KR101669478B1 - 콜라겐의 수득율을 높이는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜라겐의 수득율을 높이는 방법 및 이를 이용하여 제조된 콜라겐에 관한 것이다.
본 발명은 이를 위해 콜라겐의 변성 없이 방사선 조사를 통해 동물유래 조직을 멸균하고 동시에 콜라겐의 수득률을 증가시키기 위해: 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 멸균하는 단계; 상기 멸균된 동물유래 조직을 세척 및 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 조직을 산성 또는 효소 용액과 반응시켜 콜라겐을 분리하는 단계; 이후 염을 첨가하여 콜라겐을 추출하는 단계; 및 이어서 분리된 콜라겐으로부터 염을 제거하는 단계;가 포함된다.
상기와 같이 구성된 본 발명은 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 균과 내독소를 제거함으로써 보존성을 높임과 아울러 콜라겐의 변성 없이 수득률을 높일 수 있도록 한 것이고, 이로 인해 콜라겐의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.

Description

콜라겐의 수득율을 높이는 방법{Method of increasing the yield of collagen}

본 발명의 실시예는 콜라겐의 수득율을 높이는 방법 및 이를 이용하여 제조된 콜라겐에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 균과 내독소를 제거함으로써 보존성을 높임과 아울러 콜라겐의 변성 없이 수득률을 높일 수 있도록 한 것이고, 이로 인해 콜라겐의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 것이다.

주지하다시피 콜라겐(collagen)이란, 포유류와 조류를 포함하는 다양한 동물의 피부·뼈·연골 등의 조직 및 어류의 비늘 등을 구성하는 경단백질로, 현재 20여 가지의 종류가 알려져있으며, 콜라겐 I형이 조직의 대부분을 차지하고 있다.

이러한 콜라겐은 동물의 조직으로부터 효소 분리법, 유기 용매 분리법, 산·알칼리·중성 분리법 등에 의해 추출 및 정제 공정을 거쳐 얻어질 수 있다.

콜라겐의 수득률을 증가시키기 위한 방법들이 연구되고 있으나, 현재로서는 분리공정 기간의 증가 또는 특정 화학물질의 혼합 없이 수득률을 높이기는 어려운 실정이다.

콜라겐은 현재 산업적으로 의약분야, 식품분야, 화장품분야 등에서 다양한 형태로 가공되어 이용되고 있으며, 특히 생체 적합성 및 조직 친화성이 우수하고 생체 내에서 완전히 분해 후 흡수되는 특징에 의해 의약분야에서 크게 각광받고 있다.

의료용 목적으로 콜라겐을 이용하기 위해서는 바이러스 및 세균 등을 포함하는 각종 생물학적 오염원에 대한 안전성이 확보되어야 한다.

오염원을 제거하기 위한 멸균 방식으로는 가열 처리(습식, 건식), 화학적 용매 처리 그리고 방사선 처리 등이 있다.

상기의 방법들은 멸균되는 물질의 특성 변화 또는 독성을 유발할 수 있는 잔류물을 발생하여 사용목적에 적합하지 않은 형태로 콜라겐을 변성시킬 가능성이 있다는 문제점이 발생 되었다.

상기한 문제점을 해결하기 위해 종래에는 아래와 같은 선행기술문헌이 개발되었으나, 여전히 상기한 종래 기술의 문제점을 일거에 해결하지 못하는 커다란 문제점이 발생 되었다.

