CN108350061A - 提高胶原蛋白收率的方法以及利用上述方法制造的胶原蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高胶原蛋白收率的方法以及利用上述方法制造的胶原蛋白。本发明为了在不导致胶原蛋白的改性的前提下通过照射放射线而对动物源性组织进行灭菌并同时提高胶原蛋白的收率，包括：通过向动物源性组织照射放射线而对其进行灭菌的步骤；对上述已灭菌的动物源性组织进行洗涤以及粉碎的步骤；通过使上述已粉碎的组织与酸性或酶溶液发生反应而分离出胶原蛋白的步骤；通过添加盐而提取出胶原蛋白的步骤；以及，对已分离出的胶原蛋白进行除盐的步骤。如上所述构成的本发明通过向动物源性组织照射放射线而对菌和内毒素进行去除，能够在提升其可保存性的同时，在不导致胶原蛋白的改性的前提下提高其收率，从而大幅提升胶原蛋白的品质以及可靠性，借此满足使用者的各种需求并留下良好的印象。
Description
技术领域
适用本发明的实施例涉及一种提高胶原蛋白收率的方法以及利用上述方法制造的胶原蛋白，尤其涉及一种通过向动物源性组织照射放射线而对菌和内毒素进行去除，能够在提升其可保存性的同时，在不导致胶原蛋白的改性的前提下提高其收率，从而大幅提升胶原蛋白的品质以及可靠性，借此满足使用者的各种需求并留下良好的印象。
背景技术
众所周知，胶原蛋白(collagen)是构成包括哺乳类和鸟类在内的各种动物的皮肤、骨骼、软骨等组织以及鱼类的鱼鳞等的硬蛋白质，目前已发现的有20多种类型，其中的大部分为I型的胶原蛋白组织。
如上所述的胶原蛋白能够通过酶分离法、有机溶剂分离法、酸法、碱法、中性分离法等，通过提取以及提纯的工程从动物的组织中获得。
虽然已经研究出了用于提高胶原蛋白收率的多种方法，但是目前为止，在不增加分离工程期间或不混合特定化学物质的前提下并不能实现收率的提高。
目前，作为胶原蛋白的产业应用，在医药领域、食品领域、化妆品领域等被加工成多种形态进行使用，尤其是因为其生物相容性以及组织亲和性优秀且能够在生体内被完全分解吸收的特性，在医药领域的备受推崇。
为了能够以医疗用途使用胶原蛋白，需要确保对包括病毒以及细菌等在内的各种生物学性污染源的稳定性。
作为去除污染源的灭菌方法，包括加热处理(湿式、干式)、化学溶剂处理以及放射线处理等。
但是，上述方法会导致可能诱发被灭菌物质的特性变化或毒性的残留物的产生，从而可能会使胶原蛋白发生改性而变成不符合使用目的的形态。
为了解决上述现有问题，目前已经开发出了如下所示的先行技术文献，但是仍然无法有效地一举解决上述现有技术中所存在的问题。
先行技术文献
专利文献
(专利文献1)大韩民国注册专利公报第0837858号(2006.06.05)
(专利文献2)大韩民国公开专利公报第2012-0084189号(2012.07.27)
(专利文献3)大韩民国公开专利公报第2014-0118763号(2014.10.08)
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术中所存在的各种问题而提供一种提高胶原蛋白收率的方法以及利用上述方法制造的胶原蛋白，其第1目的在于通过向动物源性组织照射放射线、灭菌、洗涤以及粉碎、分离以及提取、除盐等步骤提高胶原蛋白的收率；采用上述技术构成的本发明的第2目的在于通过向动物源性组织照射放射线而对菌和内毒素进行去除，从而提升其可保存性；其第3目的在于在不导致胶原蛋白的改性的前提下提高其收率；其第4目的在于通过在一个工程中实现对组织的灭菌以及对胶原蛋白收率的提高，在实现简单的产业应用的同时通过节省不必要的能源消耗而提升其经济性；其第5目的在于利用环保且产业应用性较高的放射线实现对动物源性组织的灭菌以及胶原蛋白收率的提高；其第6目的在于通过上述效果大幅提升胶原蛋白的品质以及可靠性，借此满足使用者的各种需求并留下良好的印象。
