CN101874903A - 一种胶原蛋白人工皮肤的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纯天然胶原蛋白人工皮肤的制备方法。根据天然皮肤胶原蛋白丰富及异种胶原蛋白免疫原性低、生物相容性好、能诱导组织再生的特点，先制备高浓度动物胶原蛋白溶液，然后与一定比例的增塑剂充分混合，将混合液倒入平底盘中自流成薄膜，冷冻干燥即为具有较好粘性、弹性和多孔隙的人工皮肤。用本法制备出的人工皮肤具有临床广泛应用的猪皮人工皮肤和同种异体皮肤的优越性能，同时克服了其免疫排斥反应和价格昂贵、来源受限的缺陷，提高了胶原蛋白膜的粘性和弹性，且具有能透气隔菌的微小气孔，可为临床提供一种性能优越、价格适中的新型人工皮肤产品，用于烧、烫伤及创伤引起的皮肤缺损治疗，保持创面干净，有效控制疼痛，并能诱导自体皮肤修复，突破制约皮肤缺损治疗成功率的“瓶颈”——供皮不足。
Description
技术领域
本发明涉及一种纯天然胶原蛋白人工皮肤的制备方法，用于烧、烫伤及创伤引起的皮肤缺损治疗，覆盖创面和供皮区，保持创面干净，有效控制疼痛，并能诱导自体皮肤修复，属于生物医药及材料科学技术领域。
背景技术
皮肤是人体的最大器官，自体皮移植是治疗皮肤缺损最有效的方法，但大面积的皮肤缺损常使得自体皮供应不足，是制约大面积烧、烫、创伤皮肤治疗成功率的“瓶颈”。人工皮肤作为一种皮肤创伤修复材料和损伤皮肤的替代品，可以使皮肤大面积和深度烧伤的患者，在自体皮不够的情况下，覆盖创面并使之恢复因皮肤创伤丧失的生理功能。
临床烧伤科常用无菌纱布覆盖切痂后的创面，但纱布不能降解吸收，不能诱导皮肤组织再生修复且与创面粘结，除去纱布时给病人带来很大痛苦。
最理想的皮肤创面覆盖物应当具有以下性质：无抗原性、可作为细菌屏障、较好的柔韧性、能诱导自体皮肤再生、支架最终被降解、可适应不规则创口表面、易于保存、一次手术即可完成移植、价格不昂贵。符合上述条件的皮肤替代物目前还未存在。
为克服自体供皮不足的困难，从自愿捐献者获得的同种异体皮是最常用的暂时代用品，经过加工处理后，用液氮冰冻保存，当需要时，异体皮被迅速解冻应用，异体皮将为烧伤创面提供暂时的生物敷料，并与宿主建立短暂的血运，直到宿主识别出异体皮上面表达的外源性抗原表面物质，启动机体的免疫机制，产生排斥反应。但异体皮不易获得，处理和储藏成本较高，只能为创面提供暂时的覆盖，受体也常面临病毒感染的威胁。临床上也使用猪皮作为人工皮肤，被加工后制成膜片或筛网状的均质真皮结构，用于暂时覆盖清洁创面、浅II0伤口和供皮区，保持创面干净并有效控制疼痛，但它们最终要被排斥，又由于其原料来源的个体差异，导致产品的均一性及可重复性较差，至今尚无批量上市产品。
也有用不同的材料制成的人工合成膜作为人工皮肤。明胶海绵是最早使用的止血吸收敷料，但其引导细胞生长性能不如胶原。多糖类如甲壳糖，糖胺多糖，透明质酸等类材料有促进细胞生长的功能，例如甲壳糖有消炎杀菌、促角质细胞生长作用，为良好的细胞生长基质材料，但随着用量增加，有抑制成纤维细胞生长的作用，同时材料的弹性低，质脆。聚氨酯，涤纶，尼龙，硅橡胶等为生物惰性材料，不降解，不能进行生理代谢，只能用做外层敷料。乙丙交酯等生物降解材料，可降解，可代谢，但如果其分子量小则强度不够，分子量大难溶于水，溶解时出现降解，影响材料的机械强度，并且其降解之后的产物使其周围组织酸度提高，出现无菌性炎症。
胶原蛋白为人工皮肤的重要组分，是细胞分化、生长的营养基质，有增加结缔组织修复和再生的作用，但其存在的缺点是无弹性、强度低。常用的戊二醛交联法可稍微增加其强度，但导致脆性大大增加，且残留的戊二醛对皮肤、黏膜有刺激性和致敏作用，有致癌、致畸的可能。
随着组织工程学的发展，种植细胞的复合人工皮肤的研究已成为近年来研究的热点，但仍停留在实验室探索阶段，离产业化还有很远的距离。
发明内容
本发明的目的是提出一种纯天然胶原蛋白人工皮肤的制备方法，其制备的人工皮肤无免疫排斥反应，成本低廉，原料来源广泛，具有较好的粘性、弹性和透气隔菌的微小气孔，用于覆盖皮肤缺损区作为表皮、真皮的临时替代物，保持创面干净并有效控制疼痛，诱导自体皮肤再生修复。
本发明提出的纯天然胶原蛋白人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备胶原蛋白溶液：取哺乳动物的肌腱，去除油脂，用灭菌溶液浸泡消毒灭菌，取出后漂洗干净，然后将肌腱浸泡于体积百分比为1～5％的酸溶液中，并加入胃蛋白酶溶液，使每毫升酸溶液中的胃蛋白酶为20～25国际活性单位，摇晃混匀，在室温下浸泡至溶液粘度为700～1000cp(厘泊)，过滤除渣得高浓度胶原蛋白溶液；
(2)在上述胶原蛋白溶液中按1～5％的体积比加入增塑剂(即每毫升胶原溶液中加入0.01～0.05毫升的增塑剂)，混合后倒入一平面上自流成0.1～0.5mm的薄膜；
(3)将上述薄膜冷冻干燥；
(4)将冻干后的薄膜以15～20kGy剂量60Co辐照灭菌。
本发明的有益效果：本发明根据天然皮肤胶原蛋白丰富及异种胶原蛋白免疫原性低、生物相容性好、能诱导组织再生的特点，采用最简便的方法提取出高纯度的动物胶原蛋白，制备出的人工皮肤既具有猪皮人工皮肤和同种异体皮肤的优越性能，同时克服了其免疫排斥反应(经本发明提出的工艺，胶原蛋白的免疫原性已被去除)、价格昂贵和来源受限的缺陷，通过加入适当比例的增塑剂大大提高了胶原蛋白膜的弹性和韧性，且提高了其对创面的粘附性。独特的冷冻干燥工艺使其具有透气隔菌的微小气孔，且大幅度地节省了生产时间和能耗，达到产品质量的均一性和可重复性，可实现批量生产，成本大大降低。本发明可望为临床提供一种性能优越、价格适中的新型人工皮肤产品，用于烧、烫伤及创伤引起的皮肤缺损治疗，保持创面干净，有效控制疼痛，并能诱导自体皮肤修复。把肌腱去除油脂后用灭菌溶液浸泡消毒灭菌，而不用其他方式消毒灭菌，是为了防止蛋白质变性。
制备胶原蛋白溶液均在无菌条件下进行，也就是说，用灭菌溶液浸泡肌腱消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水充分漂洗，然后将肌腱浸泡于已灭菌的酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已除菌的胃蛋白酶溶液，并置于无菌环境下不断摇晃混匀。该严格的无菌工艺使产品的热源(内毒素)含量控制在很低水平。
肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的酸溶液中，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡至适宜粘度即过滤除渣得高浓度胶原蛋白溶液。避免了敞开搅拌带来的微生物污染，无需粉碎、盐析、透析等工艺步骤既可大大节省成本，又有利于大批量生产。
优选的冷冻干燥的具体过程为：先将上述薄膜在-15℃至-25℃下预冻6小时以上，然后置于冷冻干燥机中在冷冻仓的温度保持在15～32℃下抽真空升华18～24小时，然后去真空出冷冻仓。