대한민국 등록특허공보 제0837858호(2008. 06. 05)가 등록된바 있다. 대한민국 공개특허공보 제2012-0084189호(2012. 07. 27)가 공개된바 있다. 대한민국 공개특허공보 제2014-0118763호(2014. 10. 08)가 공개된바 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 제반 문제점을 해소하기 위하여 안출한 것으로, 동물유래 조직에 방사선 조사와 멸균 그리고 세척 및 분쇄 아울러 분리 및 추출 더하여 염을 제거하여 콜라겐의 수득률을 높일 수 있도록 구비됨을 제1목적으로 한 것이고, 상기한 기술적 구성에 의한 본 발명의 제2목적은 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 균과 내독소를 제거함으로써 보존성을 높일 수 있도록 한 것이고, 제3목적은 콜라겐의 변성 없이 수득률을 높일 수 있도록 한 것이며, 제4목적은 조직의 멸균과 콜라겐 수득 증가가 한 가지 공정에 의해 이루어지기 때문에 산업적으로 간편하고 불필요한 에너지 소모를 줄여 경제성 이 있도록 한 것이고, 제5목적은 친환경적이면서 산업적 이용 가능성이 높은 방사선을 이용한 동물유래 조직의 멸균과 콜라겐 수득률을 높일 수 있도록 한 것이며, 제6목적은 이로 인해 콜라겐의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 콜라겐의 수득율을 높이는 방법 및 이를 이용하여 제조된 콜라겐을 제공한다.

이러한 목적 달성을 위하여 본 발명은 콜라겐의 변성 없이 방사선 조사를 통해 동물유래 조직을 멸균하고 동시에 콜라겐의 수득률을 증가시키기 위해: 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 멸균하는 단계; 상기 멸균된 동물유래 조직을 세척 및 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 조직을 산성 또는 효소 용액과 반응시켜 콜라겐을 분리하는 단계; 이후 염을 첨가하여 콜라겐을 추출하는 단계; 및 이어서 분리된 콜라겐으로부터 염을 제거하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 콜라겐의 수득율을 높이는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 방법을 이용하여 제조된 콜라겐을 제공한다.

상기에서 상세히 살펴본 바와 같이 본 발명은 동물유래 조직에 방사선 조사와 멸균 그리고 세척 및 분쇄 아울러 분리 및 추출 더하여 염을 제거하여 콜라겐의 수득률을 높일 수 있도록 한 것이다.

상기한 기술적 구성에 의한 본 발명은 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 균과 내독소를 제거함으로써 보존성을 높일 수 있도록 한 것이다.

그리고 본 발명은 콜라겐의 변성 없이 수득률을 높일 수 있도록 한 것이다.

또한 본 발명은 조직의 멸균과 콜라겐 수득 증가가 한 가지 공정에 의해 이루어지기 때문에 산업적으로 간편하고 불필요한 에너지 소모를 줄여 경제성 이 있도록 한 것이다.

아울러 본 발명은 친환경적이면서 산업적 이용 가능성이 높은 방사선을 이용한 동물유래 조직의 멸균과 콜라겐 수득률을 높일 수 있도록 한 것이다.

본 발명은 상기한 효과로 인해 콜라겐의 품질과 신뢰성을 대폭 향상시키므로 사용자들의 다양한 욕구(니즈)를 충족시켜 좋은 이미지를 심어줄 수 있도록 한 매우 유용한 발명인 것이다.

이하에서는 이러한 효과 달성을 위한 본 발명의 바람직한 실시 예를 첨부된 도면에 따라 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1 은 본 발명에 따른 방사선을 조사하여 멸균된 동물유래 조직으로부터
콜라겐을 분리하는 방법의 일실시예에 의한 공정도.
도 2 는 본 발명에 따라 장기 보존을 위하여 밀봉 후 감마선이 조사된 동물
유래 조직의 도면 대용 사진.
도 3 은 본 발명에 따라 돼지 피부조직에 감마선 조사 후 세균 및 진균의 멸
균 정도의 도표.
도 4 는 본 발명에 따라 오리발 피부조직에 감마선 조사 후 세균 및 진균의
멸균 정도의 도표.
도 5 는 본 발명에 따라 감마선 조사량에 차이를 두어 산 처리 방식에 의해
분리된 콜라겐 수득률에 대한 그래프.
도 6 은 본 발명에 따라 감마선 조사량에 차이를 두어 산 처리 방식에 의해
분리 후 동결 건조한 콜라겐의 도면 대용 사진.
도 7 은 본 발명에 따라 감마선 조사량에 차이를 두어 산 처리 방식에 의해
분리된 콜라겐을 SDS-PAGE로 분석한 도면 대용 사진.