为了实现上述目的，本发明提供一种提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：为了在不导致胶原蛋白的改性的前提下通过照射放射线而对动物源性组织进行灭菌并同时提高胶原蛋白的收率，包括：通过向动物源性组织照射放射线而对其进行灭菌的步骤；对上述已灭菌的动物源性组织进行洗涤以及粉碎的步骤；通过使上述已粉碎的组织与酸性或酶溶液发生反应而分离出胶原蛋白的步骤；通过添加盐而提取出胶原蛋白的步骤；以及，对已分离出的胶原蛋白进行除盐的步骤。
此外，本发明提供一种利用上述方法制造的胶原蛋白。
如上所述，本发明能够通过向动物源性组织照射放射线、灭菌、洗涤以及粉碎、分离以及提取、除盐等步骤提高胶原蛋白的收率。
采用上述技术构成的本发明能够通过向动物源性组织照射放射线而对菌和内毒素进行去除，从而提升其可保存性。
此外，本发明能够在不导致胶原蛋白的改性的前提下提高其收率。
此外，本发明能够通过在一个工程中实现对组织的灭菌以及对胶原蛋白收率的提高，在实现简单的产业应用的同时通过节省不必要的能源消耗而提升其经济性。
此外，本发明能够利用环保且产业应用性较高的放射线实现对动物源性组织的灭菌以及胶原蛋白收率的提高。
本发明能够通过如上所述的效果大幅提升胶原蛋白的品质以及可靠性，借此满足使用者的各种需求并留下良好的印象，是一种非常有用的发明。
接下来，结合附图对用于实现上述效果的适用本发明的较佳实施例进行详细的说明如下。
附图说明
图1是适用本发明之一实施例的从通过照射放射线进行灭菌的动物源性组织分离出胶原蛋白的方法的工程图。
图2是在本发明中为了长期保存而密封之后照射伽马射线的动物源性组织的照片。
图3是在本发明中向猪皮肤组织照射伽马射线之后的细菌以及真菌的灭菌程度的图表。
图4是在本发明中向鸭脚皮肤组织照射伽马射线之后的细菌以及真菌的灭菌程度的图表。
图5是在本发明中在不同的伽马射线照射剂量下通过酸处理方式分离出的胶原蛋白收率的图表。
图6是在本发明中在不同的伽马射线照射剂量下通过酸处理方式分离之后冻结干燥的胶原蛋白的照片。
图7是在本发明中利用SDS-PAGE法对在不同的伽马射线照射剂量下通过酸处理方式分离出的胶原蛋白进行分析的照片。
具体实施方式
本发明的构成如图1至图7所示。
在接下来对本发明进行说明的过程中，当判定对相关公知功能或构成的具体说明可能会导致本发明的要旨变得不清晰时，将省略其详细的说明。
此外，后续使用的术语是在考虑到其在本发明中的功能的前提下所设定的术语，可能会根据生产者的意图或惯例而有所不同，因此应以整个说明书中的内容为基础做出定义。
此外，附图中所图示的各个构成的大小以及厚度是为了说明的便利而随意图示，本发明并不限定于附图中所图示的状态。
首先，本发明为了在不导致胶原蛋白的改性的前提下通过照射放射线而对动物源性组织进行灭菌并同时提高胶原蛋白的收率，执行通过向动物源性组织照射放射线而对其进行灭菌的步骤。
接下来，执行对上述已灭菌的动物源性组织进行洗涤以及粉碎的步骤。
此时，利用蒸馏水和乙醇对上述已照射放射线的动物源性组织进行2～6小时的洗涤处理为宜，这是用于去除附着在原材料外部的异物的工程，尤其是，蒸馏水是用于对包括血液、菌在内的其他异物进行洗涤，而乙醇是用于对脂肪进行洗涤的工程。
接下来，执行通过使上述已粉碎的组织与酸性或酶溶液发生反应而分离出胶原蛋白的步骤。
接下来，执行通过添加盐而提取出胶原蛋白的步骤。
接下来，执行对已分离出的胶原蛋白进行除盐的步骤，从而提供可提高胶原蛋白收率的方法。
尤其是，适用于本发明的上述动物源性组织，包括从哺乳类、鸟类、鱼类中选择的某一种。
此外，作为上述放射线使用伽马射线或电子射线为宜。
此时，上述放射线以5kGy至40kGy的照射剂量进行照射为宜。
此时，当上述放射线的照射剂量小于5kGy时将无法得到灭菌效果，而当照射剂量大于40kGy时将会导致组织尤其是胶原蛋白的改性，因此上述放射线以5kGy至40kGy的照射剂量进行照射为宜。
此外，关于上述放射线的剂量率，以2.7至3.7kGy/小时为基准对其剂量(剂量率×时间)进行调整为宜。
此外，上述已粉碎组织的粒子大小为0.1～5.0mm为宜。