抽真空干燥前将上述胶原蛋白薄膜在-15℃至-25℃冰箱中预冻，即可保证冰冻的透彻、避免在随后的真空干燥中塌陷变形，又大大地节省了能耗。常规方法是在冻干机中预冻的，这样会多消耗大量能源。
辐照灭菌时，将辐照剂量控制在15～20kGy既保证了产品灭菌的彻底，又减轻了对蛋白质的损伤，避免产品发黄、变脆。
具体实施方式
实施例1
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的猪腿肌腱25g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用洗洁精清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用84消毒液浸泡15分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml1％的乙酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已除菌的40000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升乙酸溶液中的胃蛋白酶为20国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡24小时至溶液粘度为700cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取0.5ml聚乙二醇(分析纯)加入50毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入22×15×3cm不锈钢平底盘中自流成0.1mm的薄膜。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-22℃冰箱中预冻6小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华18小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在28℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按5×3cm规格裁切后用医用级塑料膜密封、包装后送辐照中心以15kGy剂量60Co辐照灭菌。
实施例2
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的牛腿的肌腱30g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用0.1N的NaoH溶液清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用2％戊二醛溶液浸泡18分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 3％的磷酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的44000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升磷酸溶液中的胃蛋白酶为22国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡18小时至溶液粘度为750cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取1ml山梨醇(分析纯)加入80毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入22×15×3cm不锈钢平底盘中自流成0.2mm的薄膜，多余的溶液吸出备用。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-17℃冰箱中预冻8小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华20小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在30℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按10×6cm规格裁切后用医用级铝箔膜密封、包装后送辐照中心以17kGy剂量60Co辐照灭菌。
实施例3
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的马腿的肌腱35g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用洗洁精清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用0.4％的过氧乙酸溶液浸泡20分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 2％的盐酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的48000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升盐酸溶液中的胃蛋白酶为24国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡12小时至溶液粘度为800cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取5ml甘油(丙三醇)加入100毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入22×15×3cm不锈钢平底盘中自流成0.3mm的薄膜，多余的溶液吸出备用。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-20℃冰箱中预冻10小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华24小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在25℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按10×5cm规格裁切后用医用级塑料膜密封、包装后送辐照中心以18kGy剂量60Co辐照灭菌。
实施例4
