verbindung identifiziert wird, die in der Lage ist, eine Immunerkrankung zu behandeln, wobei es sich bei dem MU-1-Polypeptid um ein Mitglied der MU-1-Proteinfamilie mit einer Aminosäuresequenz handelt, die mindestens 65 % identisch zur Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2 oder 10 ist.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem STAT-Molekül um STAT 3 oder STAT 5 handelt.
  3. Verfahren zur Identifizierung eines Modulators der MU-1-Aktivität, umfassend das in Kontakt bringen einer Zelle, die ein MU-1-Protein entsprechend SEQ ID Nr.: 2 oder 10 exprimiert, oder einen Teil davon, der in der Lage ist, mit STAT-Molekülen zu interagieren, mit einer Testverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der genannten Testverbindung, die Interaktion des genannten MU-1-Proteins, oder des genannten Teils davon, mit einem STAT-Molekül zu modulieren.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem genannten STAT-Molekül um STAT 3 oder STAT 5 handelt.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das MU-1-Protein eines entsprechend SEQ ID Nr.: 2 ist und in der genannten Zelle als Fusion der intrazellulären Domäne von MU-1 und der extrazellulären Domäne des humanen EPO-Rezeptors exprimiert wird.
DE60124954T 2000-05-11 2001-05-11 Mu-1, ein mitglied der cytokine rezeptor familie Expired - Lifetime DE60124954T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56938400A 2000-05-11 2000-05-11
US569384 2000-05-11
PCT/US2001/015395 WO2001085792A2 (en) 2000-05-11 2001-05-11 Mu-1, member of the cytokine receptor family

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60124954D1 DE60124954D1 (de) 2007-01-11
DE60124954T2 true DE60124954T2 (de) 2007-09-20

Family

ID=24275231

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60124954T Expired - Lifetime DE60124954T2 (de) 2000-05-11 2001-05-11 Mu-1, ein mitglied der cytokine rezeptor familie

Country Status (10)

Country Link
EP (2) EP1787997A1 (de)
JP (3) JP2004500845A (de)
AT (1) ATE346864T1 (de)
AU (2) AU2001263088B2 (de)
CY (1) CY1107339T1 (de)
DE (1) DE60124954T2 (de)
DK (1) DK1353953T3 (de)
ES (1) ES2276795T3 (de)
PT (1) PT1353953E (de)
WO (1) WO2001085792A2 (de)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057128A (en) 1998-03-17 2000-05-02 Genetics Institute, Inc. MU-1, member of the cytokine receptor family
ES2629395T3 (es) 2001-10-04 2017-08-09 Genetics Institute, Llc Métodos y composiciones para modular la actividad de la interleucina-21
WO2003064469A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Bayer Healthcare Ag Regulation of human hematopoietin receptor-like protein
MXPA05000655A (es) 2002-07-15 2006-02-22 Harvard College Metodos y composiciones para modular el desarrollo y la funcion de las celulas t helper (th).
EP1449883A1 (de) * 2003-02-18 2004-08-25 Corus Technology BV Verpackungslagen aus Polymer mit besseren Trenneigenschaften
AU2004221876B2 (en) 2003-03-14 2011-05-26 Cambridge Antibody Technology Limited Antibodies against human IL-21 receptor and uses therefor
GT200600148A (es) 2005-04-14 2006-11-22 Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis
AR071885A1 (es) 2008-05-23 2010-07-21 Wyeth Corp Proteinas de union al receptor de interleuquina 21
CA2725154A1 (en) 2008-05-23 2009-11-26 Wyeth Llc Methods of treatment utilizing binding proteins of the interleukin-21 receptor
JP2012504939A (ja) 2008-09-23 2012-03-01 ワイス・エルエルシー 架橋結合タンパク質による活性化シグナルの産生を予測するための方法
WO2015110930A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Pfizer Inc. Modified interleukin 21 receptor proteins

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057128A (en) * 1998-03-17 2000-05-02 Genetics Institute, Inc. MU-1, member of the cytokine receptor family
CA2330547A1 (en) * 1998-06-24 1999-12-29 Chugai Research Institute For Molecular Medicine, Inc. Novel hemopoietin receptor proteins
KR20010085838A (ko) * 1998-09-23 2001-09-07 리스 데브라 케이. 사이토킨 리셉터 ｚａｌｐｈａ11
WO2000069880A1 (en) * 1999-05-18 2000-11-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Il-9/il-2 receptor-like molecules and uses thereof
DE60125543T2 (de) * 2000-04-05 2007-10-04 Zymogenetics, Inc., Seattle Löslicher zytokinrezeptor zalpha11

Also Published As

Publication number Publication date
EP1353953B1 (de) 2006-11-29
JP2009019037A (ja) 2009-01-29
AU2001263088C1 (en) 2001-11-20
CY1107339T1 (el) 2012-12-19
ATE346864T1 (de) 2006-12-15
DK1353953T3 (da) 2007-04-16
AU6308801A (en) 2001-11-20
AU2001263088B2 (en) 2006-07-20
EP1787997A1 (de) 2007-05-23
JP5763518B2 (ja) 2015-08-12
JP2012061009A (ja) 2012-03-29
PT1353953E (pt) 2007-02-28
DE60124954D1 (de) 2007-01-11
EP1353953A2 (de) 2003-10-22
ES2276795T3 (es) 2007-07-01
JP2004500845A (ja) 2004-01-15
WO2001085792A8 (en) 2002-05-23
WO2001085792A2 (en) 2001-11-15
WO2001085792A3 (en) 2003-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69929019T2 (de) Mu-1, ein mitglied der zytokinrezeptor-familie
JP5763518B2 (ja) サイトカインレセプターファミリーのメンバーであるｍｕ−１
US20060223142A1 (en) Extended cDNAs for secreted proteins
DE60036937T2 (de) HUMANE GIL-19/AE289 PROTEINE UND DAFüR KODIERENDE POLYNUKLEOTIDE
WO1998031811A1 (en) Member of the hematopoietin receptor superfamily
US20030049798A1 (en) MU-1, member of the cytokine receptor family
AU2001263088A1 (en) MU-1, member of the cytokine receptor family
AU2003208117B2 (en) MU-1, member of the cytokine receptor family
AU769279B2 (en) U4, a member of the hematopoietin receptor superfamily
MXPA99010596A (en) Mu-1, member of the cytokine receptor family
MXPA00009834A (en) U4, a member of the hematopoietin receptor superfamily
CA2326000A1 (en) Gpi-122, a novel glycophosphatidylinositol-anchored protein

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: DF-MP, 80333 MUENCHEN