此时，为了将上述粒子的大小制作成0.1mm以下，可能会导致粉碎工程时间变长、产生大量的热量、胶原蛋白的改性等问题，因此上述粒子的大小大于0.1mm为宜，而当粒子的大小大于5.0mm时，会因为在利用酶或酸对组织进行分解时所裸露的部位的减少(表面积的减少)而导致胶原蛋白的分离收率下降的问题，因此上述已粉碎组织的粒子大小小于5.0mm为宜。
此外，将上述已粉碎组织的粒子混合到所粉碎组织的50倍重量的酸溶液(pH 1.5至3.5)中并进行3至7天的搅拌为宜。
此时，添加上述50倍重量的酸溶液的原因在于，这是能够以最有效的收率从组织分离出胶原蛋白的水准，而将pH设置为1.5至3.5的原因在于，使用的是在酸性条件下具有活性的酶。此外，还因为酸溶液能够使组织发生软化并从中分离出胶原蛋白，而将搅拌时间设置为3至7天的原因在于，当搅拌时间不足3天时会导致胶原蛋白收率的降低，而当搅拌时间超过7天时并不能提高其收率，即，是为了实现最佳的胶原蛋白分离收率。
此外，上述酸性溶液包括从磷酸、盐酸、柠檬酸、甲酸、乙酸水溶液中选择的某一种为宜。
此外，上述酶溶液使用从胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水溶液中选择的某一种为宜。
此外，上述添加盐之后的最终浓度为0.6至1.0M为宜。
即，这是用于选择性地分离出胶原蛋白的盐浓度范围，换言之，是用于选择性地分离出与胶原蛋白的分子量(100至300kDa)对应的蛋白质的盐浓度。
此外，本发明在适用上述构成部时能够进行各种变形并采取各种形态。
此外，本发明并不应理解为限定于在上述内容中详细说明的特定形态，而是应理解为包含由所附的权利要求书的范围所定义的本发明的精神以及范围内的所有变形物、均等物以及替代物。
接下来，对如上所述构成的适用本发明的提高胶原蛋白收率的方法以及利用上述方法制造的胶原蛋白的作用和效果进行详细说明如下。
首先，本发明通过向动物源性组织照射放射线而对菌和内毒素进行去除，能够在提升其可保存性的同时，在不导致胶原蛋白的改性的前提下提高其收率。
为此，本发明涉及一种通过对现有方法中的问题进行改善，借助于能够在不导致胶原蛋白的改性的前提下同时实现对动物源性组织的灭菌以及胶原蛋白收率的提高的工程，利用环保且产业应用性较高的放射线实现对动物源性组织的灭菌以及胶原蛋白收率的提高的方法。
在本发明中，胶原蛋白是指通过对各种动物的组织进行酸处理、碱处理或胃蛋白酶等酶处理而提取出的蛋白质。
接下来，结合附图对适用本发明的实施例进行详细说明如下。
图1是适用本发明之一实施例的从通过照射放射线进行灭菌的动物源性组织分离出胶原蛋白的方法的工程图，结合图1对照射放射线的胶原蛋白的获取方法进行说明如下。
适用本发明的胶原蛋白，是通过下述步骤制造。
通过向动物源性组织照射放射线而对其进行灭菌的步骤；
对上述已灭菌的动物源性组织进行洗涤以及粉碎的步骤；
通过使上述已粉碎的组织与酸或酶溶液发生反应而分离出胶原蛋白的步骤；
通过添加盐而提取出胶原蛋白的步骤；以及，
对已分离出的胶原蛋白进行除盐的步骤。
接下来，按照步骤对适用本发明的方法进行详细说明如下。
首先，向动物源性组织照射5至40kGy的放射线，较佳地，照射5至25kGy的放射线。此时，关于放射线的剂量率，以2.7至3.7kGy/小时为基准对其剂量(剂量率×时间)进行调整。
可使用的动物源性组织，包括哺乳类、鸟类、鱼类等的各种组织。
利用蒸馏水和70％的乙醇对已照射放射线的动物源性组织进行2至6小时的洗涤处理，较佳地，进行3至5小时的洗涤处理。
将已洗涤的动物源性组织粉碎成0.1至5.0mm的大小，较佳地，粉碎成0.5至3.0mm的大小。
将组织混合到所粉碎组织的50倍重量的酸溶液(pH 1.5至3.5)中并进行3至7天的搅拌，较佳地，将组织混合到pH 2.0至2.5的酸溶液并进行4至5天的搅拌。
此时，能够使用磷酸、盐酸、柠檬酸、甲酸以及乙酸等制造酸溶液，且能够根据分离胶原蛋白的方法使用碱溶液、蛋白质分解酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及胰蛋白酶)等。
为了提取出胶原蛋白，添加NaCl直至最终的盐浓度达到0.6至1.0M，较佳地，添加NaCl到0.7至0.9M。