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的羊腿的肌腱50g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用洗洁精清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用11倍稀释的新洁尔灭溶液浸泡25分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 4％的硫酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的50000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升硫酸溶液中的胃蛋白酶为25国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡10小时至溶液粘度为850cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取6ml木糖醇(分析纯)加入200毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入25×15×3cm不锈钢平底盘中自流成0.5mm的薄膜，多余的溶液吸出备用。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-16℃冰箱中预冻12小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华22小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在32℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按8×4cm规格裁切后用医用级铝箔膜密封、包装后送辐照中心以20kGy剂量60Co辐照灭菌。
实施例5
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的狗腿的肌腱50g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用洗洁精清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用0.5％洗必泰(氯己定)溶液浸泡15分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 5％的硝酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的46000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升硝酸溶液中的胃蛋白酶为23国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡10小时至溶液粘度为1000cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取8ml乙二醇(分析纯)加入200毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入25×15×3cm不锈钢平底盘中自流成0.2mm的薄膜，多余的溶液吸出备用。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-18℃冰箱中预冻7小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华21小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在20℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按8×4cm规格裁切后用医用级塑料膜密封、包装后送辐照中心以16kGy剂量60Co辐照灭菌。
实施例6
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的驴腿的肌腱45g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用洗洁精清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用70％的乙醇溶液浸泡30分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 4％的磷酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的50000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升磷酸溶液中的胃蛋白酶为25国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡10小时至溶液粘度为900cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取10ml新戊二醇(分析纯)加入200毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入22×12×3cm不锈钢平底盘中自流成0.4mm的薄膜，多余的溶液吸出备用。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-15℃冰箱中预冻11小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华24小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在15℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按7×3.5cm规格裁切后用医用级塑料膜密封、包装后送辐照中心以16.5kGy剂量60Co辐照灭菌。
实施例7