본 발명에 적용된 는 도 1 내지 도 7 에 도시된 바와 같이 구성되는 것이다.

하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다.

그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 설정된 용어들로서 이는 생산자의 의도 또는 관례에 따라 달라질 수 있으므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

또한 도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 임의로 나타내었으므로, 본 발명이 반드시 도면에 도시된 바에 한정되지 않는다.

먼저, 본 발명은 콜라겐의 변성 없이 방사선 조사를 통해 동물유래 조직을 멸균하고 동시에 콜라겐의 수득률을 증가시키기 위해 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 멸균하는 단계를 거친다.

이후 상기 멸균된 동물유래 조직을 세척 및 분쇄하는 단계를 거친다.

이때 상기 방사선이 조사된 동물유래 조직은 증류수와 에탄올을 이용하여 2~6 hr 동안 세척함이 바람직한 것으로, 이는 원료의 외부에 묻어있는 이물을 제거하는 공정으로, 증류수는 특히 혈액, 균을 포함한 기타 이물을 세척하기 위함이고, 에탄올은 지방을 세척하기 위한 공정이다.

이어서 상기 분쇄된 조직을 산성 또는 효소 용액과 반응시켜 콜라겐을 분리하는 단계를 거친다.

이후 염을 첨가하여 콜라겐을 추출하는 단계를 거친다.

이어서 분리된 콜라겐으로부터 염을 제거하는 단계를 거쳐 콜라겐의 수득율을 높이는 방법을 제공한다.

특히 본 발명에 적용된 상기 동물유래 조직은 포유류, 조류, 어류 중에서 선택된 어느 하나가 포함된다.

그리고 상기 방사선은 감마선 또는 전자선이 사용됨이 바람직하다.

이때 상기 방사선은 5 kGy~40 kGy의 조사 선량을 조사함이 바람직하다.

이때 상기 방사선이 5 kGy 이하의 방사선으로는 멸균 효과를 나타낼 수 없으며, 40 kGy 이상의 방사선이 조사되면 조직 특히 콜라겐의 변성을 초래하기 때문에 상기 방사선은 5 kGy~40 kGy의 조사 선량을 조사함이 바람직하다.

그리고 상기 방사선의 선율은 2.7~3.7 kGy/hr을 기준으로 하여 선량(선율 x 시간)을 조정함이 바람직하다.

또한 상기 분쇄된 조직의 입자 크기는 0.1~5.0 mm가 바람직하다.

이때 상기 입자의 크기를 0.1 mm 이하로 만들기 위해서는 분쇄 공정이 길어지고 또한 열이 대량 발생할 가능성이 있고 또한 콜라겐 변성을 초래할 수 있기 때문에 상기 입자의 크기는 0.1 mm 이하가 바람직하고, 입자의 크기가 5.0 mm 이상일 경우 효소나 산에 의해 조직이 분해되기 위해 노출되는 부위가 감소되어(표면적 감소) 콜라겐 분리 수율이 낮아지기 때문에 상기 분쇄된 조직의 입자 크기는 5.0 mm 이하가 바람직하다.

아울러 상기 분쇄된 조직의 입자는 분쇄된 조직의 무게 대비 50배의 산 용액(pH 1.5~3.5)에 조직을 혼합하여 3~7일간 교반함이 바람직하다.

이때 상기 50배 산 용액을 가하는 이유는 조직으로부터 콜라겐을 가장 효율적인 수율로 분리할 수 있는 수준이기 때문이고, pH 가 1.5 이하~3.5 인 이유는 산성 조건에서 활성을 갖는 효소를 사용하기 때문이다. 아울러 산 용액에 의해 조직이 연화되고 이로부터 콜라겐을 분리할 수 있기 때문이며, 교반 시간이 3~7인 이유는 교반을 3일 이하로 하면 콜라겐 수득률이 낮아지고, 7 이상 교반 하여도 수득률이 증가하지 않기 때문으로 즉, 최적의 콜라겐 분리 수율을 얻기 위함이다.