为了对所提取出的胶原蛋白进行除盐，添加胶原蛋白重量的5至20倍的蒸馏水执行超滤处理，较佳地，添加10至20倍的蒸馏水执行超滤处理。
在进行除盐时，也能够代替使用对胶原蛋白溶液进行中性化之后执行离心分离的方式。
图2是在本发明中为了长期保存而密封之后照射伽马射线的动物源性组织的照片。
图3是在本发明中向猪皮肤组织照射伽马射线之后的细菌以及真菌的灭菌程度的图表，图4是在本发明中向鸭脚皮肤组织照射伽马射线之后的细菌以及真菌的灭菌程度的图表。
通过如上所述的照射放射线的方式，能够得到已灭菌的动物源性组织。接下来，结合【实施例1】进行详细说明如下。
【实施例1】
向利用蒸馏水进行洗涤之后的猪皮肤组织或鸭脚组织分别照射0、5、15、25kGy的伽马射线。
采集已完成伽马射线照射的组织并按照每1g被检体添加1mL的比例添加等渗缓冲溶液并进行搅拌混合，然后将1mL的混合物涂布在细菌及真菌培养固体培养基中。
细菌是在30至35℃条件下进行2天的培养并对细菌总数进行测定，而真菌是在20至35℃条件下进行5天的培养并对真菌总数进行测定。
在猪皮肤组织中可以发现，在照射5kGy以上的伽马射线时细菌以及真菌被全部杀灭，而在鸭脚组织中可以发现，在照射15kGy以上的伽马射线时细菌以及真菌被全部杀灭。
图5是在本发明中在不同的伽马射线照射剂量下通过酸处理方式分离出的胶原蛋白收率的图表，图6是在本发明中在不同的伽马射线照射剂量下通过酸处理方式分离之后冻结干燥的胶原蛋白的照片。
通过如上所述的制造工程，能够从动物源性组织分离出胶原蛋白。接下来，结合【实施例2】进行详细说明如下。
【实施例2】
向利用蒸馏水进行洗涤之后的鸭脚组织分别照射0、5、15、25kGy的伽马射线。
在利用蒸馏水对已照射放射线的鸭脚组织进行3次洗涤之后，将其浸渍到5倍重量以上的70％乙醇中并通过搅拌的方式进行洗涤。
将已洗涤的鸭脚组织粉碎成0.5至3.0mm的大小之后，混合到所粉碎组织的50倍重量的酸溶液(pH 2.0)中并进行5天的搅拌。
5天之后为了从鸭脚组织被分解的酸溶液中提取出胶原蛋白，添加NaCl直至最终的盐浓度达到0.9M。
向所提取出的胶原蛋白添加5倍体积的蒸馏水进行再溶解，从而制造出胶原蛋白溶液。
为了对胶原蛋白溶液进行除盐，将溶液的pH调整至7.0之后通过离心分离的方式获取胶原蛋白。
通过如下所示的公式对所获取到的胶原蛋白的收率(％)进行计算。
Yx＝(所提取出的胶原蛋白的重量(x kGy)/所提取出的胶原蛋白的重量(0kGy))×100
Y：所获取到的胶原蛋白的收率(％)
X：放射线照射剂量(kGy)
其结果显示，从照射15kGy的伽马射线的鸭脚组织中分离出的胶原蛋白的收率为118.3±3.9％，而从照射25kGy的伽马射线的鸭脚组织中分离出的胶原蛋白的收率为143.2±3.8％。
此外，如图6所示，通过对所分离出的胶原蛋白进行冻结干燥的结果可以发现，其分离收率的增加达到了可通过肉眼明确分辨的程度。
图7是在本发明中利用SDS-PAGE法对在不同的伽马射线照射剂量下通过酸处理方式分离出的胶原蛋白进行分析的照片。
通过如上所述的制造工程从动物源性组织分离出的胶原蛋白，能够通过SDS-PAGE分析法确认其蛋白质分子是否发生改性。接下来，结合【实施例3】进行详细说明如下。
【实施例3】
利用蒸馏水将从分别照射0、5、15、25kGy的伽马射线的鸭脚组织分离出的胶原蛋白稀释到以10mg/ml。
将所稀释的胶原蛋白溶液与5×加样缓冲液(0.3M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH 6.8)，0.1％溴酚蓝(Bromophenol blue)，10.0％SDS,50.0％丙三醇(Glycerol)，12.5％β-巯基乙醇(Mercaptoethanol))进行混合之后，在100℃条件下进行3分钟的加热处理。
向10.0％聚丙烯酰胺凝胶的每个加样孔添加15ul的试料，并在100V的条件下进行110分钟的电泳处理。