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的骡腿的肌腱45 g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用0.1N的NaoH溶液清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用70％的乙醇溶液浸泡30分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 4％的乙酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的50000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升乙酸溶液中的胃蛋白酶为25国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡10小时至溶液粘度为900cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取10ml季戊四醇(分析纯)加入200毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入22×12×3cm不锈钢平底盘中自流成0.4mm的薄膜，多余的溶液吸出备用。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-25℃冰箱中预冻11小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华24小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在15℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按7×3.5cm规格裁切后用医用级塑料膜密封、包装后送辐照中心以16.5kGy剂量60Co辐照灭菌。
实施例8
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的鹿腿的肌腱40g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用0.1N的NaoH溶液清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用70％的乙醇溶液浸泡30分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 4％的乙酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的48000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升乙酸溶液中的胃蛋白酶为24国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡10小时至溶液粘度为1000cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取10ml季戊四醇(分析纯)加入200毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入22×12×3cm不锈钢平底盘中自流成0.4mm的薄膜，多余的溶液吸出备用。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-23℃冰箱中预冻11小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华24小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在15℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按7×3.5cm规格裁切后用医用级塑料膜密封、包装后送辐照中心以16.5kGy剂量60Co辐照灭菌。
实施例9
(1)胶原蛋白溶液的制备
取经检疫后合格的兔腿的肌腱50g，仔细剔除脂肪、肌肉组织后用洗洁精清洗以彻底去除油脂，然后用自来水漂洗4次，用0.5％洗必泰(氯己定)溶液浸泡15分钟消毒灭菌，取出后用已灭菌的去离子水漂洗4次，肌腱不必粉碎直接浸泡于已灭菌的2000ml 5％的硝酸溶液中(容器需事先经灭菌处理)，并加入已过滤除菌的46000U(国际单位)胃蛋白酶溶液，使每毫升硝酸溶液中的胃蛋白酶为23国际活性单位，置于无菌环境下不断摇晃混匀，在室温下浸泡10小时至溶液粘度为1000cp左右即过滤除渣得胶原蛋白溶液。
(2)取8ml乙二醇(分析纯)加入200毫升的上述胶原蛋白溶液中，充分混匀后倒入25×15×3cm不锈钢平底盘中自流成0.2mm的薄膜，多余的溶液吸出备用。
(3)将上述薄膜冷冻干燥即成具有粘性、弹性和多孔隙的纯天然胶原蛋白人工皮肤。冷冻干燥的温度控制流程为：先将上述自流成胶原蛋白薄膜的平底盘在-19℃冰箱中预冻11小时，然后迅速置于冷冻干燥机中抽真空升华21小时，同时电加热使冷冻仓的温度保持在20℃，去真空出冷冻仓。
(4)将冻干后的薄膜按8×4cm规格裁切后用医用级铝箔膜密封、包装后送辐照中心以16kGy剂量60Co辐照灭菌。
Claims (8)
1.一种胶原蛋白人工皮肤的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)制备胶原蛋白溶液：取哺乳动物的肌腱，去除油脂后，用灭菌溶液浸泡消毒灭菌，取出后漂洗干净，然后将肌腱浸泡于体积百分比为1～5％的酸溶液中，并加入胃蛋白酶溶液，使每毫升酸溶液中的胃蛋白酶为20～25国际活性单位，摇晃混匀，在室温下浸泡至溶液粘度为700～1000cp，过滤除渣得胶原蛋白溶液；
(2)在上述胶原蛋白溶液中按1～5％的体积比加入增塑剂，混合后倒入一平面上自流成0.1～0.5mm的薄膜；
(3)将上述薄膜冷冻干燥；
(4)将冻干后的薄膜以15～20kGy剂量60Co辐照灭菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述哺乳动物的肌腱为猪腿、牛腿、羊腿、狗腿、驴腿、骡腿、鹿腿、兔腿或马腿肌腱的一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述灭菌溶液为新洁尔灭、乙醇、戊二醛、84消毒液、过氧乙酸中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于制备胶原蛋白溶液均在无菌条件下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述酸溶液为乙酸、磷酸、硫酸、硝酸或盐酸溶液的一种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的增塑剂为乙二醇，丙三醇，季戊四醇，新戊二醇，木糖醇，山梨醇、聚乙二醇中的一种。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于冷冻干燥的具体过程为：先将上述薄膜在-15℃至-25℃条件下预冻6小时以上，然后置于冷冻干燥机中，在冷冻仓的温度保持在15～32℃下抽真空升华18～24小时，然后去真空出冷冻仓。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述预冻是抽真空干燥前将薄膜放置在冰箱中预冻。
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