더하여 상기 산성 용액은 인산, 염산, 시트르산, 포름산, 아세트산 수용액 중에서 선택된 어느 하나가 포함됨이 바람직하다.

한편 상기 효소 용액은 펩신, 파파인, 트립신 수용액 중에서 선택된 어느 하나가 사용됨이 바람직하다.

그리고 상기 첨가된 염의 최종 농도는 0.6~1.0 M이 바람직하다.

즉, 콜라겐을 선택적으로 분리하기 위한 염 농도 범위로, 다시 말해 콜라겐의 분자량(100~300 kDa)에 해당하는 단백질들을 선택적으로 분리하기 위한 염 농도이다.

한편 본 발명은 상기의 구성부를 적용함에 있어 다양하게 변형될 수 있고 여러 가지 형태를 취할 수 있다.

그리고 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 특별한 형태로 한정되는 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 오히려 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

상기와 같이 구성된 본 발명 콜라겐의 수득율을 높이는 방법 및 이를 이용하여 제조된 콜라겐의 작용효과를 설명하면 다음과 같다.

우선, 본 발명은 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 균과 내독소를 제거함으로써 보존성을 높임과 아울러 콜라겐의 변성 없이 수득률을 높일 수 있도록 한 것이다.

이를 위해 본 발명은 종래 방법의 문제점을 보완하여 콜라겐의 변성을 일으키지 않고 동물유래 조직의 멸균과 콜라겐 수득률 증가가 동시에 이루어지는 공정으로서 경제적이고 친 환경적이며, 산업적 이용 가능성이 높은 방사선을 이용한 동물유래 조직의 멸균과 콜라겐 수득률 증가방법에 관한 것이다.

본 발명에서 콜라겐이란, 각종 동물의 조직을 산 또는 알칼리 처리를 하거나, 펩신 등의 효소를 처리하여 추출되는 단백질을 말한다.

이하, 첨부된 도면을 참조로 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다.

도 1은 본 발명에 따른 방사선을 조사하여 멸균된 동물유래 조직으로부터 콜라겐을 분리하는 방법의 일실시 예에 의한 공정도이며, 이를 참조하여 방사선을 조사한 콜라겐의 수득방법을 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 콜라겐은,

1) 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 멸균하는 단계;

2) 상기 멸균된 동물유래 조직을 세척 및 분쇄하는 단계;

3) 상기 분쇄된 조직을 산 또는 효소 용액과 반응시켜 콜라겐을 분리하는 단계;

4) 염을 첨가하여 콜라겐을 추출하는 단계;

5) 분리된 콜라겐으로부터 염을 제거하는 단계;

를 통해 제조된다.

본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.

먼저, 동물유래 조직에 5~40 kGy의 방사선을 조사하며, 보다 바람직하게는 5~25 kGy의 방사선을 조사한다. 이때 방사선의 선율은 2.7~3.7 kGy/hr을 기준으로 하여 선량(선율 x 시간)을 조정한다.

이용될 수 있는 동물유래 조직은 포유류, 조류, 어류 등의 다양한 조직을 포함한다.

방사선이 조사된 동물유래 조직은 증류수와 70% 에탄올을 이용하여 2~6 hr 동안 세척하며, 보다 바람직하게는 3~5 hr 동안 세척한다.

세척된 동물유래 조직은 0.1~5.0 mm의 크기로 분쇄하며, 보다 바람직하게는 0.5~3.0 mm로 분쇄한다.

분쇄된 조직의 무게 대비 50배의 산 용액(pH 1.5~3.5)에 조직을 혼합하여 3~7일간 교반하며, 보다 바람직하게는 pH 2.0~2.5의 산 용액에 조직을 혼합하여 4~5일간 교반한다.