利用0.3％(w/v)的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)-R250对已完成电泳处理的凝胶进行染色，并在利用脱色试剂(50.0％蒸馏水，40.0％甲醇，10.0％乙酸)对背景进行脱色之后执行分析。
其结果如图10所示，在照射伽马射线的所有样品中均观察到了代表I型胶原蛋白的特性的α1、α2、β链，且在0至25kGy的伽马射线照射剂量范围内没有发生胶原蛋白的改性。
产业可用性
适用本发明的提高胶原蛋白收率的方法以及利用上述方法制造的胶原蛋白的技术思想实际上能够反复实施相同的结果，尤其是通过实施如上所述的本发明能够促进技术发展并为产业的发展做出贡献，因此具有充分的保护价值。
Claims (13)
1.一种提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
为了在不导致胶原蛋白的改性的前提下通过照射放射线而对动物源性组织进行灭菌并同时提高胶原蛋白的收率，包括：
通过向动物源性组织照射放射线而对其进行灭菌的步骤；
对上述已灭菌的动物源性组织进行洗涤以及粉碎的步骤；
通过使上述已粉碎的组织与酸性或酶溶液发生反应而分离出胶原蛋白的步骤；
通过添加盐而提取出胶原蛋白的步骤；以及，
对已分离出的胶原蛋白进行除盐的步骤。
2.根据权利要求1所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述动物源性组织，
包括从哺乳类、鸟类、鱼类中选择的某一种。
3.根据权利要求1所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述放射线，
是伽马射线或电子射线。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述放射线，
以5kGy至40kGy的照射剂量进行照射。
5.根据权利要求4所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述放射线的剂量率，以2.7至3.7kGy/小时为基准对其剂量(剂量率×时间)进行调整。
6.根据权利要求1所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述已粉碎组织的粒子大小为0.1至5.0mm。
7.根据权利要求1或权利要求6所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述已粉碎组织的粒子，
混合到所粉碎组织的50倍重量的酸溶液(pH 1.5至3.5)中并进行3至7天的搅拌。
8.根据权利要求1所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述酸性溶液，
包括从磷酸、盐酸、柠檬酸、甲酸、乙酸水溶液中选择的某一种。
9.根据权利要求1所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述酶溶液，
包括从胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水溶液中选择的某一种。
10.根据权利要求1所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述添加盐之后的最终浓度为0.6至1.0M。
11.根据权利要求1所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
利用蒸馏水和乙醇对上述已照射放射线的动物源性组织进行2～6小时的洗涤处理。
12.根据权利要求1所述的提高胶原蛋白收率的方法，其特征在于：
上述进行除盐的步骤，
采用超滤或在中性化之后的离心分离的方式。
13.根据权利要求1至权利要求12中的某一项的方法制造的胶原蛋白。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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