이때 산 용액 제조를 위해 인산, 염산, 시트르산, 포름산, 그리고 아세트산 등이 사용 가능하며, 콜라겐을 분리하는 방식에 따라 알칼리 용액을 사용하거나, 단백질 분해 효소(펩신, 파파인 그리고 트립신 등)가 사용될 수 있다.

콜라겐을 추출하기 위해 최종 염 농도가 0.6~1.0 M이 되도록 NaCl을 첨가하며, 보다 바람직하게는 0.7~0.9 M의 NaCl을 첨가한다.

추출된 콜라겐으로부터 염을 제거하기 위해 콜라겐 무게 대비 5~20배의 증류수를 첨가하여 한외여과를 실시하며, 보다 바람직하게는 10~15배의 증류수를 첨가하여 한외여과를 실시한다.

염을 제거하기 위해 콜라겐 용액을 중성화 후 원심분리하는 방식이 대체 적용될 수 있다.

도 2는 본 발명에 따라 장기 보존을 위하여 밀봉 후 감마선이 조사된 동물유래 조직의 도면 대용 사진이다.

도 3은 본 발명에 따라 돼지 피부조직에 감마선 조사 후 세균 및 진균의 멸균 정도의 도표이고, 도 4는 본 발명에 따라 오리발 피부조직에 감마선 조사 후 세균 및 진균의 멸균 정도의 도표이다.

상기와 같은 방사선 조사를 이용하여 멸균된 동물유래 조직을 얻을 수 있으며, 이를 하기의 [실시예 1]을 통해 알아보면 다음과 같다.

증류수에 의해 세척된 돼지 피부 조직이나 오리발 조직에 각각 0, 5, 15, 25 kGy의 감마선을 조사한다.

감마선 조사가 완료된 조직을 취하여 검체 1 g당 등장완충용액 1 mL를 넣어 교반혼합 후 세균 및 진균 배양 고체 배지에 1 mL를 도포한다.

세균은 30~35℃에서 2일간 배양하여 총세균수를 측정하며, 진균은 20~25℃에서 5일간 배양하여 총진균수를 측정한다.

돼지 피부 조직의 경우 5 kGy 이상의 감마선이 조사될 경우 세균 및 진균이 모두 멸균되는 것을 확인하였고, 오리발 조직의 경우 15 kGy 이상의 감마선이 조사될 경우 세균 및 진균이 모두 멸균되는 것을 확인하였다.

도 5는 본 발명에 따라 감마선 조사량에 차이를 두어 산 처리 방식에 의해 분리된 콜라겐 수득률에 대한 그래프이고, 도 6은 본 발명에 따라 감마선 조사량에 차이를 두어 산 처리 방식에 의해 분리 후 동결 건조한 콜라겐의 도면 대용 사진이다.

상기와 같은 제조공정을 통해 동물유래 조직으로부터 콜라겐을 분리할 수 있으며, 이를 하기의 [실시예 2]를 통해 알아보면 다음과 같다.

증류수에 의해 세척된 오리발 조직에 각각 0, 5, 15, 25 kGy의 감마선을 조사한다.

방사선이 조사된 오리발 조직은 증류수로 3회 세척 후 무게 대비 5배 이상의 70% 에탄올에 침지하여 교반하는 방식으로 세척한다.

세척된 오리발 조직을 0.5~3.0 mm 크기로 분쇄 후 분쇄된 조직의 무게 대비 50배의 산 용액(pH 2.0)에 혼합하여 5일간 교반한다.

5일 후 오리발 조직이 분해된 산 용액으로부터 콜라겐을 추출하기 위해 최종 염 농도가 0.9 M이 되도록 NaCl을 첨가한다.

추출된 콜라겐 부피의 5배에 해당하는 증류수를 넣어 재 용해하여 콜라겐 용액을 제조한다.

콜라겐 용액으로부터 염을 제거하기 위해 용액의 pH를 7.0으로 조정 후 원심분리하는 방식을 이용하여 콜라겐을 수득한다.

수득된 콜라겐의 수율(%)은 다음의 수식에 의해 계산되었다.

Y: 수득된 콜라겐의 수율(%)

x: 방사선조사선량(kGy)

그 결과, 15 kGy의 감마선이 조사된 오리발 조직으로부터 분리되는 콜라겐의 수율은 118.3 ±3.9%이고, 25 kGy의 감마선이 조사된 오리발 조직으로부터 분리되는 콜라겐의 수율은 143.2 ±3.8%이었다.

또한, 도 6에 도시된 바와 같이, 분리된 콜라겐을 동결 건조한 결과, 육안으로 구분 가능할 정도로 분리 수율이 확연히 증가되었다.

도 7은 본 발명에 따라 감마선 조사량에 차이를 두어 산 처리 방식에 의해 분리된 콜라겐을 SDS-PAGE로 분석한 도면 대용 사진이다.

상기와 같은 제조공정을 통해 동물유래 조직으로부터 분리된 콜라겐은 SDS-PAGE 분석법을 통해 단백질 분자의 변성 여부를 확인할 수 있으며, 이를 하기의 [실시예 3]를 통해 알아보면 다음과 같다.

각각 0, 5, 15, 25 kGy의 감마선이 조사된 오리발 조직으로부터 분리한 콜라겐은 증류수를 이용하여 10 mg/ml로 희석되었다.

희석된 콜라겐 용액은 5x 샘플 로딩 버퍼(0.3 M Tris-HCl(pH 6.8), 0.1% Bromophenol blue, 10.0% SDS, 50.0% Glycerol, 12.5% β-Mercaptoethanol)와 혼합 후 100℃에서 3분 동안 가열하였다.

제조된 시료는 10.0% 폴리아크릴아마이드 겔의 well당 15 ul씩 로딩되었고, 100 V로 110분간 전기영동하였다.

전기영동이 완료된 겔은 0.3%(w/v) Coomassie brilliant blue-R250을 이용하여 염색하였고, 탈 염색시약(50.0% 증류수, 40.0% 메탄올, 10.0% 아세트산)을 이용하여 배경을 탈색 후 분석하였다.

그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, 감마선이 조사된 모든 샘플에서 타입 I 콜라겐의 특성을 대표하는 α1, α2, β 체인이 관찰되었고, 0~25 kGy 감마선 조사량 범위 내에서 콜라겐의 변성이 일어나지 않음을 확인하였다.

본 발명 콜라겐의 수득율을 높이는 방법 및 이를 이용하여 제조된 콜라겐의 기술적 사상은 실제로 동일결과를 반복 실시 가능한 것으로, 특히 이와 같은 본원발명을 실시함으로써 기술발전을 촉진하여 산업발전에 이바지할 수 있어 보호할 가치가 충분히 있다.

Claims (13)

1. 콜라겐의 변성 없이 방사선 조사를 통해 동물유래 조직을 멸균하고 동시에 콜라겐의 수득률을 증가시키기 위해:
   포유류, 조류, 어류 중에서 선택된 어느 하나의 동물유래 조직에 방사선을 조사하여 멸균하는 단계;가 포함되되,
   상기 방사선이 조사된 동물유래 조직은 증류수와 에탄올을 이용하여 2~6 hr 동안 세척하고,
   상기 멸균된 동물유래 조직을 세척 및 분쇄하는 단계;가 포함되되,
   상기 분쇄된 조직의 입자는 분쇄된 조직의 무게 대비 50배의 산 용액(pH 1.5~3.5)에 조직을 혼합하여 3~7일간 교반하고,
   상기 분쇄된 조직을 인산 또는 염산 수용액 중에서 선택된 어느 하나의 산성 용액과 반응시켜 콜라겐을 분리하는 단계;
   이후 염의 최종 농도가 0.6~1.0 M 첨가하여 콜라겐을 추출하는 단계; 및
   이어서 분리된 콜라겐으로부터 한외여과 또는 중성화 후 원심분리 방식으로 염을 제거하는 단계;가 포함됨을 특징으로 하는 콜라겐의 수득율을 높이는 방법.
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